全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$国家自然科学基金"
%#!&"%%1
#&陕西省自然科学基金"
!"#)23%#"$
!
"#)23%##!
#&陕西学前师范学院科研基金"
#)3452"&1
!
!"#)67"#"
#
作者简介$孔维维"
#00"
#!女!在读硕士研究生!主要从事植物生物技术研究
8(9:-;
$
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>
?@-?@-010*
!
#!*+A=9
"
通信作者$王?之!博士!教授!主要从事药用植物次生代谢研究
8(9:-;
$
BB?:/
>!
.//C+@DC+A/
丹参
0123$
和
0123%
基因克隆及胁迫表达研究
孔维维#!化文平#!!王?之#"
"
#
药用资源与天然药物化学教育部重点实验室!西北濒危药材资源开发国家工程实验室!陕西师范大学 生命科学学院!西安
&#""*!
&
!
陕西学前师范学院 生物科学与技术系!西安
&#"#""
#
摘
!
要$该研究从药用植物丹参中克隆了
!"#$#
和
!"#$!
蛋白酶抑制剂基因!采用生物信息学和实时荧光定量
EFG
方法对其序列及表达模式进行了分析序列分析结果表明!丹参
!"#$#
和
!"#$!
基因分别含有一个长度为
!!!H
I
和
!#*H
I
的开放阅读框!编码
&%
和
&#
个氨基酸&
!
个编码蛋白都无跨膜结构域和信号肽!预测都定位于细
胞质中&
79EJ#
和
79EJ!
蛋白与川桑(可可(苜蓿等植物的蛋白酶抑制剂基因相似性较高!分别为
$1K
(
$!K
(
$%K
和
$)K
(
$*K
(
$#K
实时荧光定量
EFG
结果表明!
"#$#
和
!"#$!
基因受茉莉酸甲酯"
L@2M
#和甘蓝黑腐病黄
单胞菌"
%&()*"*&+,&"
-
.+(/0+
I
N+1&"
-
.+(/0+
!
OF
#显著诱导!说明丹参
!"#$#
和
!"#$!
基因可强烈响应这两
类胁迫!可能参与丹参中两类胁迫分子途径相关的抗性反应
关键词$丹参&蛋白酶抑制剂&序列分析&表达模式
中图分类号$
3&1$
&
3&1*
文献标志码$
M
&"()*(!+,
-
.)//#"("00123$*(!0123%
0."10$*4-$1-*#-&((5-6$2(!).34.)//
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W
!
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-(
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>
X:H=Y:Z=Y
W
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I
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O-
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I
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O-
)
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FV-/:
#
56/4.*74
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Y=C
I
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I
Y=Z@-/.:..=A-:Z@D?-ZVZV@Y@.-.Z:/A@=[
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I
Y=Z@:.@-/V-H-Z=Y
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"
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#
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!
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W
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C@/A@AV:Y:AZ@Y-B:Z-=/.C.-/
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Y@..-=/
I
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W
Y@:;(Z-9@
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I
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W
+79EJ#:/D79EJ!9:
W
H@;=A:Z@D-/A
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I
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VV=9=;=
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I
Y=Z@-/:.@-/V-H-Z=Y.[Y=95*/6+*(&7020+
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*(/6,&(62&+3C:/Z-Z:Z-N@EFG:/:;
W
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Y@..-=/=[!"#$#:/D!"#$!
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W
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L@2M
#
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I
N+1&"
-
.+(/0+
"
OF
#
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I
Y=Z@:.@-/V-H-Z=Y
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I
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ZV-.Z?=.ZY@...-
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!
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W
H@A;=.@;
W
Y@;:Z@DZ=ZV@Y@.-.Z:/A@=[!;"02(0*//)04&+
8)
9
:".!/
$
!&230&"02(0*//)04&
&
I
Y=Z@-/:.@-/V-H-Z=Y
&
.@
]
C@/A@:/:;
W
.-.
&
@I
Y@..-=/
I
:ZZ@Y/
!!
蛋白酶抑制剂"
I
Y=Z@-/:.@-/V-H-Z=Y
!
EJ
#是一类
能够抑制蛋白水解酶活性的小分子蛋白质!在植物
体内广泛存在
EJ
能与蛋白酶的活性部位和变构
部位结合!抑制酶的催化活性或阻止酶原转化为有
活性的酶*#+!具有防止体内蛋白的不必要降解(调节
蛋白代谢及调节蛋白酶的生理活性的功能此外!
