全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
#""")&"!$
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#
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!!!!!!!!!!!!!!!
!"#
$
#"*(+"+
%
,
*-../*#""")&"!$*!"#$*##*!#&#
收稿日期$
!"#$)"+)%"
&修改稿收到日期$
!"#$)"0)"$
基金项目$青海省科技厅项目"
!"#$)12)(%$
#&青海师范大学教学改革研究项目"
3
4/5
,6
!"#%#"+
#&青藏高原药用动植物资源重点实验室
"
!"#&)7)
6
!$
#
作者简介$乔
!
枫"
#0(%
#!女!博士!教授!主要从事植物生理和分子生物学研究
8)9:-;
$
3
-:<=/9
!
#+%*><9
"
通信作者$陈
!
志!博士!教授!主要从事药用植物学研究
8)9:-;
$
>7-$?
!
#+%*><9
枸杞
$%
半乳糖酸内酯脱氢酶基因的
克隆及表达分析
乔
!
枫#!耿贵工!!陈
!
志#"
"
#
青海师范大学 青藏高原资源与环境教育部重点实验室!西宁
?#"""?
&
!
青海省农林科学院 农业部农产品质量安全风险评估
实验室!西宁
?#""#+
#
摘
!
要$以青海枸杞"
!
"
#$%&()()%&@*
#为模板!采用
AB)CDA
和
AED8
技术!克隆枸杞
@)
半乳糖酸
)#
!
&)
内酯
脱氢酶"
F@GH
#基因序列!命名为
!*!+,

!*!+,
基因全长为
!##&I
J
!包含一个开放读码框
#(+(I
J
"编码
$??
个氨基酸#(
$K
末端序列
$(I
J
(
%K
末端序列
!0"I
J

!*!+,
基因核苷酸序列与番茄(马铃薯(烟草
*!+,
基
因具有
??L
"
0"L
的一致性
@IF@GH
编码氨基酸序列包含
F@GH
蛋白酶具备的
MEG)I-/N-/
O
)&
和
E@P
结构
域
3
AB)CDA
分析结果显示!在枸杞不同组织中
!*!+,
基因的表达(抗坏血酸含量和
F@GH
活性变化趋势相
同!表现为在枸杞的花和果实中表达量最高!成熟叶中表达量最少推测
!*!+,
基因表达促进枸杞果实中抗环
血酸含量的积累
关键词$枸杞&
@)
半乳糖酸
)#
!
&)
内酯脱氢酶"
F@GH
#&基因克隆&抗坏血酸
中图分类号$
Q(?$
&
Q(?+
文献标志码$
E
&"(#(
)
*(!+,
-
./00#"(1*22/.(0"312343."42
5
"-678$(8$(67
QREPMS/
O
#
!
F8TFF5-
O
O
!
!
DH8T14-
#
"
"
#8N5>:U-6
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O
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Z-/-/
O
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6
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6
A-.]E..S..9S/U=O
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6
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O
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!
Z-/-/
O
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!
D4-/:
#
5602.*72
$
E/O
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NW<
O
S/:.S
O
S/S!*!+, :^.-.<;:USN=W<9!
"
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O
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6
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J
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6
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AB)CDA
#
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J
-N:9
J
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"
AED8
#
*B4S=5;);S/
O
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J
!
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J
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J
S/
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O
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PAM
#
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J
:/N%K)S/N!0"I
J
*H<9<;<
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6
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N->:USNU4:U!*!+,
O
S/S.S
3
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4;
6
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"
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2
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!
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!
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3
5S/>S>J
WMEG)I-/N-/
O
)&:/NE@PN<9:-/.UW5>U5WS.*AS:;U-9S)CDA:/:;
6
.-.-/N->:USNU4:UU4SS_
J
WS..-*!+,
O
S/S
!
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6
S^WS:;U4S.UWO
S.U-/U4S=;<^ SW:/N=W5-U
!
:/NU4S
;S:.U-/9:U5WS);S:=*RU :^..
J
S>5;:USNU4:U!*!+,
O
S/SS_
J
WS..-<5;N
J
W<9>595;:U->:>-N-/!7()()%&=W5-U.*
8/
9
:".!0
$
!
"
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&
@)
O
:;:>U!
&);:>U6
NW<
O
S/:.S
"
F@GH
#&
O
S/S>;O
&
:.>:>-N
!!
