全 文 ：书西北植物学报!
"#$
!
%$
"
&
#$
#%###%#&
!"#$%&#%&()$*+,""-.)/#0-/
!!
文章编号$
#"""($"!)
"
!"#$
#
"&(#%##("&
!!!!!!!!!!!!!!!
!"#
$
#"*&+"+
%
,
*-../*#"""($"!)*!"#$*"&*#%##
收稿日期$
!"#$("%(##
&修改稿收到日期$
!"#$(")("0
基金项目$国家自然科学基金"
0#!+"+"0
#&云南省教育厅科学研究基金重点项目"
!"#%1"&)
#&科技部十二五(国家科技支撑计划
"
!"##234#%2"!("$
#
作者简介$张晓东"
#50"
#!男!博士!讲师!主要从事植物代谢基因工程方面的研究)
6(78-9
$
:;<5)
!
#!+*=>7
"
通信作者$王元忠!硕士!助理研究员!主要从事药用植物资源评价与利用的研究)
6(78-9
$
?>9@AB.
!
#!+*=>7
滇龙胆
1(020$
基因的克隆与原核表达
张晓东#!李彩霞#!王连春#!李
!
涛#!王元忠!"
"
#
玉溪师范学院 资源环境学院!云南玉溪
+)%#""
&
!
云南省农业科学院 药用植物研究所!昆明
+)"!!%
#
摘
!
要$以滇龙胆转录组为基础!采用
CD(EFC
技术克隆了滇龙胆幼叶裂环番木鳖苷合酶基因!命名为
!"#$##
"
G@/28/H
登录号
IJ5$##5#
#)序列分析结果显示!
!"#$##
基因开放阅读框长
#)+"?
K
!编码
)#5
个氨基酸&
GLMNM#
蛋白相对分子量为
)5*%%HO
!
K
4
为
0*5+
)生物信息学分析结果表明!
GLMNM#
蛋白属于
MNM
家族成员!其
P
端含有一跨膜螺旋区域"
#"
"
%!
#&二级结构分析结果表明!
GLMNM#
蛋白主要由
#
(
螺旋和无规则卷曲组成&系统
发育分析表明!
GLMNM#
与帽柱木
Q.MNM!
蛋白亲缘关系最近)构建原核表达载体
K
G6R($D(GLMNM#
!对
!"#$##
基因进行原核表达!
MOM(E3G6
结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致)该研究为进一步研究
!"#$##
基因功
能及通过在龙胆中过表达该基因提高龙胆苦苷含量奠定基础)
关键词$滇龙胆&
!"#$##
基因&基因克隆&序列分析&原核表达
中图分类号$
S&0)
&
S&0+
文献标志码$
3
%&"#
(
)!*+",)+
-
".#/01
2
+344#""51(020$
633#1)/#-$/$(-
3
)4")/4
1T3PGR-8><>/
U
#
!
N4F8-;-8
#
!
V3PGN-8/=WB/
#
!
N4D8>
#
!
V3PGXB8/:W>/
U
!
"
"
#F>9@
U
@>YC@.>BL=@.8/<6/Z-L>/7@/A
!
XB;-P>L789[/-Z@L.-A
!
XB;-
!
XB//8/+)%#""
!
FW-/8
&
!4/.A-ABA@>YQ@<-=-/89E98/A.
!
XB//8/3=8<@7
>Y3
U
L-=B9ABL89M=-@/=@.
!
IB/7-/
U
+)"!!%
!
FW-/8
#
784.+)/.
$
28.@<>/AW@AL8/.=L-
K
A>7@>Y!%&()&)"(
*
%+,%&+
!
8
U
@/@<@.-
U
/8A@<8.!"#$##
"
G@/28/HP]*
IJ5$##5#
#
@/=><-/
U
.@=>9>
U
8/-/.
/AW8.@ 8^.=9>/@7
>B/
U
9@8Z@.>Y!-"(
*
%+,%&+?
CD(EFCA@=W(
/>9>
U*DW@.@
_
B@/=@8/89
.-.L@.B9A..W>^ @
K
@/L@8<-/
U
YL87@>Y!"#$##
U
@/@W8.89@/
U
AW>Y#
)+"?
K
=><-/
U
Y>L)#587-/>8=-<.
!
8/9@=B98L @^-
U
WA>YGLMNM#
K
L>A@-/-.)5*%%HO -^AW-A.
K
4>Y0*5+*2->-/Y>L78A-=.8/89
.-.-/<-=8A@K
L>A@-/?@9>/
U
.A>AW@7@7?@L>YMNMY87-9
!
8/<
-AW8.8AL8/.7@7?L8/@W@9-;
"
#"
*
%!
#
-/AW@PA@L7-/89*C@.B9A.>Y.@=>/<8L
.ALB=ABL@8/89
.-..B
UU
@.A@<
AW8AGLMNM#
K
L>A@-/=>7
K
>.@.>Y78-/9
\#
(W@9-;8/<-LL@
U
B98L=>-9.*C@.B9A.>Y
K
W
9>
U
@/-=8/89
.-..W>^ @<
AW8AGLMNM#
K
L>A@-/-.=9>.@A>Q.MNM!>Y.(")
*/
&)+
0
%,(1+)*DW@
K
L>H8L
>A-=@;
K
L@..->/>Y!"#$##
U
@/@ 8^.<>/@8YA@L=>/.ALB=A->/>Y-A.
K
L>H8L
>A-=@;
K
L@..->/Z@=A>L
K
G6R($D(GLMNM#
!
8/E3G6L@.B9A.<-.
