全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４３(３): ２８６￣２９３(２０１３)
收稿日期: ２０１２￣０３￣０６ꎻ 修回日期: ２０１３￣０４￣１０
基金项目: 国家葡萄产业技术体系建设项目(ＣＡＲＳ￣３０￣ｂｃ￣３)
通讯作者: 董雅凤ꎬ研究员ꎬ主要从事落叶果树病毒研究ꎻ Ｔｅｌ:０４２９￣３５９８２７８ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｙｆｄｏｎｇ＠１６３. ｃｏｍ
第一作者: 范旭东ꎬ男ꎬ河南周口人ꎬ助理研究员ꎬ主要从事落叶果树病毒研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｆｘｄ８２＠ｓｉｎａ. ｃｏｍꎮ
沙地葡萄茎痘相关病毒的 ＲＴ￣ＬＡＭＰ检测方法
范旭东ꎬ 董雅凤∗ꎬ 张尊平ꎬ 任 芳ꎬ 胡国君ꎬ 朱红娟
(中国农业科学院果树研究所国家落叶果树脱毒中心ꎬ 兴城 １２５１００)
摘要:本研究建立了一种用于沙地葡萄茎痘相关病毒(Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ ｓｔｅｍ ｐｉｔｔｉｎｇ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓꎬ ＧＲＳＰａＶ)的 ＲＴ￣ＬＡＭＰ
检测方法ꎮ 以 ＧＲＳＰａＶ的 ＲｄＲｐ基因序列(ＧｅｎＢａｎｋ登录号:ＧＱ４７８３１４)为靶序列ꎬ设计 ３组 ＲＴ￣ＬＡＭＰ引物ꎬ从中筛选出 １ 组
有效引物ꎬ并确定了适宜的反应温度和反应时间ꎮ 对 ＲＴ￣ＬＡＭＰ产物进行 ＨｈａⅠ酶切ꎬ酶切片段与理论片段大小一致ꎬ证明了
ＲＴ￣ＬＡＭＰ产物的特异性ꎮ ＲＴ￣ＬＡＭＰ方法能够检测出 ＧＲＳＰａＶ的 ＲＮＡ最大稀释倍数为 １０ －４ꎬ与 ＲＴ￣ＰＣＲ 方法相比更为灵
敏ꎮ 田间葡萄样品 ＲＴ￣ＬＡＭＰ检测结果与已知样品带毒情况相同ꎬ表明 ＲＴ￣ＬＡＭＰ检测 ＧＲＳＰａＶ具有较好的可靠性ꎮ 在 ＲＴ￣
ＬＡＭＰ反应产物中加入染料 ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎⅠ( ×１０００)可直接观察反应结果ꎮ 建立的ＧＲＳＰａＶ ＲＴ￣ＬＡＭＰ检测方法具有简便、快
速、灵敏、可视化等特点ꎬ尤其适合基层使用ꎬ具有良好的应用前景ꎮ
关键词:沙地葡萄茎痘相关病毒ꎻ 逆反转录环介导恒温扩增技术ꎻ 快速检测ꎻ 反转录聚合酶链式反应
ＲＴ￣ＬＡＭＰ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ ｓｔｅｍ ｐｉｔｔｉｎｇ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ
ＦＡＮ Ｘｕ￣ｄｏｎｇꎬ ＤＯＮＧ Ｙａ￣ｆｅｎｇꎬ ＺＨＡＮＧ Ｚｕｎ￣ｐｉｎｇꎬ ＲＥＮ Ｆａｎｇꎬ ＨＵ Ｇｕｏ￣ｊｕｎꎬ ＺＨＵ Ｈｏｎｇ￣ｊｕａｎ　 (Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎ￣
ｔｅｒ ｆｏｒ Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ Ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ Ｄｅｃｉｄｕｏｕｓ Ｆｒｕｉｔ ＴｒｅｅꎬＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｏｍｏｌｏｇｙꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ
