全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$广西科学研究与技术开发计划"桂科重
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#&广西自然科学基金 "
!"#!2345677"*%"+-
#&国家自然科学基金
"
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#&广西科技成果转化和应用项目"桂科攻
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#&广西培养新世纪学术和技术带头人专项资金
作者简介$柴胜丰"
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#!男!博士!主要从事植物保护生物学研究
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通信作者$韦
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霄!研究员!主要从事保护生物学和药用植物栽培研究
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B/D,=1
濒危植物毛瓣金花茶遗传多样性的
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分析
柴胜丰#!!庄雪影!!邹
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蓉#!陈宗游#!蒋运生#!韦
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霄#"
"
#
广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所!广西桂林
*$#""+
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!
华南农业大学 林学院!广州
*#"+$!
#
摘
!
要$采用
E55F
分子标记对毛瓣金花茶
+
个自然居群的遗传多样性进行了分析利用
##
个引物对
#*"
个个体
进行了扩增!共扩增出
&!
条条带!其中多态性条带
-$
条毛瓣金花茶在物种水平和居群水平都表现出相对较高
的遗传多样性!在物种水平上!多态位点百分率"
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基因多样性指数"
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多样性指数"
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为
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遗传多样性分析和
7HIJ7
分析表明!毛瓣金花茶的遗传变异主要存在于居群内!居群间的遗传
分化程度较低"
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检测表明!居群间的遗传距离和地理
距离之间存在显著的相关关系"
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#
","*
#研究认为!毛瓣金花茶较高的遗传多样性和较低的遗传分
化可能与其异交型繁育系统和鸟类传粉有关
关键词$濒危植物&毛瓣金花茶&遗传多样性&
E55F
中图分类号$
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N
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M-(&
文献标志码$
7
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E55F
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毛瓣金花茶"
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#系山茶科山
茶属"
()*+,,-)
#金花茶组"
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!
()*+,,-)
!
5A=K,(#
3
4)51#)O>:1
C
#常绿灌木或小乔木!为广
西石灰岩特有珍稀濒危植物其花瓣)花丝)花柱和
子房均密被柔毛!具有极高的观赏价值*#+毛瓣金
花茶是培育黄色茶花新品种的优良种质资源!具有
重要的科研价值*!+在毛瓣金花茶)金花茶"
(2
.
+6
1+,71--
#)显脉金花茶"
(2+/
.
#,+0-)
#等
(
种金花茶
中!毛瓣金花茶的制茶适宜性最好*%+&毛瓣金花茶还
可作为一种天然的食品抗氧化剂或用于保健食品的
生产*$+!具有潜在的开发利用价值毛瓣金花茶分
布区极为狭窄!仅分布在广西西南部隆安和大新两
县的局部生境!生于海拔
#!"
"
$%"9
的北热带石
灰岩季雨林由于人类对其生境的破坏和对资源的
过度采挖!其栖息地面积逐渐缩小!野外居群数量锐
减!大部分居群呈衰退趋势!资源濒于灭绝目前该
物种已列入,广西极小种群野生植物名录-),广西第
一批重点保护野生植物名录-),中国珍稀濒危保护
植物名录-),中国物种红色名录-和,
ERO4
物种红
色名录-目前对于毛瓣金花茶的研究主要集中在
染色体)花粉和叶片形态结构*)-+)种群结构特征*(+)
光合特性*&+)繁殖技术*#")##+等方面!而对于毛瓣金花
茶濒危机理的研究并不多!缺乏其濒危原因的足够
了解!因而难以制定出切实可行的保护策略
物种的遗传多样性是维持其繁殖活力和适应环
境变化的基础!又是其它一切多样性的基础和最重
要的部分!濒危植物的遗传学研究是揭示濒危机制
的一个重要方面*#!+对濒危植物遗传多样性的研
究不仅能了解物种的进化历史以及濒危机制!而且
关系到能否采取科学有效的措施来保护濒危物
种*#%+
E55F
"
/1KA[)0/9
^
;A0A
a
SA1=A[A
^
A:K0
#即简单
重复间隔序列标记方法!具有操作简单)快速)高效)
可重复性等优点!在珍稀濒危植物遗传多样性研究
中被广泛应用并获得了成功*#$)#++本研究拟采用
E55F
分子标记技术对毛瓣金花茶
+
个自然居群进
行了分析!旨在揭示毛瓣金花茶自然居群的遗传结
构和遗传多样性水平!为其濒危原因的揭示及保护
措施的制定提供理论依据
#
!