K
98
@K
L@..@<
K
L>A@-/ 8^.=>/.-.A@/A -^AWAW@8/A-=-
K
8A@<.-:@*DW-..AB<
-^9
98
8Y>B/<8A->/Y>LYBLAW@LYB/=A->/89L@.@8L=W>Y!"#$##
U
@/@8/K
L>Z@7@/A>Y
U
@/A->
K
-=L>.-<@
=>/A@/AZ-8>Z@L@;
K
L@..->/>YAW-.
U
@/@-/
U
@/A-8/*
93
-
:"+!4
$
!%&()&)"(
*
%+,%&+
&
!"#$##
"
.@=>9>
U
8/-/.
/AW8.@
#
U
@/@
&
U
@/@=9>/-/
U
&
.@
_
B@/=@8/89
.-.
&
K
L>(
H8L
>A-=@;
K
L@..->/
!!
龙胆苦苷是滇龙胆"
!%&()&)"(
*
%+,%&+
#+龙胆
"
!%&()&)+,)2")
#+三花龙胆"
!%&()&)"(
3
41")
#和
条叶龙胆"
!%&()&)5)&+67"(,)
#等龙胆科药用植
物的主要有效成分,#-)在龙胆苦苷生物合成途径
中!裂环番木鳖苷是重要的中间产物,!(%-)在长春花
"
8)6)")&67+"1+%7+
#中!裂环番木鳖苷合酶,
.@=(
>9>
U
8/-/.
/AW8.@
"
MNM
#!
6F#*%*%*5
-能够催化番
木鳖苷"
9>
U
8/-/
#氧化环断裂生成裂环番木鳖苷
"
.@=>9>
U
8/-/
#
,
$(+
-
!该反应需要
P3OET
和分子氧!
而二氧化碳和许多细胞色素
E$)"
抑制剂能够抑制
该反应,&-)目前!裂环番木鳖苷合酶基因
#$#
已从
长春花,0-+喜树,5-+金鸡纳树,$-+牡丹,#"-+萝芙木,$-+
橄榄,##-等许多植物中分离)研究表明
#$#
基因的
表达具有组织特异性!并受植物激素的影响)如在
铁皮石斛"
9%&:"12(751
33
(,(&)4%
#中存在
!
个
91#$#
基因!它们在叶中的表达量约是茎中的
!
倍,#!-&在喜树"
8)5
0
16%,)),75(&))
#幼叶+幼叶
柄+老叶+根和根皮等组织中!
8)#$#
基因在幼叶中
高表达,#%-&在通过
CP3-
抑制
#$#
基因表达的短
小蛇根草"
;
0
6(1""6(<)
0
75(4)
#的毛状根中!喜树
碱和其它相关生物碱的合成减少!且番木鳖苷的累
积与
;
0
#$#
基因表达呈负相关,#$-&在长春花愈伤
组织中!在
"*!7
U
%
N
的苄基腺嘌呤处理下!
8"#$#
基因表达量是对照的
$*+
倍,#)-)研究还表明!从番
木鳖苷到裂环番木鳖苷的转化可能是吲哚生物碱合
成的限速步骤,0-)在长春花中!
8"#$#
基因的表达
可促进裂环番木鳖苷的合成,#+-)在产生生物碱的
植物中!过表达裂环番木鳖苷合酶
#$#
基因可改善
番木鳖苷衍生生物碱的产量,0!#&-)
滇龙胆为传统中药材龙胆的主要植物来源之
一,#0-)近年来!在国内由于滇龙胆在临床+制药和
兽药等方面的需求量猛增!其野生药材采收量远远
超过了其自然更新能力!导致野生资源急剧下降并
出现短缺!现已被列为国家三级重点保护野生药
材,#5-)要从根本上解决滇龙胆的药用植物来源!必
须弄清龙胆苦苷生物合成途径及其调控机制)但
是!目前国内外对龙胆的研究主要集中在种子萌
发,!"(!#-+
OP3
条码,!!(!%-+转录因子功能,!$(!)-+育
种,!+-等方面!而对滇龙胆
!"#$##
基因克隆+表达
和功能分析方面尚未有报道)本研究根据滇龙胆转
录组中
!"#$##
基因序列!设计特异性引物!通过
CD(EFC
技术成功从滇龙胆幼叶中扩增到
!"#$##
基因!并进行序列分析和原核表达!以期为滇龙胆
GLMNM#
蛋白功能研究及通过在龙胆中过表达
!"#$##
基因提高龙胆苦苷含量的研究奠定基础)
#
!
材料和方法
$*$
!
材
!
料
滇龙胆"
!%&()&)"(
*
%+,%&+
#植株栽培于玉溪师
范学院分子生物学实验室)试验材料为滇龙胆无菌
苗幼叶)
$*;
!
方
!
法
$<;<$
!
叶片总
=>7
提取及
1(020$
基因
?=@
的
克隆
!
按照多糖植物组织提取试剂
CP3-.>
"
D8H8(
L8
#说明书提取滇龙胆幼叶总
CP3
&按照逆转录试
剂盒"
D8H8L8
#说明书合成
=OP3
)根据原核表达载
体
K
G6R($D(#
多克隆酶切位点和滇龙胆转录组中
!"#$##
基因序列!设计
#
对特异引物
!"#$###)4
$
(J
$
GDFG3F3DGG3G3DGG3333F3G3DD(
DDDG
"下划线为
#)4
$
酶切位点#!
"#$##=61
$
(
C
$
FDFG3GFD333DDDDGDGF33G3DF333(
DG3G
"下划线为
=61
$
酶切位点!引物由上海捷瑞
生物工程有限公司合成#)以
=OP3
为模板进行
EFC
扩增!反应体系为
>)
?
E9B.OP3E>9
7@L8.@
"
!*)[
%
%
N
!天根#
"*)
%
N
!
#"`>)
?