Ｘｉｎｇｃｈｅｎｇ １２５１００ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｈｅ ＲＴ￣ＬＡＭＰ ａｓｓａｙ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ ｓｔｅｍ ｐｉｔｔｉｎｇ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ
(ＧＲＳＰａＶ) . Ｔｈｒｅｅ ｓｅｔｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＧＲＳＰａＶ ＲｄＲｐ ｇｅｎｅ(ＧｅｎＢａｎｋ: ＧＱ４７８３１４)
ｆｏｒ ＲＴ￣ＬＡＭＰ ａｓｓａｙ. Ｏｎｅ ｆｅａｓｉｂｌｅ ｓｅｔ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗａｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｉｍｅｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ ＲＴ￣ＬＡＭＰ ｒｅａｃｔｉｏｎ. Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ＲＴ￣ＬＡＭＰ ｗｅｒｅ ｃｕｔ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ＨｈａⅠꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒａｇ￣
ｍｅｎｔｓ ｈａｄ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｓｉｚｅｓ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ＲＴ￣ＬＡＭＰ ｔｈｅｏｒｙ. Ｔｈｅ ｍａｘｉｍａｌ ｄｉｌｕｔｅｄ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ＲＮＡ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＲＴ￣
ＬＡＭＰ ｗａｓ １０ －４ꎬ ｓｏ ｔｈｅ ＲＴ￣ＬＡＭＰ ａｓｓａｙ ｈａｓ ｍｏｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｈａｎ ｔｈｅ ＲＴ￣ＰＣＲ ａｓｓａｙ. Ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｏｒ
ＧＲＳＰａＶ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆｉｅｌｄ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＲＴ￣ＬＡＭＰ ａｎｄ ＲＴ￣ＰＣＲ ａｓｓａｙꎬ ｓｕｇ￣
ｇｅｓｔｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＲＴ￣ＬＡＭＰ ｉｎ ＧＲＳＰａＶ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ. Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅꎬ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｏｂｓｅｒｖｅｄ
ｂｙ ｎａｋｅｄ￣ｅｙｅｓ ａｆｔｅｒ ａｄｄｉｎｇ ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎⅠ( ×１ ０００) ｉｎｔｏ ＲＴ￣ＬＡＭＰ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ ｏｍｉｔｔｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ. Ｔｈｅ
