全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$国家自然科学基金"
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!"#!
年宁夏高等学校科学研究项目&宁夏自然科学基金"
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#
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作者简介$郑
!
蕊"
#&!(
#!女!博士!副教授!硕士生导师!主要从事植物基因工程研究
3)45.6
$
7689:0
;!
#!+,<=4
枸杞
1234%$%&
基因克隆及转化拟南芥的研究
郑
!
蕊#!岳思君#!王丽娟#!钱贻崧!!代金霞#
"
#
宁夏大学 生命科学学院!西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室!银川
$""!#
&
!
南昌大学 转化医学研究院!南昌
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#
摘
!
要$以枸杞品种(宁杞
#
号)花药为材料!采用
>?)@A>
技术!分离了
>!>%
类
BCD
基因
!"#$%#"%
包含完整
开放阅读框"
E>F
#的
片段!碱基序列与已知基因
&*#$$$
完全一致运用
I5J:K5
L
技术构建
!"#$%#"%
基因植物过表达载体
M
BGAN%)OPBCD#"%
!利用基因枪法将融合有绿色荧光蛋白"
IF@
#的过表达载体转入洋葱表
皮细胞!将
!"#$%#"%
基因定位在细胞核实时荧光定量
@A>
分析发现!
!"#$%#"%
基因在花药中优势表达!果
实中表达量较低!在根*茎和叶中均未检测到其转录本!推测
!"#$%#"%
基因可能在花药发育过程中起重要作用
通过根癌农杆菌介导法将
M
BGAN%)OPBCD#"%
转入拟南芥"
A=6)"
#!经筛选获得
?
#
代抗性再生植株
$!
棵!
@A>
鉴
定有
*#
棵阳性植株!收获
?
#
代种子!经抗性筛选获得
?
!
代抗性植株
!&
棵!
@A>
鉴定有
!%
棵阳性植株实时荧
光定量
@A>
分析表明!
"#$%#"%
在拟南芥植株的基因组中正常表达表型观察发现
?
#
和
?
!
代拟南芥花药发
育异常!花发育迟缓!果荚短小无种子!进一步表明
!"#$%#"%
可能与植物的育性有关该结果为进一步开展枸杞
遗传转化!深入研究
!"#$%#"%
基因在枸杞花药发育过程中可能发挥的调控功能奠定了基础
关键词$枸杞&
!"#$%#"%
&植物过量表达载体&拟南芥&遗传转化
中图分类号$
QN$
&
QN&
!!!
文献标志码$
H
(")#)
*
"+1234%$%&+,"-."(+/0,,
1
2)!3,2)4+",-25#")
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6/45,275
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0,012+3,(
+4+
&
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植物的生殖器官为动物和人类提供了食物的主
要来源花药是植物的雄性生殖器官!是花粉发育
的场所!花药发育过程涉及到复杂而精细的生理过
程和分子机制!对花药及花粉发育分子机理的研究
有重要的理论意义和应用价值
BCD
类转录因子是植物转录因子中最大的家
族之一!以含有保守的
BCD
结构域为共同特征!
BCD
结构域是一段约
$#
"
$!
个氨基酸的肽段!包
含一系列高度保守的氨基酸残基和间隔序列+#)!,
含单一
BCD
结构域"
>#
%
!
#的
BCD
转录因子在维
持染色体结构和转录调节上发挥着重要作用含
!
个
BCD
结构域"
>!>%
#的
BCD
转录因子在植物体
内主要参与次生代谢的调节和控制细胞的形态发生
含
%
个
BCD
结构域"
>#>!>%
#的
BCD
蛋白可能在
调节细胞周期中起作用+%,其中!
>!>%)BCD
转录因
子是植物中数目最多的一类
BCD
蛋白!它们以
1)
端
含有由
!
个
BCD
结构域构成的
G1H
结合功能域为
共同特征!