E9B.2BYY@L)
%
N
!
"
!*)77>9
%
N
!
D8H8L8
#
$
%
N
!模板
!
%
N
!
正反向引物"
#"
%
7>9
%
N
#各
#
%
N
!加
<!
]
补足
)"
%
N
)
EFC
反应条件为$
5$a
预变性
%7-/
&
5$a
变
性
%".
!
)!a
退火
%".
!
&!a
延伸
#*)7-/
!
%"
循
环&
!a
延伸
&7-/
)
EFC
产物经
#*"b
琼脂糖凝
胶电泳分离!然后割胶!使用胶回收试剂盒"百泰克#
对目的片段进行回收!将其连接到
K
QO#5(D
载体
"
D8H8L8
#)转化大肠杆菌后进行蓝白筛选!挑取白
斑摇菌&使用试剂盒提取质粒"百泰克#!经酶切检测
正确后 进行 测序 "上海生工#!获得重 组质粒
K
QO#5(GLMNM#
)
$<;<;
!
1(020$
基因原核表达载体构建
!
对质粒
K
G6R($D(#
和
K
QO#5(GLMNM#
分别进行
#)4
$
"
D8H8L8
#和
=61
$
"
D8H8L8
#双酶切!回收载体片段
和目的基因!按摩尔比
#c$
进行过夜连接!然后转
化大肠杆菌
OT)
#
感受态细胞"北京全氏金#!涂布
于添加
#""7
U
%
N
氨苄青霉素"
D8H8L8
#
d4EDG
"
D8H8L8
#
dR(
U
89
"
D8H8L8
#的
N2
固体平板!
#!W
后
挑取克隆&摇菌后!提取质粒!经酶切检测正确后!获
得原核表达载体
K
G6R($D(#(GLMNM#
"图
#
#)
$<;!
1(020$
基因生物信息学分析
!
使用
PF24
网站
2N3MD
程序"
WAA
K
$%%
^^ ^*/=?-*/97*/-W*
U
>Z
%
2N3MD
#进行序列比对分析!应用
G@/@A
;+*#*0
进
!#%#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
#
!
原核表达载体
K
G6R($D(#(GLMNM#
的构建策略
J-
U
*#
!
F>/.ALB=A->/.AL8A@
U>Y
K
L>H8L
>A-=@;
K
L@..->/Z@=A>L
K
G6R($D(#(GLMNM#
行翻译!并预测蛋白质相对分子质量和等电点等!使
用
OP3Q3P&
进行多序列比对&使用
F9B.A89R
!*#
进行比对!然后使用
Q6G3+*"
软件内置的
Pe
法构建系统进化树!设置
2>>A.AL8
K
f#"""
&利用在
线数据库"
WAA
K
$%%
7>9?->9*@%
@/
U
%
.=L-
K
A.
%
"#
.
##*WA79
#进行稀有密码子分析)使用
FW9>L>E
服务
器
Z#*#
"
WAA
K
$%%
^^ ^*=?.*%
.@LZ-=@.
%
FW9>(
L>E
#对叶绿体转运肽进行预测)使用
4/A@L
K
L>
软件
"
WAA
K
$%%
^^ ^*@?-*8=*BH
%
-/A@L
K
L>
%
.=8/*WA79
#进
行保守结构域预测)使用
EL@<-=AEL>A@-/
"
WAA
K
.
$%%
^^ ^*
K
L@<-=A
K
L>A@-/*>L
U
#对二级结构预测!使用
MV4MM(Q]O6N
服务器 "
WAA
K
$%%
.^-..7><@9*@;(
K
8.
*>L
U
%
>^LH.
K
8=@
#对三级结构预测)利用
6;(
K
8.
中的
DQTQQ
工具"
WAA
K
$%%
^^ ^*=?.*%
.@LZ-=@.
%
DQTQQ(!*"
#预测
GLMNM#
蛋白的跨
膜螺旋区)采用在线工具进行跨膜螺旋轮的投射分
析 "
WAA
K
$%%
=A-*-A=*Z-L
U
-/-8*@%
"
=7
U
%
O@7>
%
W^@@9
%
W^@@93
KK
#)
$<;!
1(020$
基因的原核表达
!
使用热激法将
重组 质 粒
K
G6R($D(#(GLMNM#
转 化 大 肠 杆 菌
C>.@AA8
"
O6%
#感受态细胞"北京全氏金#!挑取单菌
落接种于
%7N
含
#""7
U
%
N
氨苄青霉素的
N2
液
体培养基中!
%&a
+
!)"L
%
7-/
培养
#!W
)然后以
#c#""
比例接种到无抗生素的
N2
液体培养基中!
%&a
+
!)"L
%
7-/
培养
%W
"
]O
+""
#
"*0
#!在
%&a
+
终浓度为
#77>9
%
N4EDG
诱导下进行表达!同时以
相同条件的
K
G6R($D(#
转化菌做对照&分别诱导
"
+
!
+
$
和
+W
后!收集菌液
!7N
)
$ a
+
#""""
L
%
7-/
离 心
# 7-/
集 菌!弃 上 清!加 入
#""
%
N
<!
]
+
!)
%
N
的
)` MOM(E3G6
上样缓冲液!震荡
悬菌!沸水煮
)7-/
)
$ a
+
#%"""L
%
7-/
离心
)
7-/
)取
!"
%
N
上清上样!进行
MOM(E3G6
"
)b
浓
缩胶和
#"b
分离胶#电泳检测)
!
!
结果与分析
;<$
!
滇龙胆
1(020$
基因
?=@
序列的克隆
以滇龙胆幼叶
=OP3
为模板!使用特异性引物
扩增出
#)""?
K
左右的片段"图
!