维生素
D
又叫抗坏血酸"
E.E
#!是植物体内合
成的一类己糖内酯化合物!在植物的生长发育中发
挥重要作用!如抗氧化和清除自由基(光合作用和光
保护(细胞的生长和分裂以及参与乙烯的合成
等)#)!*高等植物的抗坏血酸合成代谢途径中"图
#
#!半乳糖酸内酯脱氢酶"
@)
O
:;:>U!
&);:>UNS4
6
NW<
O
S/:.S
!
F@GH
!
8D#*%*!*%
#直接催化半乳
糖内酯形成
E.E
!起着非常关键的作用)%*
E.E
在
植物细胞内的氧化分解主要由抗坏血酸氧化酶
"
EP
#和抗坏血酸过氧化物酶"
EZC
#催化)&)$*!两种
酶分别在
P
!
和
H
!
P
!
的参与下!将
E.E
氧化为不
稳定的单脱氢抗坏血酸"
VGE
#!再经过非酶歧化反
应形成脱氢抗坏血酸"
GHE
#!最终
GHE
可被分解
成不具活性的
!
!
%)
二酮古洛糖酸"
!
!
%)N-]SU<
O
5;->:>-N
#其中!
GHE
也可以通过单脱氢抗坏血酸
还原酶"
VGHEA
#和脱氢抗坏血酸还原酶"
GHEA
#
的作用!被还原为
E.E
从而得以循环再生因此!
植物体内这
&
种
E.E
循环代谢酶的活性将影响
E.E
水平的高低"图
#
#
图
#
!
植物中抗坏血酸合成代谢途径
F@GH*
半乳糖酸内酯脱氢酶&
ECZ*
抗坏血酸过氧化物酶&
EP*
抗坏血酸氧化酶&
VGEA*
单脱氢抗坏血酸还原酶
M-
O
*#
!
B4S9SU:I<;->
J
:U4^ :
6
.<=:.>:>-N-/
J
;:/U.
F@GH*@)
O
:;:>U!
&);:>U6
NW<
O
S/:.S
&
ECZ*E.>:>-N
J
SW<_-N:.S
&
EP*E.>:>-N<_-N:.S
&
VGEA*V6
NW<
O
S/:U-:>-NWSN5>U:.S
!!
枸杞"
!
"
#$%&()()%& @*
#为茄科植物!属多
年生灌木!是中国重要植物资源之一枸杞果实中
含有较高抗坏血酸!
F@GH
是
E.E)F\H
循环的一
个关键酶!对枸杞果实
E.E
积累和代谢具有非常重
要的作用所以本研究选用青海枸杞!利用
AB)
CDA
和
AED8
技术进行
*!+,
基因克隆!分析该
基因在枸杞不同器官中的表达!探讨枸杞不同组织
中抗坏血酸含量和
F@GH
活性的变化!进一步分析
枸杞
E.E
含量与代谢酶基因
*!+,
的关系
#
!
材料和方法
;*;
!
材
!
料
枸杞材料来自青海农林科学院实验基地取枸
杞新鲜(无病虫害的叶(茎(花(果实器官!立即置于
液氮中!后置于
?"`
保存备用
;*<
!
方
!
法
;=<=;
!
1234
基因
7>?5
全长克隆
!
根据已知植
物
*!+,
基因的保守序列设计简并引物"表
#
#!枸
杞总
ATE
提取采用
BW-7<;
试剂"
R/X-UW<
O
S/
公司#!
以其 为 模 板 进 行
AB)CDA
利 用
EVa M-W.U
\UW:/N>GTE
试剂盒"
B:b:A:
公司#合成
>GTE
第
一链以
>GTE
第一链为模板!进行
>GTE
第二链
扩增
CDA
反应条件为
0&`
预变性
%9-/
&
0&`
变性
#9-/
!
$$
"
$?`
退火
#9-/
&
(!`
延伸
!9-/
!
%$
个循环&
(!`
延伸
#"9-/

CDA
产物纯化后连
接至
J
VG#?)B
载体"
B:b:A:
#!转化
GH$
#
感受态
细胞!选用
!
"
&
个阳性克隆送北京三博远志生物公
司测序
根据已经获得的
*!+,
中间片段核苷酸序列!
设计用于
%K
端和
$K
端克隆的基因特异引物"表
#
#!