G1H
结合功能域除特异结合
G1H
外!有
时其中的碱性氨基酸可兼作核定位序列
>!>%)
BCD
具有广泛的调控功能!包括调控次生代谢*细胞
形态发生*激素刺激*生长发育*环境胁迫应答*分生
组织形成及细胞周期控制等
模式植物拟南芥
BCD
家族成员功能研究较
多!国际上已经报道了数个与拟南芥花药发育有关
的
BCD
家族基因如
)1#$%!+
与花药内层细胞
的细胞壁发育相关!影响花药的开裂+*,&
)1#$%%!
基因异常表达导致苯基丙酸类物质合成途径的变
化!从而影响花粉壁的形成+$,
)1#$%%%
和
)1(
#$%+$
是同源基因!在这
!
个基因的双突变体中!
绒毡层过度肥大!导致了花粉在减数分裂前发育异
常+,
)1#$%#"%
下调表达导致花药绒毡层细胞
发育缺陷!小孢子降解!存活的花粉粒缺失细胞壁而
产生雄性不育+,
目前!已有许多植物的
>!>%
类
BCD
基因被
克隆并被证明与植物的花药发育有关!枸杞
!"(
#$%#"%
基因也属于
>!>%
类
BCD
蛋白家族成
员!但关于其生物学功能和表达特性的研究还未见
报道本研究分析了该基因的表达特征!并构建了
其植物过量表达载体!通过农杆菌介导法转化拟南
芥验证其功能!为进一步转化枸杞!深入研究该基因
在枸杞花药发育过程中可能发挥的功能提供理论依
据及前期基础
#
!
材料和方法
$,$
!
材
!
料
宁夏枸杞品种(宁杞
#
号)正常季节生长于宁夏
育新公司试验田!材料的采集参考徐青等+N,的方法!
分别采取四分体形成前期*四分体早期及四分体后
期的花蕾*花*根*茎*叶和果实!用
>1H@650J37)
J[5"北京
?WH1I31
公司#提取总
>1H
!
B)BO` 合成试剂盒"上海
W0Z.J[=
;
:0
公司#
反转录成
!低温保存备用
$,:
!
方
!
法
$,:,$
!
引物设计与合成
!
采用
@[.4:[$,"
软件!在
!"#$%#"%
的
编码框两侧设计带有
5JJD
接
头的基因特异性引物
OPBCD#"%)DF
"
$a)IIIIH)
AHHI???I?HAHHHHHHIAHIIA?A?HH?)
IIA?HIIH??AIH?I?)%a
!下划线处为
5JJD#
接头#和
OPBCD#"%)D>
"
$a)?A??AH?HAAH??)
IIH?AHH?IHIIIIIHAAHA???I?HAHHI
HHHIA?III?)%a
!下划线处为
5JJD!
接头#!扩增
特异片段!引物由上海生工生物工程公司合成
$;:;:
!
植物过量表达载体
<=>?&@A/=BC$%&
的
构建及鉴定
!
通过
@A>
的方法从枸杞
中分
离出含有
!"#$%#"%
完整
E>F
"含终止密码子和
5JJD
序列#的
G1H
片段纯化
@A>
产物后!利用
I5J:K5
L
#
?:<90=6=
;L
K.J9A6=05/:
?B
WW
试剂盒"上
海
W0Z.J[=
;
:0
公司#进行
D@
反应和
O>
反应!反应
产物转化大肠杆菌
GR$
$
"北京
?WH1I31
公司#!
在
OD
固体培养基"含
$"
%
;
%
4O_50
和
$"
%
;
%
4O
R
L;
D
#上筛选阳性克隆!采用
@A>
鉴定和质粒酶切
验证重组质粒
M
BGAN%)OPBCD#"%
正确性植物
转化载体
M
BGAN%
"南京农业大学喻德跃教授惠赠#
含有增强型
%$UA5B`
启动子!可提高目的基因在
受体植物中的表达量
$;:;&
!