#)通过
D3
克隆
获得重组质粒
K
QO#5(GLMNM#
!酶切检测结果表明
双酶切获得的两片段大小之和等于单酶切片段大
小!是预期的结果)
;<;
!
1(020$
基因的生物信息学分析
利用
G@/@A
;
软件对
!"#$##
基因序列进行分
图
!
!
!"#$##
基因的
EFC
扩增
Q*OP378LH@L
&
&
#*EFC
扩增结果
J-
U
*!
!
EFC87
K
9-Y-=8A->/>Y!"#$##
U
@/@
Q*OP378LH@L
&
&
#*EFCL@.B9A>Y!"#$##
U
@/@
%#%#
&
期
!!!!!!!!!!!!!
张晓东!等$滇龙胆
!"#$##
基因的克隆与原核表达
析!结果显示
!"#$##
基因的
]CJ
为
#)+"?
K
!编码
)#5
个氨基酸!将该序列上传至
G@/28/H
数据库!获
得登录号
IJ5$##5#
&
G@/A
;
软件推测
GLMNM#
蛋白
相对分子量为
)5*%%HO
!
K
4
值为
0*5+
)
利用
G@/28/H
数据库中的
2N3MD
K
程序对
GLMNM#
的氨基酸进行相似性分析!结果表明滇龙
胆
GLMNM#
与帽柱木
Q.MNM!
蛋白序列相似性最高
"
+&*#"b
#!与水稻
].MNM
"
$0*"&b
#和菜豆
EZMNM
"
)!*!5b
#蛋白序列相似性较低)利用
Q@
U
8+*"
将
GLMNM#
氨基酸序列与从
PF24
中挑选的相似性
较高的部分已知序列进行系统发育分析!结果表明
滇龙胆
GLMNM#
与帽柱木
Q.MNM!
亲缘关系较近!
与水稻
].MNM
和菜豆
EZMNM
亲缘关系较远"图
%
#)
利用
OP3Q3P
将
GLMNM#
氨基酸序列与从
PF24
中挑选的相似性较高的部分已知序列进行多序列比
对分析!结果表明
GLMNM#
蛋白与已知蛋白序列保
守性较高"图
$
#)
使用
6;E3M
EL>AE8L87A>>9
对
GLMNM#
蛋白
图
%
!
GLMNM#
蛋白与其它
MNM
蛋白的系统发育分析
数值代表从
#"""
次重复计算得到的
2>>A.AL8
K
百分比值
J-
U
*%
!
EW
9>
U
@/A-=AL@@>YGLMNM#8/<
.>7@>AW@LMNM
K
L>A@-/.
PB7?@L.L@
K
L@.@/AAW@2>>A.AL8
KK
@L=@/A8
U
@
Z89B@.=89=B98A@7#"""L@
K
9-=8A@.
图
$
!
GLMNM#
氨基酸序列与其它植物
MNM
保守区的多序列比对结果
J-
U
*$
!
QB9A-
K
9@.@
_
B@/=@89-
U
/7@/A>YGLMNM#
K
L>A@-/8/<>AW@L
K
98/AMNM.-/=>/.@LZ@U
->/.
$#%#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
进行分析!结果表明
GLMNM#
蛋白分子量为
)5*%%
HO
!理论等电点值为
0*&5
!化学方程式为$
F
!&!"
T
$!))
P
&"%
]
&$#
M
!#
)不稳定指数为
%)*$+
!属于稳定蛋白&
脂肪指数为
5+*%+
!总平均疏水性"
GC3gX
#为
"*##)
)蛋白疏水性通常依据其
GC3gX
值来预
测!
GC3gX
值在
!
到
!
之间!若为正值!则该蛋
白为疏水蛋白!反之则为亲水性蛋白)因 此!
GLMNM#
为亲水蛋白)
GLMNM#
蛋白含有
!"
种氨基
酸!其中亮氨酸含量最高!为
##*0b
&其次是赖氨酸
和谷氨酸!分别为
&*5b
和
&*)b
&半胱氨酸含量最
低!为
"*0b
)
利用
MM
K
L>
方法对
GLMNM#
蛋白进行二级结构
分析!结果表明该蛋白二级结构中
#
(
螺旋"
T
#占
)%*#0b
!

(
折叠"
6
#占
&*)#b
!无规则卷曲"
F
#占
%5*%#b
)利 用
M^ -..(Q><@9 V>LH.
K
8=@
预 测
GLMNM#
蛋白的三级结构!从图中可以看到
GLMNM#
的三级结构主要由
#
(
螺旋结构和无规则卷曲组成!
与二级结构预测结果一致"图
)
#)采用
PF24
在线
工具预测
GLMNM#
蛋白保守结构域!结果表明
GLMNM#
蛋白具有
#
个保守结构域!为
E$)"
超家族
结构域)利用
6;E3M
M-
U
/89E$*"M@LZ@L
分析
GLMNM#
蛋白!未发现信号肽!表明该蛋白为非分泌
型蛋白)利用
DQTQQ
工具预测
GLMNM#
蛋白的
跨膜螺旋区!结果表明
GLMNM#
蛋白为膜蛋白!其第
#
"
5
氨基酸位于膜内!其跨膜螺旋位于第
#"
"
%!
氨基酸位置!包含酸性氨基酸残基
G9B
!其余的部分
位于膜外"图
+
#)使用
FW9>L>E
在线软件对叶绿体
转运肽进行预测!结果表明
GLMNM#
蛋白不含叶绿
体转运肽)
对
!"#$##
基因进行稀有密码子分析!结果表
明
!"#$##
基因中稀有密码子仅占
"*)0b
!且无二
联或三联稀有密码子连续出现的情况!因此可选用
表达菌
2N!#
或
C>.@AA8
"
O6%
#进行原核表达)
;!