EJ
还可以抑制某些病原微生物及某些昆虫体内蛋
白酶!参与植物体的自然防御*!+目前对
EJ.
的研
究主要集中在植物抗性功能方面根据作用于酶的
活性基团的不同及其氨基酸序列的一致性!自然界
中蛋白酶抑制剂被分为
)
类$丝氨酸蛋白酶抑制剂(
半胱氨酸蛋白酶抑制剂(金属蛋白酶抑制剂和酸性
蛋白酶抑制剂*%+!其中丝氨酸蛋白酶抑制剂和巯基
蛋白酶抑制剂是在转基因中应用最广泛的两类
EJ
蛋白自
S-;D@Y
等*)+将豇豆蛋白酶抑制剂基因转
入烟草并获得抗虫转基因植株以来!蛋白酶抑制剂
因具有抗虫谱广(害虫不易产生抗体(对人畜无副作
用等优点!已成为除
Z`
杀虫晶体蛋白基因外被广泛
用于抗虫工程的第二大类抗性基因
丹参"
!&230&"02(0*//)04&
#为唇形科鼠尾草属
多年生草本植物!以干燥的根及根茎入药!具有活血
调经(祛瘀生新(镇静安神(凉血消痈(消肿止痛等功
效!临床上被用于治疗冠心病(心绞痛和月经不调等
症*$(&+随着丹参各种药理作用的广泛应用!其需求
量也逐渐增加但在其种植过程中!各种病虫害十
分普遍!可造成
#$K
"
)$K
的损失!病虫害成为了
影响丹参质量和产量的重要因素*1(0+
本研究克隆分析了丹参中的
!
个蛋白酶抑制剂
基因
!"#$#
和
!"#$!
!并对其在甘蓝黑腐病黄单
胞菌 "
%&()*"*&+,&"
-
.+(/0+
I
N+1&"
-
.+(/0+
!
OF
#和茉莉酸甲酯"
9@ZV
W
;
,
:.9=/:Z@
!
L@2M
#诱导
下转录水平变化进行了初步分析!为进一步研究丹
参的抗虫抗病机理打下基础
#
!
材料和方法
$+$
!
材
!
料
丹参"
!&230&"02(0*//)04& C`/
>
@
#种子采自陕
西天士力植物药业商洛有限公司商州药源基地!于
盛有蛭石(草木灰"蛭石
a
草木灰
b#a#
#的基质中
萌发!在人工气候箱内培养"宁波!
GOU($""6
#!光照
强度
#$"
#
9=;
,
9
!
,
.
#
!光周期为光照
#*V
%黑
暗
1V
!温度"
!$c!
#
d
!湿度
)1K
G4M
提取试剂盒购自
PL8QM
公司&
7e` G
QY@@/
$
EY@9-\<=8&
>
(
I
L6#0(^ N@AZ=Y
和反转
录试剂盒均购自
:^5:G:
生物公司&甘蓝黑腐病黄
单胞菌"
%&()*"*&+,&"
-
.+(/0+
I
N+1&"
-
.+(/0+
!
OF
#和大肠杆菌
6S$
%
均由本实验室保存
$+%
!
方
!
法
$+%+$
!
处理方法
!
培养
*"D
的丹参幼苗分别用
$
99=;
%
XL@2M
溶液和用生理盐水稀释至
P6
*""
b
"+!
的
OF
菌液进行喷洒处理具体处理方法见刘
梅等*#"+处理后的丹参幼苗继续放于光照培养箱
中培养!并于处理后
"
(
*
(
#!
(
!)
(
)1
和
&!V
分别取
样!液氮速冻!
1"d
保存备用
$;%;%
!
0123$
和
0123%
基因克隆
!
按照植物
G4M
提取试剂盒"
PL8QM
#使用说明书提取不同
处理条件下丹参样品总
G4M
!并用
#K
琼脂糖凝胶
电泳检测
G4M
完整性以总
G4M
为模板按照反
转录试剂盒
EY-9@7AY-
I
Z
&
G^ Y@:
>
@/Z5-Z
"
:^5:(
G:
#说明书反转录得到
A64M
第一链
A64M
样品
保存于
!"d
依据本实验室丹参转录组数据库中基因序列
"
Y.9.\;
-
""01)$+
W
#+.A[
!