洋葱表皮细胞转化和
DE<
检测
!
制备感受
%!#
&
期 郑
!
蕊!等$枸杞
!"#$%#"%
基因克隆及转化拟南芥的研究
态根癌农杆菌
3RH#"$
"南京农业大学喻德跃教授
惠赠#!通 过 冻 融 法 将 重 组 质 粒
M
BGAN%)OP)
BCD#"%)IF@
转入农杆菌感受态细胞中!在
C3D
固体培养基"含
$"
%
;
%
4O>.Y
和
$"
%
;
%
4O_50
#平
板上筛选阳性克隆!进行
@A>
鉴定制备菌液!通
过基因枪发法转化洋葱表皮细胞共培养
!后!
将洋葱表皮置于载玻片上!激光共聚焦显微镜下观
察绿色荧光蛋白在细胞中的位置用含有
M
B)
GAN%)IF@
空载质粒的根癌农杆菌转化洋葱表皮细
胞!其
IF@
定位结果作为阴性对照
$;:;F
!
1234%$%&
基因组织特异性表达
!
随机选
取
!"
株枸杞取样后混合!分别提取不同时期不同部
位总
>1H
!反转录为
以
为模板!以
枸杞组成型表达
+61,4
基因"
I:0D50^
登录号为
RQ*#$$*,#
#为内部参照!进行实时荧光定量
@A>

+61,4
基因引物为
OP5"
$a)IHAA?)
?AHH?I??AAAIA?H?I)%a
#和
OP5
"
$a)
IAAH?AHAAHIHI?AAHHAHA)%a
#!
!"#$%#"%
基因引物为
]
OPBCD#"%F
"
$a)HAAH??I?AH)
AHA??AHA?A?I??A)%a
#和
]
OPBCD#"%>
"
$a)
?I??AAHH?II??A??IHAH?AH)%a
#
@A>
反
应结束后分析荧光值变化曲线以及融解曲线!通过
比较
!
(
""
AJ的方法进行基因表达水平的相对定量
分析+&,每个样品
%
次重复
$;:;G
!
1234%$%&
基因转化拟南芥
!
通过根癌农
杆菌"
3RH#"$
#介导法将
M
BGAN%)OPBCD#"%
转
化拟南芥"
A=6)"
#!用于转基因拟南芥筛选的抗生素
为
$"
%
;
%
4OR
L;
D

$;:;H
!
转基因拟南芥鉴定及
1234%$%&
表达分析
!
采用沾花法侵染拟南芥"
A=6)"
#!获得
?
"
代转基
因拟南芥种子种子用
",#b
升汞消毒后!在含有
$"
%
;
%
4OR
L;
D
的
BU#
培养基上进行萌发将野
生型植株及筛选获得的抗性植株移栽至装有蛭石的
小盆中!
!c
长日照条件下生长!收获
?
#
代种子
用相同的方法对
?
#
代种子消毒*抗性筛选及获得
?
!
转基因抗性植株
分别取转基因和野生型拟南芥叶片!采用
A?HD
法提取基因组
G1H
利用目的基因特异性
引物
OPBCD#"%)DF
和
OPBCD#"%)D>
检测
!"(
#$%#"%
基因编码框是否插入拟南芥基因组
G1H
中同时!根据植物转化载体上的潮霉素抗性基因
&
;5
*
设计引物
9
L;
F
"
$a)H?I??IIAIHAA?AI)
?H??II)%a
#和
9
L;
>
"
$a)AI??H?I???H?AI)
IAHA???)%a
#!进行阳性植株的
@A>
鉴定!实验
设野生型拟南芥
G1H
为阴性对照
随机选择
@A>
鉴定为阳性的转基因植株!以花
药
为模板进行实时荧光定量
@A>
!分析转基
因拟南芥中
!"#$%#"%
的表达情况!方法同
#,!,*

拟南芥内参基因"
H?*I%*!"