1(020$
基因原核表达载体的构建
使用
#)4
$
和
=61
$
双酶切质粒
K
G6R($D(#(
GLMNM#
!可切出目的片段"图
&
#!表明
!"#$##
基
因已成功插入载体
K
G6R($D(#
中)然后!对重组表
达质粒
K
G6R($D(#(GLMNM#
进行测序)结果表明!
目的基因与原序列一致!且未出现碱基突变及移码
现象)这些结果表明已获得正确的重组质粒
K
G6R($D(#(GLMNM#
)
;!
6+CDC$
蛋白的原核表达
将重组质粒
K
G6R($D(#(GLMNM#
转化大肠杆
菌
C>.@AA8
"
O6%
#后!进行
4EDG
诱导表达)在
%&
a
+终浓度为
#77>9
%
N4EDG
下!分别诱导表达
"
+
!
+
$
和
+W
后!提取细菌总蛋白进行
MOM(E3G6
分
析)结果表明!与对照相比!
K
G6R($D(#(GLMNM#
转
化菌经
4EDG
诱导后!在相对分子质量
0)*%%HO
"含
GMD
蛋白#左右有
#
条蛋白条带!并且随诱导时
图
)
!
GLMNM#
蛋白的三维结构预测
J-
U
*)
!
EL@<-=A@/89
.ALB=ABL@>YGLMNM#
K
L>A@-/
图
+
!
GLMNM#
蛋白
P
末端一个可能的跨膜螺旋的检测
3*GLMNM#
蛋白氨基酸残基在跨膜螺旋中的可能性&
2*
可能的跨膜螺旋序列以斜体表示&
F*
轴线剖视图
表示的预测螺旋轮的投射
J-
U
*+
!
O@A@=A->/>Y8
K
BA8A-Z@AL8/.7@7?L8/@W@9-;
8AAW@P(A@L7-/89@/<>YGLMNM#
K
L>A@-/
3*EL>?8?-9-A
Y>LL@.-?@-/.-<@8AL8/.7@7?L8/@
W@9-;
&
2*DW@.@
_
B@/=@>YAW@
K
BA8A-Z@AL8/.7@7?L8/@W@9-;
-..W>^ /-/-A89-=.
&
F*EL>
,
@=A->/>YAW@
K
L@<-=A@W^@@9L@
K
L@.@/A@<8.8=L>..(.@=A->/89Z-@^ >YAW@8;-.
)#%#
&
期
!!!!!!!!!!!!!
张晓东!等$滇龙胆
!"#$##
基因的克隆与原核表达
图
&
!
质粒
K
G6R($D(#(GLMNM#
酶切检测
Q*OP378LH@L
&
&
#
+
!*
质粒
K
G6R($D(#(GLMNM#
的
#)4
$
和
=61
$
双酶切+
=61
$
单酶切结果&
%*
质粒对照
J-
U
*&
!
O-
U
@.A->/>Y
K
G6R($D(#(GLMNM#
K
98.7-<
Q*OP378LH@L
&
&
#
!
*DW@<-
U
@.A->/L@.B9A.>Y
K
98.7-<
K
G6R($D(#(GLMNM#?
#)4
$
8/<=61
$
!
=61
$
&
%*E98.7-<=>/AL>9
图
0
!
%&a
下不同诱导时间对
GLMNM#
蛋白表达量的影响
Q*
蛋白
EL>A@-/CB9@L
(
&
#
"
!*%&a
+
4EDG
终浓度为
#77>9
%
N
下
K
G6R($D(#
空载体转化子分别诱导
"
和
+W
的总蛋白&
%
"
+*
相同条件下融合表达菌分别诱导
"
+
!
+
$
和
+W
的总蛋白
J-
U
*0
!
6YY@=A>Y<-YY@L@/AA-7@.>/AW@
@;
K
L@..->/>YGLMNM#
K
L>A@-/8A%&a
Q*EL>A@-/CB9@L
(
&
#
"
!*DW@@;
K
L@..@<
K
L>Y
K
G6R($D(#AL8/.Y>L7@9
%
N>Y4EDG
-//Y>L"8/<+W8A%&a
&
%
"
+*DW@@;
K
L@..@<
K
L>>Y
K
G6R($D(#(GLMNM#AL8/.Y>L7@9
%
N
>Y4EDG-//Y>L"
!!
$8/<+W
!
L@.
K
@=A-Z@9
8A%&a
间增加其蛋白含量逐渐增加!表明重组质粒
K
G6R(
$D(#(GLMNM#
在大肠杆菌
C>.@AA8
"
O6%
#中成功诱
导表达了
GLMNM#
蛋白)当温度为
%&a
+诱导时间
为
+W
时!蛋白表达量最大"图
0
#!可直接用于下一
步的蛋白纯化)
%
!
讨
!
论
MNM
是裂环烯醚萜类生物合成途径中的关键
酶!能够催化番木鳖苷生成裂环番木鳖苷)在长春
花悬浮培养细胞中!
MNM
催化的该反应发生在液泡
中,!&-)研究还表明裂环番木鳖苷合酶
MNM
是一个
内膜相关蛋白,&-!属于
=
A>=WL>7@E$)"
家族成员
"
FXE&!3#
#
,
+
-
)本研究从滇龙胆幼叶中克隆到裂
环番木鳖苷合酶编码基因
!"#$##
!其编码蛋白与
其它植物中
MNM
具有较高的相似性!表明其确为
#$#
基因)其编码蛋白属于
FXE&!3#
家族成员!