Y.9.\;
-
"#!""!+
W
#+.A[
#采
用
EY@9@YEY@9-@Y$+"
软件在完整
PG_
框两端设
计引物
!
对"表
#
#!以丹参总
G4M
反转录合成的
A64M
为模板!进行
EFG
扩增
EFG
程序为
0$d
预变性
%9-/
&
0$d
变性
%".
!
$$d
退火
%".
!
&!d
延伸
%".
!
%"
个循环&
!d
延伸
#"9-/
扩增产物
经凝胶纯化后!连接至
I
L6#0(^ N@AZ=Y
"
:^5:G:
#
上并转入大肠杆菌
6S$
%
!而后将阳性克隆送北京
华大基因科技有限公司进行测序
$;%;<
!
31=>$
和
31=>%
蛋白生物信息学分析
!
利
用生物信息学数据库和在线软件对
79EJ#
和
79EJ!
蛋白的结构及理化性质进行分析使用
EY=ZE:Y:9 Z==;
"
VZZ
I
$%%
?@H+@I
:.
W
+=Y
>
%
I
Y=Z(
I
:Y:9
%#工具预测蛋白质分子量(等电点(稳定性
等利用在线工具
E7PG^ EY@D-AZ-=/
(
^LSLL(
!+"
(
7-
>
/:;E()+#
"
VZZ
I
$%%
I
.=YZ+V
>
A+
,I
%
[=Y9+VZ(
9;
%!
VZZ
I
$%%
???+AH.+DZC+D<
%
.@YN-A@.
%
^LSLL(
!+"
%!
VZZ
I
$%%
???+AH.+DZC+D<
%
.@YN-A@.
%
7-
>
(
/:;E
%#对
79EJ#
和
79EJ!
蛋白的亚细胞定位(跨膜
结构域及信号肽进行预测用在线工具
7PELM
"
VZZ
I
$%%
/
I
.:(
I
H-;+-HA
I
+[Y
%
A
>
-(H-/
%
/
I
.:
-
:CZ=9:Z+
I
;
.
I
:
>
@b/
I
.:
-
.=
I
9:+VZ9;
#和
7RJ77(LP68X
"
VZZ
I
$%%
.?-..9=D@;+@I
:.
W
+=Y
>
%#完成蛋白质二级
结构和三维结构的分析多序列比对通过
F;C.Z(
:;R
完成系统进化树使用
L8QM*+"
!以最大似
然法"
L:\-9C9X-<@;-V==D
!
LX
#!选用最适算法模
1!!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
表
$
!
实验所用引物
:^H;@#
!
V^@
I
Y-9@Y.C.@D[=Y.ZCD
W
基因
Q@/@
引物名称
EY-9@Y/:9@
引物序列
EY-9@Y.@
]
C@/A@
"
$f
#
%f
#
?@#AB
?@#AB(7 $f(FFMFFQ^ FFMF^ FFM^ FMF^ (%f
?@#AB(G $f(^ QQQMMF^ FQQMMFQMFM^ MF(%f
!"#$#
!"#$#(7 $f(FQQQM^ FFM^ Q^ FQ^ F^ QMMQM^ Q^FFFM(%f
!"#$#(G $f(FFFMMQF^ F^^ MMFFMMFQQ^ MQQMMFQF^ (%f
]
!"#$#(7 $f( Q^MMQM^ Q^FFFMQM^ Q^ Q^(%f
]
!"#$#(G $f(MMQM^ MQFFQQMQ^ FFM^ MF(%f
!"#$!
!"#$!(7 $f(FQQQM^ FFM^ QMQ^ QQ^ Q^^ FFMQQMM^MQQ(%f
!"#$!(G $f(FFFMMQF^ F^^ M^QMMQMFFM^ QQQMMFFF^ (%f
]
!"#$!(7 $f( Q^MQ^ QQ^ Q^^ FFMQQMM^ MQ(%f
]
!"#$!(G $f(FMQMQQM^ F^MFFMMMQMQ^ F^(%f
型
RMQgQ
构建
$;%;?
!
胁迫诱导下
0123$
和
0123%
表达变化
!
采用
EY@9@YEY@9-@Y$+"
软件!在已知基因序列内
部设计实时荧光定量
EFG
引物!引物序列见表
#
以适宜浓度样品
A64M
为模板进行实时荧光定量
EFG
反应!检测
L@2M
和
OF
诱导下
!"#$#
和
!"#$!