利用
$K)M5; AED8b-U!*"
和
%K)M5; AED8b-U
!*"
"
BEbEAE
#扩增枸杞
*!+,
的
>GTE
的
$K
和
%K
末端序列!实验操作按照试剂盒说明书进行
CDA
产物经纯化(克隆后测序
;=<=<
!
1234
基因生物信息学分析
!
用
GTE.U:W
软件对所克隆的基因片段进行拼接!获得了完整的
枸杞
*!+,
全长
>GTE
!然后在
TDcR
"
4UU
J
$%%
^^ ^*/>I-*/;9*/-4*
O
%#网站进行
c;:.U
分析!并
通过软件
PAMM-/NSW
"
4UU
J
$%%
^^ ^*/>I-*/;9*
/-4*
O
%
O
%
O
#进行了
PAM
的查找和核
苷酸的翻译&应用
8_CE6
"
4UU
J
$%%
^^ ^*S_
J
:.
6
*
O
#提供的相关软件!综合预测分析了编码蛋白的
基本性质(结构特点和亚细胞定位&利用
VS
O
:%*#
软件的
D;5.U:;Z
对不同
*!+,
基因编码氨基酸序
列进行多重序列比对!构建系统发育树
;=<=@
!
1234
基因组织表达分析
!
以枸杞
8#5$1
基因"
HQ&#$($&*#
#为内参!设计
8#5$1
基因特异引
物
FEDBRTdM#
和
FEDBRTdA#
"表
#
#!预期扩
增片段长度为
0+I
J

根据枸杞
*!+,
全长
>GTE
基因序列设计引
物
FF@GHdM#
和
FF@GHdA#
"表
#
#!扩增片段长
#"0I
J
采用
\dcA
$
CWS9-_8_9(
:
BV
"
B:b:A:
#
试剂盒进行荧光定量
CDA
反应反应在"
c-<)A:N
#
荧光定量
CDA
仪上进行!反应体系"
!"
%
@
#为
!e
\dcACWS9-_8_9(
:
BV
"
B:b:A:
#
"
%
@
!
>GTE
模
版
!*"
%
@
!上下游引物"
#"
%
9<;
%
@
#各
"*&
%
@
!
$"e
APZAS=SWS/>SG
6
S"*&
%
@
!
NNH
!
P+*?
%
@
!每个
反应做
%
个重复
CDA
扩增程序为
0$`
预变性
%"
.
&
0$`
变性
$.
!
+"`
退火
%#.
!
&"
个循环反应
!&#!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
表
;
!
1&A
扩增所用引物及其序列
B:I;S#
!
CW-9SW.:/N.S
3
5S/>S.WS
3
5-WSN-/CDA:9
J
;-=->:U-引物类型
CW-9SWU
6J
S
引物名称
CW-9SW/:9S
引物序列
CW-9SW.S
3
5S/>S
"
$K
#
%K
#
目的片段特异引物
B:W
O
SU
O
S/S
J
W-9SW.
F@GH)M EBFDBDDFBBDDBBD
"
E
%
F
#
DBBDDE
F@GH)A! FDEEFBEFBBBEBDBDBDEFBBD
F@GH)M! FBFEDEBFDEEBDDBEBFBDBEE
F@GH)A BBEDEDEFDDBDEFEFFEEFFFE
F@GHfM FDFEEFDBBDDFBBDEEEBFDBDDFBBDBDBDEDBB
F@GHfA FDFEEFDBBDFFFEDEEDDEFBDEDEDEFDDBDFFEBF
%K)AED8
%<5USWF@# FFFFDDEDDEFBFFFBEBDEFEF
%-/F@# DEEFEEEFFEFDBFFEDDDFEEDD
$K)AED8
$<5USWF@# BFFDFDFBEEDFFEEBEEDBFEFD
$-/F@! FBFFFDDDFFFFBEFBEFEEFEFEE
AB)CDA
FEDBRTdM# DDEBDBEDFEFFFBBEDFDBBBF
FEDBRTdA# EFBDEEFEFDDEDEBEFFDEEFD
FF@GHdM# FEBFDEFBBFBFFBEFBFEDEBFD
FF@GHdA# EFEFEBDBDFBEDEBFDBFDEEFF
结束后确认
AB)CDA
扩增曲线和融解曲线利用
!

$$
;5方法计算基因相对表达量)+*
;=<=B
!