证据主要来自以下两方面$一是
GLMNM#
在
%!5(%%$
位包含参与氧结合和激活的
4(
螺旋基序,
3
%
G
-
G;
,
O
%
6
-
D
,
D
%
M
-
,
0
-
&二是
GLMNM#
蛋白在其
P
端包含
一跨膜螺旋区!但该膜锚定位点缺乏富含脯氨酸的
基序,
E
%
4
-
E;
,
E
%
G
-
;E
!而该基序对于微体
E$)"
的
结构极其重要!这可能是定位于液泡膜的
E$)"
蛋
白的特征,0-)免疫组化分析和杂交试验结果表明!
MNM
蛋白在发育的叶中定位于表皮细胞,0-)
本研究从滇龙胆中克隆了裂环番木鳖苷合酶基
因)基因克隆的方法有许多种!对于基因组已测序
的物种!可直接从数据库调取!然后设计引物进行克
隆&对于亲缘关系较近的物种间!可采用同源克隆的
方法&对于基因组未测序的物种!可采用文库构建和
筛选的方法等)但是文库构建和筛选程序复杂+工
作量大!且价格不菲&更重要的是!某些情况下低丰
度基因并不包含在文库克隆中!导致筛选失败)滇
龙胆的基因组尚未测序!无法直接获取龙胆苦苷生
物合成途径相关基因)由于高通量测序技术的快速
发展!基于序列的
CP3
测序和数字基因表达技术
为药用植物代谢途径的研究提供了新的方法,!0-)
本研究通过转录组测序方法!直接获得了
!"#$##
基因序列!通过
EFC
扩增与测序分析!验证了转录
组测序的有效性)因此!对于药用植物利用转录组
测序技术来获取有益的基因是首选手段)
真核生物基因的原核表达受表达载体+宿主菌+
温度+
4EDG
浓度+诱导时间等因素的影响,!5-)本研
究采用
K
G6R($D(#
载体进行表达!该载体能够在目
的蛋白
P
端添加谷胱甘肽
M
转移酶"
GMD
#标签!一
方面有助于增加目的蛋白的可溶性!另一方面有利
于目的蛋白的快速纯化)一般
%&a
和
#77>9
%
N
终
浓度的
4EDG
适合大多数蛋白的表达)本研究采用
该条件进行原核表达!结果所表达蛋白相对分子质
量与预期的一致)不同诱导时间对目的蛋白的表达
量也有影响!本研究中!随着诱导时间增加!目的蛋
白表达量逐渐增加!在诱导表达
+W
时!目的蛋白的
表达量已能满足下一步的蛋白纯化需求)
本研究从滇龙胆幼叶中克隆了
!"#$##
基因!
进行了相关的生物信息学分析&构建了原核表达载
体!并成功诱导表达出蛋白!为下一步
GLMNM#
蛋白
的纯化+酶活分析及通过过表达
!"#$##
基因提高
植物萜类含量研究奠定了基础!也为萜类代谢工程
提供候选基因)
+#%#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
参考文献!
,
#
-
!
吴贻谷!宋立人
*
中华本草,
Q
-
*
上海$上海科学技术出版社!
#550
!
#&
$
!$"*
,
!
-
!
4P][X6T*2->.
/AW@.-.>Y-L-<>-<8/<.@=>-L-<>-<
U
9B=>.-<@.*EW8L78=>
U
/>.
8/<
K
W
A>=W@7-.AL
,
Q
-
*P@^ X>LH
$
M
K
L-/
U
@L
!
#5&#
$
!5"%#%*
,
%
-
!
e6PM6PMC
!
MFTC4EM6Q3e*G@/A-8/8=@8@(.
.A@78A-=.8/L
,
Q
-
*F87?L-<
U
@
$
F87?L-<
U
@[/-Z@L.-A
EL@..
!
""!
$
)&%*
,
$
-
!
M3N4Qg
!
X[J
!
3ND3C6e]Me
!
%)4*g-LB.(-/U
@/@.-9@/=-/
U
-<@/A-Y-@.8)6)")&67+"1+%7+&(<@>;
9>
U
8/-=8=-<(&(W
;
98.@
!
8
.A@
K
-/-L-<>-<8/<7>/>A@L
K
@/@-/<>9@89H89>-.
/AW@.-.
,
e
-
*@4)&A17"&)4
!
"#%
!
EF
"
)
#$
&)$&+)*
,
)
-
!
3M3O3I
!
M3N4Qg
!
Q3M3O3(3DM[Q4M
!
%)4*3&(<@>;
9>
U
8/@A-=8=-<
U
9B=>.
9AL8/.Y@L8.@=>/AL-?BA@.8H@
.A@
K
-/.@=>9>
U
8/-/?->(
.
/AW@.-.-/78<8
U
8.=8L
K
@L-^-/H9@
,
e
-
*@4)&8%44
!
"#%
!
;G
"
#"
#$
#!%$#%$*
,
+
-
!
1T3]Xe
!
FT6PGSS
!
M[E
!
%)4*C@.@8L=W
K
L>
U
L@..L@98A-/
U
A>AW@L>9@>Y=
A>=WL>7@E$)"-/AW@?->.
/AW@.-.>YA@L
K
@/>-<.-/7@(
<-=-/89
K
98/A.
,
e
-
*B
00
4(%:.(,"12(141
*/
)&:C(1%,6&141
*/
!
"#$
!
HI
"
+
#$
!%&#!%0%*
,
&
-
!
X3Q3Q]D]T
!
I3D3P]P
!
]]43
!
%)4*M@=>9>
U
8/-/.
/AW8.@ W^-=W=8A89
:@.AW@>;-<8A-Z@=9@8Z8
U
@>Y9>
U
8/-/-/A>.@=>9>
U
8/-/-.8
=
A>=WL>7@E$)"
,
e
-
*@6
/
1,6%5(+"
/
!