ＲＴ￣ ＬＡＭＰ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｐｐｅａｒｅｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｏｆ ｓｉｍｐｌｅꎬ ｑｕｉｃｋꎬｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｖｉｓｕａｌ. Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｆｉｔ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ
ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｔｏ ｖｉｒｕｓｅｓꎬ ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｗｈｉｃｈ ｌａｃｋｉｎｇ ｏｆ ｓｐｅｃｉａｌ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔｓꎬ ａｎｄ ｓｈｏｗｉｎｇ ｇｏｏｄ ｄｅｖｅ￣
ｌｏｐｍｅｎｔ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ ｓｔｅｍ ｐｉｔｔｉｎｇ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓꎻ ＲＴ￣ＬＡＭＰꎻ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎꎻ ＲＴ￣ＰＣＲ
中图分类号: Ｓ４３２. ４１　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１３)０３￣０２８６￣０８
　 　 葡萄皱木复合病(Ｒｕｇｏｓｅ ｗｏｏｄ ｃｏｍｐｌｅｘ ｄｉｓ￣
ｅａｓｅ)是一种发生普遍、危害严重的葡萄病毒病ꎮ
依其在指示植物上的症状表现分为四种主要类型:
葡萄栓皮病、‘Ｋｏｂｅｒ ５ＢＢ’茎沟病、‘ＬＮ３３’茎沟病
和沙地葡萄茎痘病ꎮ 该病导致葡萄嫁接不亲和ꎬ开
花延迟ꎬ生长衰退ꎬ甚至死亡[１ꎬ２]ꎮ 沙地葡萄茎痘
　
　 ３ 期 　 　 范旭东ꎬ等:沙地葡萄茎痘相关病毒的 ＲＴ￣ＬＡＭＰ检测方法
相关病毒(Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ ｓｔｅｍ ｐｉｔｔｉｎｇ￣ａｓｓｏｃｉａｔ￣
ｅｄ ｖｉｒｕｓꎬＧＲＳＰａＶ)和沙地葡萄茎痘相关病毒￣１
(Ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ ｓｔｅｍ ｐｉｔｔｉｎｇ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ￣１ꎬＲＳＰａＶ￣
１)于 １９９８ 年被确认为是葡萄皱木复合病的病原之
一ꎬ并分别测序和命名ꎮ 序列分析表明这两个病毒
基因序列具有较高的同源性ꎬ属于同一种病
毒[３ꎬ４]ꎮ Ｍａｒｔｅｌｌｉ等根据其特性及基因组结构ꎬ把
它归于新确立的凹陷病毒属 ( Ｆｏｖｅａｖｉｒｕｓ) [５]ꎮ
ＧＲＳＰａＶ广泛分布于世界葡萄产区ꎬ研究者通过对
大量表现茎痘症状的葡萄样品进行 ＲＴ￣ＰＣＲ检测ꎬ
表明了 ＧＲＳＰａＶ 与沙地葡萄茎痘症状密切相
关[２ꎬ３ꎬ４ꎬ６ꎬ７]ꎮ 另有研究表明ꎬＧＲＳＰａＶ 与“Ｓｙｒａｈ”葡
萄衰退病[８ꎬ９]以及Ｒｉｃｈｔｅｒ １１０葡萄叶脉坏死症也有
着显著的相关性[１０]ꎮ 最近的研究发现ꎬ发生在美