抗坏血酸含量和
C$>D
活性测定
!
参考
EW:]:^ :
等)(*的方法测抗坏血酸含量参考
B:I:)
U:
等)?*的方法测定
F@GH
活性
!
!
结果与分析
<=;
!
枸杞
1234
基因克隆与序列分析
以枸杞叶片为材料提取总
ATE
"图
!
!
E
#!经琼
脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测能够满足
AB)
CDA
(
AED8
(荧光定量
CDA
实验要求
AB)CDA
扩增
*!+,
基因
>GTE
同源 片 段!引 物 组 合
F@GH)M
%
F@GH)A!
和
F@GH)M!
%
F@GH)A
"表
#
#
的测序结果分别为
##&%I
J
和
?0(I
J
"图
!
!
c
和图
!
!
D
#
$K)AED8
扩增获得
#++I
J
序列"图
!
!
G
#!
%K)AED8
扩增获得
%&+I
J
序列"图
!
!
8
#引物
F@GHfM
%
F@GHfA
扩增包含
PAM
的序列
#(?0
I
J
"图
!
!
M
#
将获得的同源片段和两端序列拼接获得一个长
!##&I
J
的
>GTE
序列序列分析表明!
*!+,
基
因包括完整开放读码框
#(+(I
J
"编码
$??
个氨基
酸#(
$K
末端序列
$(I
J
(
%K
末端序列
!0"I
J
"图
%
#
通过
c;:.U
比对!根据同源关系将该基因命名为
!-
*!+,

<=<
!
枸杞
281234
基因生物信息学分析
GTE.U:W
软件对预测的
@IF@GH
氨基酸序列
分析表明!该蛋白分子量为
++*&!]G
!等电点
?*+0%
!其中碱性氨基酸
(?
个!酸性氨基酸
("
个!疏
水性氨基酸
#0"
个!极性氨基酸
#&0
个
TDcR
结
构预测分析表明!
@IF@GH
含有
F@GH
蛋白酶具
备的
MEG)I-/N-/
O
)&
和
E@P
结构域
!*!+,
序
列与烟草(马铃薯(番茄(辣椒
*!+,
基因的一致性
图
!
!
枸杞
!*!+,
基因克隆
E*
枸杞总
ATE
&
V*G@!"""
&
c*
引物
F@GH)M
%
F@GH)A!
的扩增结果&
D*
引物
F@GH)M!
%
F@GH)A
的
扩增结果&
G*$K)AED8
&
8*%K)AED8
&
M*F@GHfM
%
F@GHfA
的扩增结果
M-
O
*!
!
D;O
<=!*!+,>GTE=W<9!7()()%&
E*B&
V*G@!"""9:W]SW
&
c*AB)CDAWS.5;U -^U4
J
W-9SW.F@GH)M
%
F@GH)A!
&
D*AS.5;U -^U4
J
W-9SW.
F@GH)M!
%
F@GH)A
&
G*B4SWS.5;U<=$K)AED8
&
8*B4SWS.5;U<=%K)AED8
&
M*AS.5;U -^U4
J
W-9SW.F@GHfM
%
F@GHfA
%&#!
##
期
!!!!!!!!!!
乔
!
枫!等$枸杞
@)
半乳糖酸内酯脱氢酶基因的克隆及表达分析
图
%
!
!*!+,
基因
>GTE
序列及推定氨基酸序列
方框内序列分别为
$K
末端序列和
%K
末端序列
M-
O
*%
!
>GTE.S
3
5S/>S:/N
J
5U:U-XS:9-/<:>-N.S
3
5S/>S<=!*!+,
O
S/S
$K:/N%KS/N.S
3
5S/>S.-/I<_S.
均达到了
??L
"
0"L

@>F@GH
氨基酸序列与其
他作物
F@GH
氨基酸序列多重比对分析"图
&
#发
现!它们之间有较高的一致性表明不同植物
F@GH
蛋白序列存在高度保守序列!但也有较明显
的长度和组成上的变异性可见!
F@GH
作为植物
抗坏血酸生物合成途径中的第一个关键酶!在进化
的过程中保持了足够的遗传稳定性和演化趋同性
<=@
!
$6C$>D
系统
为了研究枸杞
F@GH
与其他植物
F@GH
的进
化关系!构建氨基酸序列进化树!结果"图
$
#显示!