表达量变化采用丹参持家基因
?@#AB
作为内参基因实时荧光定量
EFG
反应程序为
0$
d
预变性
%9-/
&
0$d#".
!
*"d%".
!共
)"
个循
环实时荧光定量
EFG
结果采用比较
FZ
法的相对
定量*##+进行处理
!
!
结果与分析
%;$
!
0123$
和
0123%
基因克隆
依据丹参转录组数据库基因序列!采用
EY@9@Y
EY@9-@Y$+"
软件设计引物"
!"#$#(7
(
!"#$#(G
&
!"#$!(7
(
!"#$!(G
#!通过
EFG
扩增从丹参
A64M
中克隆得到了
!
个蛋白酶抑制剂基因"图
#
#!经测
序验证后分别命名为
!"#$#
和
!"#$!
"
Q@/`:/<
登录号分别为
8_#1&)$0+#
和
8_#1&)*"+#
#
%;%
!
0123$
和
0123%
的序列分析
利用
64M.Z:Y
软件对
!"#$#
和
!"#$!
全序
列进行分析!发现
!"#$#
和
!"#$!
分别含有一个
长度为
!!!H
I
和
!#*H
I
开放阅读框!分别编码
&%
和
&#
个氨基酸
4F`J
中
X`M7^
分析显示!
79EJ#
和
79EJ!
蛋白与川桑"
OE
-
"#""0)!&*+#
#(
可可"
OE
-
""&""011)+#
#(苜蓿"
OE
-
""%$0"&00+#
#
等植物的蛋白酶抑制剂蛋白相似性较高!分别为
$1K
(
$!K
(
$%K
和
$)K
(
$*K
(
$#K
丝氨酸蛋白酶抑制剂按照所含有结构域不同可
分为
=`?9:/(`-Y<
(
5C/-ZB
(马铃薯蛋白酶抑制剂
"
EJ(
#和马铃薯蛋白酶抑制剂
$
"
EJ(
$
#等家
族*#!+其中马铃薯蛋白酶抑制剂"
EJ(
和
EJ(
$
#
是一类创伤诱导型蛋白抑制剂
EJ(
家族成熟肽
分子量约为
1<6
!只有
#
个活性中心!主要抑制胰
凝乳蛋白酶
EJ(
$
家族成熟肽的分子量约为
#!
<6
!有
!
个活性中心!可以同时抑制胰蛋白酶和胰
凝乳蛋白酶*#%+用
7A:/EY=.-Z@
在线工具预测蛋白
结构域发现!丹参
79EJ#
和
79EJ!
蛋白
4
端存在
#
个马铃薯蛋白酶抑制剂
的特征性保守序列
*
_eR
+
(E(
*
83S
+
(
*
XJh
+"
!
#
(Q("
!
#
(
*
7^ MQh
+
("
!
#
(M
"图
!
#!说明丹参
79EJ#
和
79EJ!
蛋白属于
马铃薯蛋白酶抑制剂
家族成员用
F;C.Z:;R
对
丹参
79EJ#
和
79EJ!
与其他物种中的马铃薯蛋白
酶抑制剂
J
氨基酸序列进行多序列比对发现!马铃
薯蛋白酶抑制剂
J
家族的特征序列保守性很高
利用
7PELM
程序对
79EJ#
和
79EJ!
氨基酸
序列的二维结构进行预测发现!
79EJ#
和
79EJ!
蛋
白二级结构组成十分相似!分别包含
%
螺旋
!#+0!K
和
!#+#%K
!无规则卷曲
)#+#"K
和
%*+*!K
!伸展
链
!"+$$K
和
!*+&*K
!
(
转角
#*+))K
和
#$+)0K
用
7RJ77(LP68X
在线对丹参
79EJ#
和
79EJ!
蛋
白三维结构进行预测发现!
79EJ#
和
79EJ!
蛋白三
维结构与马铃薯蛋白酶抑制剂
家族其他成员如水
蛭蛋白酶抑制剂"
@
>
;-/A
#(大麦胰凝乳蛋白酶抑制剂
!
"
FJ!