国密苏里州的酿酒葡萄霞多丽的脉明症状也与包
括 ＧＲＳＰａＶ在内的病毒混合侵染有关[１１]ꎮ
目前ꎬ检测 ＧＲＳＰａＶ 的方法主要有指示植物
法、酶联免疫吸附法(ＥＬＩＳＡ)、ＲＴ￣ＰＣＲ 和实时荧
光 ＰＣＲ等方法ꎮ 由于 ＧＲＳＰａＶ不能接种到草本寄
主上ꎬ病毒粒子难以分离纯化ꎬ只能依靠在细菌中
表达的外壳蛋白免疫兔子来获得多克隆抗体ꎬ其抗
体的 ＥＬＩＳＡ检测效果受注射兔子的蛋白的质量差
异而有所不同ꎬ其灵敏度低于 ＲＴ￣ＰＣＲ 方法[１２ꎬ１３]ꎮ
ＲＴ￣ＰＣＲ法具有快速、高效、灵敏的特点ꎬ广泛运用
于 ＧＲＳＰａＶ的检测[１４ꎬ１５]ꎬ但该法需要专门的实验
人员和仪器才能进行ꎮ 实时荧光 ＰＣＲ 法在 ＰＣＲ
的基础上ꎬ实现了封闭式实时检测ꎬ具有较高的
灵敏度ꎬ已运用于包括 ＧＲＳＰａＶ 在内的多种葡萄
病毒检测[１６] ꎬ但是该方法需要依赖于昂贵的实时
荧光 ＰＣＲ仪ꎬ并需合成探针ꎬ不适合基层单位应
用ꎮ
逆转录环介导恒温扩增技术 (ＲＴ￣Ｌｏｏｐ￣Ｍｅｄｉ￣
ａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬＲＴ￣ＬＡＭＰ)是一种新
颖的恒温核酸扩增方法ꎮ 该方法利用特异地识别
靶序列上 ６ 个区域的 ４ 条引物及具有链置换活性
的 Ｂｓｔ ＤＮＡ 聚合酶ꎬ在 ６０ ~ ６５ ℃进行核酸的指数
级扩增ꎬ其扩增效率可达到 １０９ ~ １０１０个拷贝数量
级ꎬ整个反应仅需 １ ｈ[１７]ꎮ 目前ꎬＲＴ￣ＬＡＭＰ已经应
用于一些植物病毒的快速检测[１８ꎬ１９]ꎬ但在葡萄病
毒检测上的应用ꎬ国内外尚未见报道ꎬ本文旨在建
立一种能够检测 ＧＲＳＰａＶ的 ＲＴ￣ＬＡＭＰ方法ꎬ该方
法以总 ＲＮＡ为模板ꎬ以 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ染料为显色
剂ꎬ无需专门仪器ꎬ即可直接观察检测结果ꎬ具有简
便、快速、灵敏的特点ꎮ
１　 材料与方法
１. １　 材料
２０１０ 年 １１ 月从辽宁省兴城市中国农科院果
树研究所国家落叶果树脱毒中心毒源保存圃采集
葡萄休眠枝条ꎬ经 ＧＲＳＰａＶ 特异性引物进行 ＲＴ￣
ＰＣＲ检测ꎬ确定其携带 ＧＲＳＰａＶ 的情况ꎬ保存于
４℃冰箱备用ꎮ
１. ２　 主要仪器和试剂
恒温水浴锅为美国 Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ 公司生产的
９０１２ 型ꎮ Ｂｓｔ ＤＮＡ 聚合酶购自 ＮＥＢ 公司ꎻ甜菜
碱、２５ ｍｍｏｌ / Ｌ氯化镁购自 Ｓｉｇｍａ 公司ꎻＭ￣ＭＬＶ、
ＡＭＶ 逆反转录酶购自 Ｐｒｏｍｅｇａ 公司ꎻ ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ Ⅰ (１０ ０００ × )购自 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司ꎮ 内切酶
ＨｈａⅠ(ＧＣＧＣ)购自 Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司ꎮ
参照本实验室测定的 ＧＲＳＰａＶ 的 ＲｄＲｐ 基因
序列 (ＧｅｎＢａｎｋ 登录号为 ＧＱ４７８３１４)ꎬ利用 ＲＴ￣
ＬＡＭＰ引物设计软件 Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ４ (ｈｔｔｐ: / /
ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｌｏｒｅｒ. ｊｐ / ｅｌａｍｐ４. ０. ０ / ｉｎｄｅｘ. ｈｔｍｌ)ꎬ设计 ３
组 ＲＴ￣ＬＡＭＰ 引物(ⅠꎬⅡꎬⅢ) (见表 １)ꎮ 另外ꎬ
ＧＲＳＰａＶ ＲＴ￣ＰＣＲ 引物采用 ＲＳＰ５２ 和 ＲＳＰ５３[１４]ꎬ