#引物序列分别为
$a)
H?A?IAIHHHIII?H?AAHI??IHA)%a
和
$a)
?IIHIHIA??IH???IAIHHH?HAAI)%a

$,:,I
!
转基因拟南芥的表型观察
!
将
?
#
代及
?
!
转基因拟南芥"
A=6)"
#及野生型种子消毒后播种于
固体筛选培养基"
BU#d$"
%
;
%
4OR
L;
D
#上待
野生型及抗性植株长出
*
片真叶时!移栽于装有蛭
石的盆中!
!c
长日照周期条件下生长观察并记
录转基因拟南芥的生长发育情况和表型性状
!
!
结果和分析
:;$
!
1234%$%&
基因植物过量表达载体的构建与
验证
!!
利用
I5J:K5
L
技术!通过
D@
反应和
O>
反应
构建植物表达载体
M
BGAN%)OPBCD#"%
!
?)G1H
在
M
BGAN%)OPBCD#"%
载体中的结构如图
#
!
H
所
示!该载体具有
!e%$UA5B`
强启动子!可使
!"(
#$%#"%
在转基因植株中组成型表达用
<6.=>
酶切重组质粒确认目的基因的插入!得到了预期的
片段"图
#
!
D
#!表明植物表达载体
M
BGAN%)OP)
BCD#"%
构建成功重组质粒经过测序验证正确
性后转入根癌农杆菌"
3RH#"$
#中
:;:
!
A/=BC$%&
亚细胞定位
蛋白序列分析发现
OPBCD#"%
的
1
端具有核
定位信号肽!推测
OPBCD#"%
可能位于细胞核内
为验证这一推测!利用洋葱表皮细胞瞬时表达系统
对
OPBCD#"%
进行亚细胞定位研究构建的植物
表 达 载 体
M
BGAN%)OPBCD#"%)IF@
中!
OP)
BCD#"%
的
A
末端与
IF@
融合"图
#
!
H
#质粒
G1H
经测序验证后转入根癌农杆菌中!采用基因枪
法转化洋葱表皮细胞
%$UA5B`
组成型启动子能
够启动基因在细胞中表达!可通过显微镜观察报告
基因的绿色荧光信号来确定
OPBCD#"%
在细胞中
的分布结果显示$未与
OPBCD#"%
融合的
%$U
$
IF@
"阴性对照#分布于整个细胞中"图
!
!
H
#!而
OPBCD#"%
$
IF@
融合蛋白定位于细胞核中"图
!
!
D
#!说明
OPBCD#"%
是具有细胞核定位功能的蛋白
:;&
!
1234%$%&
基因表达分析
为了了解
!"#$%#"%
基因在枸杞不同组织器
官及花药四分体发育前后时期的表达模式!采用实
*!#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
图
#
!M
BGAN%)OPBCD#"%
植物表达载体的构建
H,
M
BGAN%)OPBCD#"%
载体中
?)G1H
结构示意图&
D,
重组质粒
M
BGAN%)OPBCD#"%
的酶切验证$
B,GO#$"""
&
#,
M
BGAN%
空载经
<6.=>
酶切&
!,
质粒
M
BGAN%)OPBCD#"%
经
<6.=>
酶切
F.
;
,#
!
A=0/J[SM
BGAN%)OPBCD#"%Z:M
650JJ[50/Y=[45J.=0
H,?)G1H/J[SM
BGAN%)OPBCD#"%Z:&
D,308
L
4:\.
;
:/J.=0=Y[:<=4P.050J
M
65/4.M
BGAN%)OPBCD
$
B,GO#$"""
&
#,
M
BGAN%Z:&
!,
M
BGAN%)OPBCD#"%
图
!
!
OPBCD#"%
的亚细胞定位
H,
阴性对照&
D,OPBCD#"%)IF@
融合蛋白&箭头指示细胞核位置
F.
;
,!
!