"""
!
GA
"
#
#$
&#!*
,
0
-
!
4CQN6CM
!
MFTC]O6CG
!
MD(E46CC62
!
%)4*4/<>9@89H89>-.
/AW@.-.-/8)6)")&67+"1+%7+
$
/@^ @/:
7@8=A-Z-A-@.8/<-<@/A-Y-=8(
A->/>Y=
A>=WL>7@E$)"FXE&!3#8..@=>9>
U
8/-/.
/AW8.@
,
e
-
*@4)&A17"&)4
!
"""
!
;B
"
+
#$
&5&0"$*
,
5
-
!
MT6PMTT
"沈少华#!
N4[eX
"刘姬艳#!
T[eS
"胡江琴#!
%)4*3/?->.
/AW@A-=
K
8AW^ 8
.>Y=87
K
A>AW@=-/8/.
/AW8.@
,
e
-
*>"):((1&)4)&:D%"2)49"7
*
+
"中草药#!
"##
!
B;
"
5
#$
#0+!#0+0
"
-/FW-/@.@
#
*
,
#"
-
!
1T3PGF
!
V3PGXe
!
J[eR
!
%)4*DL8/.=L-
K
A>7-=8/89
.-.>Y=BAAL@@
K
@>/
-^AW
U
9B=>.@.B
KK
9
B.-/
U
AW@CP3(M@
_
A@=W/-
_
B@
,
e
-
*
@4)&8%44E%
0
1"+
!
"#$
!
AA
"
#
#$
####!5*
,
##
-
!
3N3GP3J
!
Q3C4]DD4C
!
E3P3C3J
!
%)4*]9-Z@
K
W@/>9-==>7
K
>B/<.
$
7@A8?>9-=8/K
A->/89
K
L>Y-9-/
U
U
YLB-A<@Z@9>
K
(
7@/A
,
e
-
*C.8@4)&C(141
*/
!
"#!
!
$;
"
#
#$
#+!*
,
#!
-
!
G[]R
!
N4X
!
N4F
!
%)4*3/89
.-.>YAW@9%&:"12(751
33
(,(&)4%AL8/.=L-
K
A>7@L@Z@89.
K
BA8A-Z@89H89>-.
/AW@A-=
U
@/@.8/<
U
@/@A-=
78LH@L.
,
e
-
*!%&%
!
"#%
!
G;E
"
#
#$
#%##%0*
,
#%
-
!
M[PX
!
N[]T
!
N4X
!
%)4*E
L>.@
_
B@/=-/
U
>YAW@8)5
0
16%,)),75(&))AL8/.=L-
K
A>7@L@Z@89.
K
BA8A-Z@
U
@/@.-/Z>9Z@<-/=87
K
A>AW@(
=-/?->.
/AW@.-.8/K
>LA
,
e
-
*C.8
*
%&15(,+
!
"##
!
$;
"
#
#$
)%%*
,
#$
-
!
3M3P]D
!
I]23X3MT4I
!
I3MT4T3C36
!
%)4*MB
KK
L@..->/>Y=87
K
A>AW@=-/?->.
/AW@A-=
U
@/@.L@.B9A.-/7@A8?>9-=7><-Y-=8A->/>Y
.@=>/<8L
\K
L>L>>A.>Y;
0
6(1""6(<)
0
75(4)
,
e
-
-@6
/
1,6%5(+"
/
!
"#%
!
5#
$
#!0#%5*
,
#)
-
!
Q]GT3166Q Q
!
23O3VXJQ
!
6!
%)4*DL8/.=L-
K
A->/89
K
L>Y-9-/
U
>YAWL@@H@
\U
@/@.>YA@L
K
@/>-<-/<>9@89H89>-<
K
8AW^ 8
-/
8)6)")&67+"1+%7+B/<@L<-YY@L@/AA-..B@=B9ABL@=>/<-A->/.
,
e
-
*B
3
"(,)&A17"&)41
3
C(1%,6&141
*/
!
"#$
!
$A
"
#!
#$
#%!&#%%)*
,
#+
-
!
D43PXMT
"田跃胜#!
N[E
"陆
!
平#!
V3PGQR
"王名雪#!
%)4*EL@9-7-/8L
.AB<-@.>/<
/87-==W8/
U
@>YAWL@@89H9>-<.8/<@;
K
L@.(
.->/>YAW@8..>=-8A@.
/AW@A-=
U
@/@.-/8)6)")67+"1+%7+9@8Z@.
,
e
-
*A17"&)41
3
#6)&
*
6)(A()11&
*
F&(G%"+(
/
"
3
U
L-=B9ABL@M=-(
@/=@.
#"上海交通大学学报/农业科学版#!
"##
!
;H
"
!
#$
+#"
"
-/FW-/@.@
#
*
,
#&
-
!
]hF]PP]CM6
!
Q3C6MTee*FW@7-.AL
8/9>
U>Y7>/>A@L
K
@/@-/<>9@89H89>-.
/AW@.-.
,
e
-
-H)7")4@"1:7,E%
0
1"+
!
""+
!
;A
"
$
#$
)%!)$&*
,
#0
-
!
国家药典委员会
*
中国药典"一部#,
Q
-
*
北京$中国医药科技出版社!
"#"
$
!+)*
,
#5
-
!
X3PGX
"杨
!
雁#!
MT3]3e
"邵爱娟#!
e4PT
"金
!
航#!
%)4*g8L-8A->/>Y?>A8/-=897>L
K
W>9>
U
-==W8L8=A@L-.A-=.?@A^@@/ -^9<8/<=B9(
A-Z8A@<
K
>
K
B98A->/.>Y!%&()&)"(
*
%+,%&+-/XB//8/(GB-:W>BE98A@8B
,
e
-
->"):((1&)4)&:D%"2)49"7
*
+
"中草药#!