序列见表 １ꎬ扩增片段大小为 ９０５ ｂｐꎮ 上述所有引
物均由上海生工生物工程技术服务公司合成ꎮ
１. ３　 ＲＮＡ提取及 ＲＴ￣ＰＣＲ
刮取葡萄韧皮部组织 １００ ｍｇꎬ采用二氧化硅
吸附法[２０]进行总 ＲＮＡ提取ꎮ 逆转录在 １. ５ ｍＬ消
毒离心管中进行ꎬ依次加入灭菌纯水 ９. ０ μＬ、６ 聚
体随机引物(上海生工生物工程技术服务公司合
成)１. ０ μＬ、总 ＲＮＡ ２. ０ μＬꎬ离心混匀ꎬ９５℃水浴 ５
ｍｉｎꎬ冰上放置 ２ ｍｉｎꎻ加入 ５ ｘＭ￣ＭＬＶ ｂｕｆｆｅｒ ５. ０
μＬ、１０ ｍｍｏｌ / Ｌ ｄＮＴＰｓ １. ５ μＬ、２００ Ｕ / ｍＬ Ｍ￣ＭＬＶ
逆转录酶 ０. ８ μＬ、灭菌纯水 ２. ７ μＬꎬ３７℃水浴 １０
ｍｉｎꎬ４２℃水浴 ５０ ｍｉｎꎬ７０℃水浴 ５ ｍｉｎꎮ 合成的
ｃＤＮＡ立即进行 ＰＣＲ扩增或 －２０℃保存备用ꎮ
ＰＣＲ反应体系为 ２５ μＬꎬ含 １０ × Ｔａｑ 酶 ｂｕｆｆｅｒ
２. ５ μＬ、１０ μｍｏｌ / Ｌ ｄＮＴＰｓ ０. ５ μＬ、１０ μｍｏｌ / Ｌ引物
７８２
　
植物病理学报 ４３ 卷
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ＲＴ￣ＬＡＭＰ ａｎｄ ＲＴ￣ＰＣＲ ｏｆ Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ
ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ ｓｔｅｍ ｐｉｔｔｉｎｇ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ(５￣３)
Ⅰ
ＲＳＰ￣１￣Ｆ３ ＣＡＴＴＴＧＧＧＡＡＡＧＧＡＴＣＴＧＣ
ＲＳＰ￣１￣Ｂ３ ＧＣＡＣＣＴＣＡＴＣＴＴＧＴＧＣＴＴ
ＲＳＰ￣１￣ＦＩＰ(Ｆ１ｃ ＋ Ｆ２) ＧＣＡＴＡＡＧＡＣＡＣＣＴＣＡＡＴＴＧＣＧＴＡＡＴ￣ＡＴＴＧＣＴＡＧＧＧＡＡＡＴＧＧＧＴＡＡ
ＲＳＰ￣１￣ＢＩＰ(Ｂ１ｃ ＋ Ｂ２) ＣＡＧＡＣＴＴＧＧＧＧＡＡＴＴＧＴＣＴＡＴＡＧＧＣ￣ＡＴＴＧＣＧＡＡＣＣＡＧＧＡＡＡＣＧ
Ⅱ
ＲＳＰ￣２￣Ｆ３ ＧＣＡＡＴＴＧＡＧＧＴＧＴＣＴＴＡＴＧＣ
ＲＳＰ￣２￣Ｂ３ ＡＣＡＣＣＡＴＧＣＣＡＡＡＣＡＣＴＴ
ＲＳＰ￣２￣ＦＩＰ(Ｆ１ｃ ＋ Ｆ２) ＣＡＣＧＣＡＧＴＴＡＴＡＡＴＧＣＧＣＴＴＣＡＡ￣ＣＴＴＧＧＧＧＡＡＴＴＧＴＣＴＡＴＡＧＧＣ
ＲＳＰ￣２￣ＢＩＰ(Ｂ１ｃ ＋ Ｂ２) ＣＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＴＣＧＣＡＡＴＡＡＧＣ￣ＣＣＴＡＡＡＣＡＡＴＡＡＣＴＴＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣ
Ⅲ
ＲＳＰ￣３￣Ｆ３ ＴＧＣＴＡＧＧＧＡＡＡＴＧＧＧＴＡＡＣ
ＲＳＰ￣３￣Ｂ３ ＣＡＡＴＡＡＣＴＴＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＧＡＡ
ＲＳＰ￣３￣ＦＩＰ(Ｆ１ｃ ＋ Ｆ２) ＡＴＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＣＣＡＡＧＴＣＴＧＴＡＡＧ￣ＧＡＣＡＡＴＴＧＣＡＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＣＧ
ＲＳＰ￣３￣ＢＩＰ(Ｂ１ｃ ＋ Ｂ２) ＣＧＴＧＡＴＧＡＣＴＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＴＴ￣ＴＧＡＧＣＡＣＣＴＣＡＴＣＴＴＧＴＧ
ＲＳＰ５２ / ５３
ＲＳＰ ５２ ＣＧＣＴＡＧＧＧＣＴＧＴＧＧＡＡＧＴＡＴＴ