#(南瓜丝氨酸蛋白酶抑制剂"
FL J^(h
#等相
似!都含有一个反应位点环"
Y@:AZ-N@(.-Z@;==
I
#!这
个环可以通过与蛋白酶的活性部位结合从而抑制蛋
白酶活性反应位点环通常由
0
"
#"
个氨基酸残基
组成!环中包含一个易断裂位点!即蛋白酶的活性位
点*#)(#&+"图
%
#比对活性中心发现!在各物种中蛋
白酶抑制剂的活性位点氨基酸变化较大丹参
79EJ#
和
79EJ!
的易断裂位点可能为丙氨酸"
M
$"
#
和精氨酸"
G
)&
#
图
#
!
丹参
!"#$#
和
!"#$!
基因克隆电泳结果
_-
>
+#
!
M
>
:Y=.@
>
@;@;@AZY=
I
V=Y@.-.=[EFG
I
Y=DCAZ.=[ZV@A;=/@D!"#$#:/D!"#$!
L+6X!"""
&
#+!"#$#
&
!;!"#$!
0!!
!
期
!!!!!!!!!!!!
孔维维!等$丹参
!"#$#
和
!"#$!
基因克隆及胁迫表达研究
!!
EY=ZE:Y:9Z==;
预测 结 果 显 示$
79EJ#
和
79EJ!
蛋白分子量分别为
&+*<6
和
&+1)<6
!为小
分子蛋白理论等电点分别为
%+0%
和
)+1$
!为酸
性蛋白不稳定系数"
-/.Z:H-;-Z
W
-/D@"
$
##分别
为
%)+&0
和
!*+$%
!属于稳定蛋白利用
E7PG^
EY@D-AZ-=/
对
79EJ#
和
79EJ!
蛋白进行亚细胞定
位预测!结果显示
79EJ#
和
79EJ!
蛋白都定位于
细胞质&用
^LSLL(!+"
(
7-
>
/:;E()+#
对蛋白质的
跨膜结构域和信号肽进行预测显示!
79EJ#
和
79EJ!
蛋白没有跨膜结构域!且无信号肽据此推
测!
79EJ#
和
79EJ!
蛋白可能是游离于细胞质中发
挥 作用从
LX
进化树"图
)
#明显看出!聚类结果
图
!
!
丹参
79EJ#
和
79EJ!
与其它马铃薯蛋白酶抑制剂
J
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和
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在植株受到机械损伤或昆虫伤害后都会在叶片
中大量积累*#1(#0+为了探究丹参蛋白酶抑制剂
79EJ#
和
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和病原菌
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马铃薯蛋白酶抑制剂
J
家族的大部分成员都来
自于植物!而且其众多成员普遍与植物的抗逆性相
关
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等*!"+研究表明!在棉花中共表达马铃薯
蛋白酶抑制剂
和
$
可以显著增强棉花对昆虫伤害
的抵抗力在番茄中!蛋白酶抑制剂
和
$
会在未
成熟的果实中大量积累!以抵御昆虫(鸟类等的伤
害&在果实成熟后迅速消失使果实可食用!从而促进
种子的传播*!#+在遭受机械损伤后!番茄蛋白酶抑
制剂
和
$
在叶片的积累也会显著增加*!!(!)+丹参
蛋白酶抑制剂
79EJ#
和
79EJ!
作为马铃薯蛋白酶
抑制剂
家族成员!可能同其他成员一样在植物抵
御损伤(病虫害等方面发挥作用
茉莉酸类是与植物抗性密切相关的内源信号分
子!参与损伤(病虫害(干旱和低温等条件下的多种
抗逆反应!也是环境胁迫中驱动植物防御基因表达
的重要信号分子*!$(!*+在创伤(昆虫或病菌攻击时!
植物体内内源茉莉酸类物质含量会急剧上升*!&(!1+
茉莉酸类物质含量的增加会促进一些与环境胁迫相
关物质的合成!并且诱导植物防御基因的表达*!0+
本研究发现茉莉酸甲酯和植物病原菌
OF
都可以迅
速诱导丹参蛋白酶抑制剂
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和
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的表
达!与番茄蛋白酶抑制剂
对损伤的响应相似*!)+!
说明丹参蛋白酶抑制剂
79EJ#
和
79EJ!
与丹参的
抗性密切相关推测病原菌
OF
伤害可能是通过信
号分子
L@2M
的传导来最终诱导蛋白酶抑制剂基因
的表达本研究为进一步研究丹参蛋白酶抑制剂的
抗虫抗病机理奠定了基础!为生产中增强丹参以及
其他农作物的抗逆性!培育优良品系!增加产量有重
要的指导意义
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