USP<:6S65[6=<56.85J.=0=YOPBCD#"%
H,1:
;
5J.Z:<=0J[=6
&
D,FS/.=0
M
[=J:.0=YOPBCD#"%)IF@
&
?9:5[[=K.0\.<5J:/J9:
M
=/.J.=0=YJ9:0S<6:S/
时荧光定量
@A>
进行基因表达分析结果表明!
!"#$%#"%
基因在枸杞花及花药中特异表达!在四
分体时期表达量较高!果实中表达量较低!在根*茎
及叶中未检测到转录本 "图
%
#!因此推测
!"(
#$%#"%
基因主要在花药发育过程中发挥作用
:,F
!
转基因拟南芥鉴定及表型观察
通过根癌农杆菌介导的沾花法侵染获得
!"(
#$%#"%
转基因
?
"
代拟南芥!
?
#
和
?
!
代
R
L;
D
抗
性植株的筛选方法见
#,!,+
转基因植株因为
?)
G1H
的插入而获得
R
L;
D
抗性!可在筛选培养基上
正常生长!而非转基因植株则会出现黄化现象!最终
枯萎死亡将转基因拟南芥移栽至装有蛭石的小盆
中!
!c
长日照条件下生长
:;F;$
!
转基因拟南芥的
鉴定及表达分析
!
随
机选择具有潮霉素抗性的
?
#
和
?
!
代
!"#$%#"%
转基因拟南芥!提取叶片
G1H
进行
@A>
检测!确
定目的基因插入植株的基因组
G1H
中使用的基
因特异引物为
OPBCD#"%)DF
和
OPBCD#"%)D>

图
%
!
!"#$%#"%
基因在枸杞不同组织器官的
实时荧光定量
@A>
分析
#,
四分体形成前期花药&
!,
四分体早期花药&
%,
四分体后期花药&
*,
花&
$,
青果&
+,
红果&
,
根&
N,
茎&
,
叶
F.
;
,%
!
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&
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$!#
&
期 郑
!
蕊!等$枸杞
!"#$%#"%
基因克隆及转化拟南芥的研究
以野生型拟南芥
G1H
为模板的
@A>
作为阴性对
照阳性转基因植株样品中得到一条大小为
&$
P
M
的条带!阴性对照中没有条带"图
*
!
H
#同时!
用潮霉素抗性基因"
R
L;
[
#的特异性引物进行
@A>
!
阳性转基因植株中得到长度为
$#$P
M
扩增片段!阴
性对照中没有条带"图
*
!
D
#
为了分析
!"#$%#"%
基因在转基因植株中的
表达情况!随机选择
@A>
鉴定为阳性的
&
株
?
!
代
转基因拟南芥进行
>:56J.4:)@A>
!同时以野生型
植株作为对照结果表明在
%$UA5B`
启动子作
用下!
"#$%#"%
基因可以在转基因拟南芥中稳定
表达!但表达水平有所差异"图
$
#
:,F,:
!
转基因拟南芥表型性状分析
!
先后对
M
B)
GAN%)OPBCD#"%
转基因拟南芥
?
#
和
?
!
代植株
进行表型性状观察发现!在
*#
棵
?
#
代植株中!有
#
棵植株生长矮小!花药及角果发育异常
!%
棵
?
!
代植株有
#!
棵发育异常!表现有不育现象与
野生型拟南芥"图
+
!
H
*
A
*
3
#相比!
?
#
和
?
!
代植株
中!转基因植株无花药或花药瘪小!花药开裂后无花
粉释放"图
+
!
D
#&花发育时间异常!同一植株上部已
有长角果!而植株下部花发育迟缓或停止发育"图
+
!
G
#!果荚短小!无种子!呈现不育"图
+
!
F
#这些
图
*
!M
BGAN%)OPBCD#"%
转基因拟南芥的
@A>
鉴定
B,GO!"""
&
V,
野生型"阴性对照#&
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转基因植株
F.