材料和方法
;,;
!
试验材料
试验材料分别采自广西隆安县屏山乡)乔建镇
和大新县福隆乡的
+
个居群!覆盖了毛瓣金花茶的
整个分布区域!其地理位置)采样数等详见表
#
对
于个体数量较少的居群!如陇连"
bb
#和内斗"
4_
#
居群!采集居群内所有个体!其它居群则采样时植株
的距离尽量达到
*9
以上共采集
#*"
株毛瓣金花
茶植株幼嫩叶片!用变色硅胶进行快速干燥!置于密
封袋中带回!室温下保存备用
;,<
!
方
!
法
;=<=;
!
总
,>1
的提取
!
植物基因组总
_47
提取
采用改良的
O` 7X
方法*#-+!用紫外分光核酸测定仪
"
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!
8
^^
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!
2A[9:1
T
#测定模版
_47
浓度!用
#G
琼脂糖凝胶电泳检测
_47
质量!
将
_47
浓度稀释到
!"1
C
%
#
b
!
!"d
保存备用
;=<=<
!
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的扩增与检测
!
E55F
引物选用加拿
大哥伦比亚大学公布的序列"
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"
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#!由上海生工生
物工程有限公司合成!从
#""
个
E55F
引物中筛选
出
##
个扩增条带清晰)反应稳定的引物用于全部
#*"
份
_47
样品的扩增"表
!
#采用
!"
#
b
反应
体系!其中包括$
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#,*99?;
%
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C
O;
!
)
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%
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)
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b
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#R8)
9
酶)
!"1
C
模版
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扩增程序为$
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预变性
*9/1
!
&$d
变性
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!
$&d
"
*%d
退火
$*0
"因引物而
异!表
!
#!
-!d
延伸
#,*9/1
!进行
$"
个循环!最后
-!d
延伸
-9/1
扩增产物在
#,+G
琼脂糖凝胶上
电泳分离!溴化乙锭"
8X
!
",#
#
C
.
9b
#
#染色显带!
表
;
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毛瓣金花茶居群的地理位置和取样数
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^
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^
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居群编码
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地点
5/KA
纬度%经度
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%
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C
/KSZA
海拔
7;K/KSZA
%
9
取样数
5:9
^
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1S9DA[
居群大小
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^
S;:K/?1
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隆安县屏山乡陇召屯
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隆安县乔建镇底隘屯
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隆安县乔建镇龙土屯
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大新县福隆乡内斗屯
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C
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5`
大新县福隆乡驮塞屯
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C
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西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
通过
RJc
凝胶成像系统成像)观察)记录
;,<,?
!
数据统计与分析
!
E55F
为显性标记!电泳
图谱中的每一条带均视为一个分子标记!并代表一
个引物的结合位点按照凝胶同一位置上
_47
带
的有无进行统计!有带的记为
#
!无带的记为
"
!构成
表型数据矩阵用
cIc2848#,%!
软件*#(+对全部
群体进行遗传参数分析分别计算了多态位点百分
率"
!!"
#)等位基因数"
5
:
#)有效等位基因数"
5
A
#)
4A/
(
0
基因多样性指数"
#
#"
4A/
!
#&-%
#)
5>:11?1
多
样性指数"
$
#)
4A/
(
0
遗传距离"
:
#和遗传一致度"
$
#!
根据总的基因多样性"
;
K
#和居群内基因多样性
"
;
0
#!计算基因分化系数"
%
0K
#
*
#&
+和基因流*
&
9
L
"
#
%
%
0K
#
#%
$
*
!"
+
+采用
_O67#,#
软件计算欧氏距
离平方和!建立遗传距离矩阵!并用
WE47HIJ7
表
<
!
各个引物序列!退火温度!
扩增位点数与多态位点数
:`D;A!
!
c[/9A[0A
a
SA1=A0
!
:11A:;/1
C
KA9
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^
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T
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引物编号
c[/9A[
=?ZA
引物序列
c[/9A[
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SA1=A
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$
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#
退火温度
711A:;/1
C
KA9
^
A[:KS[A
%
d
统计位点数
4?,?<
;?=/
多态位点数
4?,?<
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T
9?[
^
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(#-
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4?KA
$
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"
7
!