枸杞"
!
"
#$%&()()%&
#
F@GH
与番茄"
./0(1%&
0
"
#/
2
3)4$#%&
#(马铃薯"
./0(1%&5%3)/4%&
#(辣椒
"
;(
2
4$#%&(11%%&
#(烟草"
6$#/5$(1(5((#%&
#(甘
薯"
<
2
/&/3((5(5(4
#
F@GH
蛋白聚为一类!枸杞与
茄科其他植物聚为一类!符合常规的植物分类本
结果进一步表明枸杞
F@GH
的氨基酸序列的种属
保守性
<=B
!
281234
基因组织特异性表达
以枸杞
8#5$1
基因为参照!运用
AB)CDA
分析
枸杞不同组织中
*!+,
基因的相对表达量结果
"图
+
#显示!枸杞
*!+,
基因在花中相对表达量最
高!其次在果实中!在成熟叶中相对表达量最低
花(绿果(红果
*!+,
表达量分别是成熟叶的
%*++
(
!*&&
和
%*#!
倍以上结果表明!
!*!+,
在各组
织中均有表达!不具有明显组织特异性
<=E
!
枸杞抗坏血酸含量和
C$>D
活性测定
枸杞不同器官中抗坏血酸含量和
F@GH
活性
的变化趋势相同"图
(
#!在花(绿果(红果中含量和
&&#!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
$&#!
##
期
!!!!!!!!!!
乔
!
枫!等$枸杞
@)
半乳糖酸内酯脱氢酶基因的克隆及表达分析
活性较高!在成熟叶中较低其中!花(绿果(红果抗
坏血酸含量分别是成熟叶的
&*+0
(
%*#0
和
%*%+
倍
"
=
%
"*"$
#&花(绿果(红果
F@GH
活性分别是成熟
叶的
#*?+
(
#*%+
和
#*$"
倍
基因表达(酶活性和抗坏血酸含量的相关性分
析结果显示!酶活性与基因表达量变化趋势呈正相
关!相关系数为
"*0&??
&酶活性与抗坏血酸含量变
化趋势呈正相关!相关系数为
"*0+%$
&抗坏血酸含
量与基因表达变化趋势呈正相关!相关系数为
"*0($+

三者之间呈正相关关系
%
!
讨
!
论
植物中
F@GH
将
@)
半乳糖酸
)#
!
&)
内酯转变成
@)
抗坏血酸!
F@GH
是
@)
抗坏血酸合成代谢途径的
关键酶!该酶基因表达水平决定了抗坏血酸含量的
高低)0)##*目前已从花椰菜(水稻(马铃薯(烟草(刺
梨(苹果(甜瓜(番茄(辣椒(草莓(拟南芥(白菜(毛花
猕猴桃等植物中)##)#&*克隆了编码该酶的基因在甜
图
+
!
!*!+,
在枸杞不同组织中的表达
#*
嫩叶&
!*
嫩茎&
%*
成熟叶&
*
成熟茎&
$*
花&
+*
绿果&
(*
红果下同
M-
O
*+
!
!*!+,S_
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活性!并且其活性高低与抗坏血酸含量相
关
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水平和抗坏血酸含量
日变化规律趋势一致!推测
F@GH
受光诱导表达
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达受光调控!随着甜瓜果实成熟!总体上
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因表达水平上升!
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含量也相应增加
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的活性后!
植株生长和果实的发育均受到不利影响任锡亮
等)#!*克隆了不结球白菜
*!+,
基因!且
F@GH
活
性可能受光诱导调控本研究克隆了枸杞
*!+,
基因!并且测定和分析在不同组织中该酶活性(抗坏
血酸含量与基因表达的关系!并经进一步分析发现
抗坏血酸含量与
F@GH
活和基因表达呈正相关关
系!与
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等)#(*研究结果相同
枸杞的抗逆特性是否与自身的
F@GH
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类基因或调控元件有关+ 这些有待于我们进一
步探讨枸杞果实是食用部分!果实大小会影响产
量!如何提高枸杞的产量!一直是生产中的重要任务
之一
F@GH
基因的过量或抑制表达是否会影响
枸杞果实的大小和产量+ 是否会明显影响抗坏血酸
含量+ 若将枸杞这些基因转入番茄中!是否会提高
番茄的抗逆性+ 这些问题都有待于研究和探讨
参考文献!
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