;
,*
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;
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M
650J
表型性状都是可稳定遗传的
%
!
讨
!
论
>!>%
类
BCD
基因是
BCD
蛋白家族中最大
的亚家族之一!在植物特定的生理过程中发挥着重
要的作用已经研究证明的一些
BCD
蛋白!如
HJ)
BCD!#
*
HJBCD!*
*
HJBCD$
*
HJBCD+!
*
HJ)
BCD#"%
*
HJBCD##+
*
H4BCD%"$
*
H4BCD%*"
*
I9BCD!*
和
@/BCD!+
等!
1)
端都含有由两个
BCD
结构域构成的
G1H
结合功能域!都具有保守
的
V)BGGWV
基序+#",本研究从枸杞(宁杞
#
号)
中分离出
!"#$%#"%
基因!蛋白序列分析发现该基
因编码的蛋白也具有
>!>%
类
BCD
蛋白的特征!
在
!"#$%#"%
编码蛋白的
1
端有一个核定位信号
肽!推测该蛋白定位于细胞核内+##,构建了
!"(
#$%#"%
基因植物表达载体!利用洋葱表皮细胞瞬
时表达系统进行蛋白质亚细胞定位!证实了这一推
图
$
!
!"#$%#"%
基因在转基因拟南芥中的
实时荧光定量
@A>
分析
#
"
&,
不同的转基因植株&
V?,
野生型拟南芥
F.
;
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图
+
!M
BGAN%)OPBCD#"%
转基因拟南芥"
A=6)"
#的表型性状
H
*
A
*
3,
野生型&
D
*
G
*
F,
M
BGAN%)OPBCD#"%
转基因植株
F.
;
,+
!
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西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
测!说明
OPBCD#"%
是具有细胞核定位功能的
蛋白
实时荧光定量
@A>
分析表明!
!"#$%#"%
基
因在枸杞的花和花药中优势表达!果实中也检测到
转录本!但表达量较低其它
>!>%
类
BCD
基因
也具有类似的表达特性!如拟南芥
#$%!#
*
#$%!*
和
)1#$%#"%
基 因+!#!)#*,!棉 花
?2#$%!*
基
因+#$,
)1#$%!*
主要在花中表达!在花药发育过
程中受调控由此推测!
!"#$%#"%
可能在花药的
发育过程中有重要的作用
在拟南芥中!
)1#$%#"%
基因的突变!引起花
药发育异常!绒毡层细胞发育有缺陷!小孢子降解!
存活的花粉粒缺失细胞壁导致雄性不育过量表达
)1#$%!*
引起转基因植株花异常!产生异常的花
粉粒*花药不能裂开散粉棉花
?2#$%!*
基因在
拟南芥中的过量表达导致花畸形*雄蕊花丝短化*花
药不开裂*少有成熟的花粉粒形成本研究将
!"(
#$%#"%
编码框全长与
%$UA5B`
组成型启动子
相连!转化拟南芥"
A=6)"
#!在转基因拟南芥中检测
到
!"#$%#"%
的转录产物!说明
!"#$%#"%
已在
拟南芥中异源表达与野生型相比!在
*#
棵
?
#
代
和
!%
棵
?
!
代转基因植株中!分别有
#
棵和
#!
棵
植株生长矮小!出现了无花药或花药瘪小!花药开裂
后无花粉释放现象其中还发现花发育时间异常!
同一植株上部已有长角果!而植株下部花发育迟缓
或停止发育!部分角果短小!果荚内无种子!呈现不
结实现象结合基因组织器官表达特征及表型!推
测枸杞
!"#$%#"%
可能与花药的发育与花粉的形
成有关!在绒毡层发育及小孢子的成熟过程中可能
发挥重要作用但其中的具体机制还有待进一步探
讨!需借助枸杞转化体系以及相应枸杞突变体从不
同方面对枸杞花药和果实发育进行深入的研究
参考文献!
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