2
#&
VL
"
O
!
`
#
,
#,**
软件进行分子方差分析!计算居群内)居群间的
变异方差分布根据
4A/
(
0
遗传距离!用
4` 5V5
^
=
!,"!
*
!#
+对各居群进行聚类分析!确定各居群间的相
互关系采用
6`c27
软件*!!+进行
H:1KA;KA0K
分
析!检测
+
个居群之间的遗传距离与地理距离之间
的关系
!
!
结果与分析
<,;
!
毛瓣金花茶的遗传多样性
##
个引物对毛瓣金花茶
+
个居群
#*"
个个体
共扩增出
&!
条带!其中
-$
条多态带由表
!
可以
看出!
##
个引物扩增总带数
+
到
#"
不等!平均扩增
条带数为
(,$
在物种水平上!毛瓣金花茶
!!"
为
(",$%G
!
#
为
",!$*#
!
$
为
",%--+
&在居群水平上!
!!"
的变化范围为
*(,-"G
"
++,%"G
!平均为
+%,!!G
!
#
的变化范围为
",#&&-
"
",!!&%
!平均
为
",!#$$
!
$
的变化范围为
",%""&
"
",%$%(
!平均
为
",%!!+
"表
%
#各居群遗传多样性水平相对较
高!且差异并不大!各居群的
!!"
与居群个体数量
的相关性分析显示!两者并不存在显著的相关关系
"
L",!-!
!
!L",+"#
#表明遗传多样性与居群
内个体数量无关!人类对某些居群的破坏"
bb
和
4`
#并未引起其遗传多样性的降低
<,<
!
毛瓣金花茶居群的遗传结构
毛瓣金花茶总的基因多样性"
;
K
#为
",!$*+
!
居群内的基因多样性"
;
0
#为
",!#$*
!居群间
%
0K
为
",#!++
!表明有
#!,++G
的遗传变异存在于居群间!
(-,%$G
的变异存在于居群内"表
$
#
7HIJ7
分
析结果显示!居群间遗传分化系数"
!
0K
#为
##,%-G
!
在总的遗传变异中!
##,%-G
的变异发生在居群间!
((,+%G
的变异发生在居群内"表
*
#说明遗传变
表
?
!
毛瓣金花茶居群的遗传多样性
:`D;A%
!
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居群
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5
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4_ #,+%"$ #,%-&- ",!!!# ",%%!# +%,"$
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平均
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物种水平
5
^
A=/A0;A\A; #,("$% #,%&*& ",!$*# ",%--+ (",$%
!!
注$
5
:
,
等位基因数&
5
A
,
有效等位基因数&
#,4A/
(
0
基因多样性指数&
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多样性指数&
!!",
多态位点百分率
4?KA
$
5
:
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^
A[;?=S0
&
5
A
,8<^
A[;?=S0
&
#,8B
^
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TC
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T
&
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&
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C
A?<
^
?;
T
9?[
^
>/=D:1Z0,
*&
#
期
!!!!!!!!!!!!
柴胜丰!等$濒危植物毛瓣金花茶遗传多样性的
E55F
分析
异主要存在于居群内!居群间的遗传分化较小居
群间的基因流"
&
9
#为
%,$$("
!表明毛瓣金花茶居
群间的基因流较高
<,?
!
居群间的遗传距离和遗传一致度
由表
+
可以看出!
+
个居群平均遗传一致度"
$
#
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讨
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论
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!
毛瓣金花茶的遗传多样性和遗传分化
通常认为特有种)濒危种和狭域种的遗传多样
性水平较低*!%)!$+但是也有研究报道表明有些特有
种)狭域种甚至濒危种也能保持较高水平的遗传多
样性*!*)!-+毛瓣金花茶仅分布在面积不到
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!
广西西南部隆安和大新两县的交界处!但却具有较
高的遗传多样性"
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金花茶的遗传多样性低于油茶)山茶等广布种!但高
于金花茶)杜鹃红山茶等濒危种与同样利用
E55F
技术对其他特有或濒危狭域分布的物种相比!如华
木莲*%$+)五针白皮松*%*+)天目木兰*%++等!毛瓣金花
茶的遗传多样性水平也处于较高水平毛瓣金花茶
虽然分布区极为狭窄!但遗传多样性仍保持在较高
水平!这可能与其进化历史有关!濒危植物并不一定
表现出低的遗传多样性*%-)%(+
+&
西
!