ＲＳＰ ５３ ＧＴＴＧＴＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＡＧＡＴＡＴ
(ＲＳＰ５２ / ＲＳＰ５３)各 ０. ５ μＬ、５ Ｕ / Ｌ Ｔａｑ酶 ０. ５ μＬ、
模板 ｃＤＮＡ ２. ５ μＬ、灭菌纯水 １８ μＬꎮ ＰＣＲ反应程
序为:９４℃ ５ ｍｉｎꎻ９４℃ ４０ ｓꎬ５６℃ ４５ ｓꎬ７２℃ １ ｍｉｎꎬ
循环 ３５ 次ꎻ７２℃ ７ ｍｉｎꎻ４℃终止反应ꎮ
１. ４　 ＲＴ￣ＬＡＭＰ体系的建立
采用表 １ 中三组引物(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)分别在 ６０、
６１. ５、６３、６４. ５ 和 ６６℃对 ＧＲＳＰａＶ阳性葡萄样品进
行 ＲＴ￣ＬＡＭＰ反应ꎬ确定适宜的引物和反应温度ꎮ
设Ｍｇ２ ＋终浓度为 ２、３、４、６、８、１０ ｍｍｏｌ / Ｌ进行 ＲＴ￣
ＬＡＭＰ反应ꎬ通过琼脂糖电泳确定 Ｍｇ２ ＋ 最佳浓
度ꎮ 基本反应体系为(２５ μＬ)包括 １ × Ｔｈｅｒｏｂｕｆｆｅｒ
(含 ２ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｍｇ２ ＋ )、Ｆ３ 和 Ｂ３ 各 ０. ４ μｍｏｌ / Ｌ、
ＦＩＰ 和 ＢＩＰ 各 ２. ４ μｍｏｌ / Ｌ、 Ｍｇ２ ＋ 终浓度为 ３
ｍｍｏｌ / Ｌ(加入 ＭｇＣｌ２)、甜菜碱 １ ｍｏｌ / Ｌ、ｄＮＴＰｓ 混
合液 １. ４ ｍｍｏｌ / Ｌ、Ｂｓｔ ＤＮＡ聚合酶 １２ Ｕ、ＡＭＶ 反
转录酶 １０ Ｕ、ＲＮＡ ２ μＬꎬ反应 １ ｈꎬ８０℃ ５ ｍｉｎ终止
反应ꎮ
反应时间设定:采用筛选好的 ＲＴ￣ＬＡＭＰ 引物
及适宜的温度条件ꎬ反应体系同上ꎬ将反应时间设
１５、３０、４５、６０、７５、９０ 和 １０５ ｍｉｎ ７ 个处理ꎬ每处理
依次递增 １５ ｍｉｎꎮ
１. ５　 ＲＴ￣ＬＡＭＰ产物判定方法
跑胶:取 ＲＴ￣ＬＡＭＰ产物 ５ Ｌꎬ 在 ２. ５％琼脂糖
凝胶中进行电泳ꎬ经 ＥＢ 染色后ꎬ若出现连续阶梯
状条带ꎬ则判定为阳性ꎮ
直接染色法:加入 ０. ５ Ｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ( ×
１ ０００)染料ꎬ肉眼观察反应液是否发生颜色变化ꎬ
阳性呈翠绿色ꎬ而阴性为淡橙色ꎮ
１. ６　 ＲＴ￣ＬＡＭＰ产物的酶切鉴定
用 ＤＮＡＣＬＵＢ 软件分析 ＧＲＳＰａＶＲＴ￣ＬＡＭＰ
目的片段中的酶切位点ꎬ并筛选出单一的 ＨｈａⅠ酶
切位点(ＧＣＧＣ)(图 １)ꎬ根据 ＲＴ￣ＬＡＭＰ 扩增产物
特点[１７]ꎬ理论酶切产物应为 ７６、１１９、１２１、１５２ 和
２４８ ｂｐ大小的混合片段ꎮ ２０ μＬ 酶切反应体系中
含 Ｈｈａ Ⅰ１０ Ｕ、１０ ×缓冲液 ２ μＬ、ＲＴ￣ＬＡＭＰ 产物
５ μＬꎬ３７℃反应 ５ ｈ 后ꎬ取 ５ μＬ 的酶切产物在
２􀆰 ５％琼脂糖凝胶中电泳鉴定ꎮ
１. ７　 ＲＴ￣ＬＡＭＰ和 ＲＴ￣ＰＣＲ灵敏度测验
将从葡萄样品中提取的总 ＲＮＡ 依次稀释至
１０ －１ ~ １０ －７倍ꎬ分别采用 ＲＴ￣ＬＡＭＰ 和曾经报道的
ＲＴ￣ＰＣＲ技术[１５]进行检测ꎬ对两种方法的检测结
果进行分析ꎮ
８８２
　
　 ３ 期 　 　 范旭东ꎬ等:沙地葡萄茎痘相关病毒的 ＲＴ￣ＬＡＭＰ检测方法
Ｆｉｇ. １　 Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ＲＴ￣ＬＡＭＰ ｏｆ ＧＲＳＰａＶ
Ｔｈｅ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ＧＲＳＰａＶ ＲｄＲｐ ｇｅｎｅ
Ｉｔａｌｉｃ ｓｈｏｗｓ ｔｈｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｈａ Ⅰ ｓｉｔｅ.