"#!
!
BA
"
0
#$
#+"$
#+#"
"
-/FW-/@.@
#
*
,
!"
-
!
1T3PGe
!
1T3PGeX
!
V3PGX1
!
%)4*6YY@=A.>YAL@@.
K
@=-@.>/.@@<
U
@L7-/8A->/8/<.@@<9-/
U
.
U
L>^AW>YFW-/@.@7@<-=-/89W@L?
!%&()&)"(
*
%+,%&+
,
e
-
*B44%41
0
)6
/
A17"&)4
!
"#!
!
;H
"
!
#$
%!)%%!*
,
!#
-
!
1T3PGe
!
V3PGX1
!
X3PGDV
!
%)4*[.@>Y
U
-??@L@9-=8=->Z@L=>7@AW@89@9>
K
8AW-=@YY@=A>Y8L8/
U
@>Y.
K
@=-@.>/AW@
U
@L7-/8(
A->/>Y.@@<.>Y!%&()&)"(
*
%+,%&+
!
87@<-=-/89W@L?
,
e
-
*#%%:#,(%&,%)&:>%,6&141
*/
!
"#!
!
BJ
"
%
#$
$%$$&*
,
!!
-
!
V]PGIN
!
2[DEE
!
MT3VEF*6Z89B8A->/>Y.@Z@/OP3?8L=><@.Y>L<-YY@L@/A-8A-/
U
=9>.@9
L@98A@<7@<-=-/89!%&()&).
K
@=-@.8/<
AW@-L8,
e
-
*86(&%+%.%:(,(&%
!
"#%
!
I
"
#
#$
#+*
,
!%
-
!
P3I3DM[I3D
!
M34D]Q
!
M3D]([MT4I[X
!
%)4*O@Z@9>
K
7@/A>YOP378LH@L.AW8A<-.=L-7-/8A@?@A^@@/ W^-A@(8/^ @L.
-/e8
K
8/@.@
U
@/A-8/
K
98/A.
,
e
-
*I7
0
6
/
(,)
!
"#!
!
$IB
"
%
#$
%%)%$$*
,
!$
-
!
P3I3DM[I3D
!
X3Q3O36
!
M34D]Q
!
%)4*T@A@L>9>
U
>B.@;
K
L@..->/>Y
U
@/A-8/QX2#CAL8/.=L-
K
A->/Y8=A>L..B
KK
L@..@.8/AW>=
8(
/-/
K
-
U
7@/A8A->/-/A>?8==>Y9>^ @L.
,
e
-
*@4)&8%44E%
0
1"+
!
"#%
!
A;
"
#!
#$
#5!)#5%&*
,
!)
-
!
P3I3DM[I3D
!
M34D]Q
!
%)4*4.>98A->/8/<=W8L8=A@L-:8A->/>YGAQX2E%8/!
>LAW>9>
U
B@.>YC!C%(QX2AL8/.=L-
K
A->/
Y8=A>L.AW8AL@
U
B98A@@8L9
Y98Z>/>-.
/AW@.-.
!
-/
U
@/A-8/Y9>^ @L.
,
e
-
*A17"&)41
3
IJ
0
%"(5%&)4C1)&
/
!
"#!
!
FA
"
#0
#$
+)")+)#&*
,
!+
-
!
G[XT*DW@
U
@/A-8/L@ABL/@<8YA@LAL8Z@9-/
U
?
.
K
8=@=L8YAMW@/:W>B(#" W^-=W.B
UU
@.A@K
8=@?L@@<-/
UK
L>
,
@=AW8.?@@/.A8LA@<-/
XB//8/EL>Z-/=@
,
e
%
]N
-
*2@-
,
-/
U
$
FW-/8/@^ .
!"
!"#%(&(#!
#,
!"#$(%(##
-
*3Z8-98?9@YL>7
$
WAA
K
$%%
^^ ^*=W-/8/@^ .*=>7
%
U
/
%
!"#%
%
"&(#!
%
)"%&)%0*.WA79*
,
!&
-
!
F]PD4P3
!
g3PO6CT64eO6PC
!
g6CE]]CD6C*3==B7B98A->/>Y9>
U
8/-/8/<.@=>9>
U
8/-/-/Z8=B>9@.YL>7.B.
K
@/.->/=B9ABL@<
8)6)")&67+"1+%7+=@9.
,
e
-
*@4)&#,(%&,%
!
#555
!
$BE
"
!
#$
#&�%*
,
!0
-
!
T3]OF
!
FT6PMN
!
R43]EG
!
%)4*3
KK
9-=8A->/>YW-
U
W(AWL>B
U
W
K
BA.@
_
B@/=-/
U
-/7@<-=-/89
K
98/AAL8/.=L-
K
A>7@.AB<-@.
,
e
-
*9"7
*
9%G%41
0
5%&E%+%)",6
!
"#!
!
EA
"
0
#$
0&$50*
,
!5
-
!
N[MTX
"卢晟晔#!
V3PGNX
"王丽颖#
*P@^ 8L.8/<.AL8A@
U
-@.>Y@;>
U
@/>B.
K
L>A@-/@;
K
L@..->/-/I+,6%K
"(,6(),14(
,
e
-
*86(&%+%A17"&)41
3
$)21")1"
/
9()
*
&1+(+
"中国实验诊断学#!
""+
!
$J
"
5
#$
##""##"%
"
-/FW-/@.@
#
*
&#%#
&
期
!!!!!!!!!!!!!
张晓东!等$滇龙胆
!"#$##
基因的克隆与原核表达