北
!
植
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物
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学
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多样性!各居群的遗传多样性
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遗传分化程度较低
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活型)分布范围等
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个因素对居群遗传变异水平有
明显的影响!而影响居群遗传结构的最重要因素是
繁育系统方式和基因交流的程度毛瓣金花茶居群
水平较高的遗传多样性和居群间较低的遗传分化可
能与其异交型繁育系统和鸟类传粉有关毛瓣金花
茶为异交物种!有着极高的自交不亲和性"未发表资
料#!这样的繁育系统有利于维持居群较高的遗传多
样性!同时促进居群内基因交流!减少遗传漂变的发
生毛瓣金花茶的主要传粉者为叉尾太阳鸟
"
A+1#7
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#"未发表资料#!其传粉距离
较远!毛瓣金花茶分布范围十分狭窄!个别居群间的
地理距离不足
#]9
!这样的传粉模式可以有效促进
居群间的基因交流!防止遗传分化的产生
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抵制遗传漂变的作用!同时也可以防止发生居群间
的分化&若
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#
!则遗传漂变可导致居群间明显
的遗传分化本研究中!
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9
为
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!表明毛瓣
金花茶居群间有较高的基因流!这可有效防止居群
间的遗传分化
根据居群间的遗传距离!
+
个毛瓣金花茶居群可
分为两类!
bb
)
_7
和
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居群聚为一类!
4_
)
5`
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聚为一类这与各居群间的地理距离有一定关
系!即地理上相近的居群遗传相似度高
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分析
也表明毛瓣金花茶居群间的遗传距离和地理距离之
间存在显著正相关关系"
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!
!
#
","*
#这
可能与毛瓣金花茶依靠鸟类传粉有关!地理距离相
近的居群!传粉鸟类在居群间的传粉可能更多!基因
交流更频繁!居群间的遗传相似度更大这与濒危
植物延龄草*$"+)永瓣藤*$#+的研究结果类似
近年来!野外毛瓣金花茶人为挖取)采盗现象极
为严重!除龙虎山保护区核心区内毛瓣金花茶破坏
较轻外!其余大部分居群都受到极为严重的破坏!居
群个体数量进一步缩小!许多居群个体数量可能不
足
!"
株!居群个体数量的进一步减少无疑将加剧遗
传漂变和近交的影响!导致遗传变异的下降!同时增
加了随机灾难性事故导致居群灭绝的概率
?,<
!
毛瓣金花茶的保育策略
毛瓣金花茶虽然具有较高的遗传多样性!但其
分布范围和居群数量相对于其他濒危物种仍非常有
限!如果不能有效维持居群大小和自然更新!同样可
能引起居群的退化甚至灭绝!使物种的濒危程度加
剧笔者认为应采取以下保育策略$"
#
#加强就地保
护毛瓣金花茶野生居群数量少!目前仅分布在隆
安和大新两县交界处不到
#""]9
! 范围内!已发现
的居群数量为
#"
个左右!且已有数个居群野外灭
绝因此!对现有每一个居群的保护都相当重要!任
何一个居群的丧失都将导致遗传变异的流失目前
已建立的广西龙虎山自然保护区!是毛瓣金花茶保
护的一个重要机构!保护区核心区内的保护相对较
好!但在保护区外!仍有数个居群!尤其是分布于大
新的居群还未得到保护!因此!有必要建立保护小
区!把保护任务具体落实到乡)村!责任到户"
!
#积
极实施迁地保护目前!广西已有广西植物研究所)
南宁市金花茶公园)广西防城金花茶国家级自然保
护区)广西林科院等单位对其进行了迁地保护!但保
存的成年植株数量大都不足
#"
株!且大多通过扦插
繁殖而来!还不足以保存其遗传多样性结合毛瓣
金花茶居群分化程度较小的特点!可在少数居群内
取尽可能多的样品"种子或采枝扦插#!保证该物种
绝大部分的遗传多样性得到保存"
%
#进行引种回
归毛瓣金花茶居群个体数量少!且结实率低!居群
自然更新能力很弱!有必要野外采集种子进行人工
繁育!长成幼树后回迁到其野生居群中
参考文献"
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中国科学院中国植物志编辑委员会
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中国植物志*
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