１. ８　 ＲＴ￣ＬＡＭＰ特异性检测
对 １５ 个已知带毒情况的田间葡萄样品 ＲＮＡ
进行 ＧＲＳＰａＶ ＲＴ￣ＬＡＭＰ 检测(设阴性和阳性对
照)ꎬＲＴ￣ＬＡＭＰ 扩增产物经 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ⅰ( ×
１０００)染色ꎬ肉眼判断反应结果ꎬ并采用 ２. ５％琼脂
糖凝胶电泳进行验证ꎮ 将 ＲＴ￣ＬＡＭＰ 检测结果与
以往 ＲＴ￣ＰＣＲ检测结果比较ꎬ明确 ＲＴ￣ＬＡＭＰ 检测
ＧＲＳＰａＶ的特异性ꎮ
２　 结果与分析
２. １　 ＲＴ￣ＬＡＭＰ反应体系建立
采用 ３ 组引物(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)分别在 ６０、６１. ５、
６３、６４. ５ 和 ６６℃对含 ＧＲＳＰａＶ的 ＲＮＡ进行扩增 １
ｈꎬ结果显示只有第Ⅲ组引物在 ６０、６１. ５ 和 ６３℃时
有 ＲＴ￣ＬＡＭＰ阶梯状条带出现(图 １)ꎮ 第Ⅲ组引
物在 ６０、６１. ５ 和 ６２℃反应ꎬ获得的 ＲＴ￣ＬＡＭＰ阶梯
状条带亮度基本一致ꎬ说明在这 ３ 个温度下
ＲＴ￣ＬＡＭＰ扩增效率差别不大ꎬ本研究选择中间温
度 ６１. ５℃作为反应温度ꎬ后来的结果也表明在
６１􀆰 ５℃下 ＲＴ￣ＬＡＭＰ均有较好的扩增(图 ２)ꎮ
　 　 分别设置反应时间为 １５、３０、４５、６０、７５、９０ 和
１０５ ｍｉｎꎬ采用第Ⅲ组引物进行 ＧＲＳＰａＶ 的 ＲＴ￣
ＬＡＭＰ 反应ꎬ ＲＴ￣ＬＡＭＰ 产物直接加入 ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ Ⅰ染色ꎬ与电泳结果完全一致ꎬ表明该 ＲＴ￣
ＬＡＭＰ反应进行到 ４５ ｍｉｎ 之后有明显的扩增反
应ꎬ反应时间最终定为 １ ｈ(图 ２￣Ａ、图 ２￣Ｂ)ꎮ
另外ꎬ本文对 Ｍｇ２ ＋浓度对程序进行了优化ꎬ
当 Ｍｇ ＋浓度在 ３、４ 和 ６ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ －１时有明显的阶
梯状条带ꎬ无明显区别ꎬ最终将 Ｍｇ２ ＋浓度定为 ３
ｍｍｏｌ􀅰Ｌ －１ꎮ 最后确定反应程序如下:１ × Ｔｈｅｒｏ￣
ｂｕｆｆｅｒ(含 ２０ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｍｇ２ ＋ )、 Ｆ３ 和 Ｂ３ 各 ０. ４
μｍｏｌ / Ｌ、 ＦＩＰ和 ＢＩＰ 各 ２. ４ μｍｏｌ / Ｌ、Ｍｇ２ ＋终浓度
为 ３ ｍｍｏｌ / Ｌ(含 ２５ ｍｍｏｌ / Ｌ ＭｇＣｌ２ １μＬ)、甜菜碱
１ ｍｍｏｌ / Ｌ、ｄＮＴＰ混合液 １. ４ ｍｍｏｌ / Ｌ、Ｂｓｔ ＤＮＡ 聚
合酶 １２ ＵꎬＡＭＶ 反转录酶 １０ Ｕꎬ加水补足 ２３ μＬ ꎬ
加 ＲＮＡ ２ μＬꎬ６１. ５℃反应 １ ｈꎬ８０℃ ５ ｍｉｎ 终止
反应ꎮ
Ｆｉｇ. １　 Ｔｈｅ ＲＴ￣ＬＡＭＰ ｒｅｓｕｌｔ ｕｓｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｉｍｅｒ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
Ｍ:Ｍａｒｋ￣Ｄ(ｓｈｅｎｇｇｏｎｇ)ꎻⅠꎬ Ⅱꎬ Ⅲ: Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＬＡＭＰ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ＧＲＳＰａＶꎻ
１￣５:６０ꎬ ６１. ５ꎬ６３ꎬ６４. ５ 和 ６６℃( ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ) .
９８２
　
植物病理学报 ４３ 卷
Ｆｉｇ. ２　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ ｔｈｅ ＬＡＭＰ ａｓｓａｙ ａｔ ６１. ５℃
Ａ:Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔꎻＢ:ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ⅰ ｄｙｅ ｒｅｓｕｌｔꎻ Ｍ:Ｍａｒｋ￣Ｄ (ｓｈｅｎｇｇｏｎｇ) ꎻ
Ｌａｎｅｓ １￣７: １５、３０、４５、６０、７５、９０、１０５ ｍｉｎ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
２. ２　 ＲＴ￣ＬＡＭＰ产物酶切鉴定
采用限制内切酶 ＨｈａⅠ (ＧＣＧＣ) 对 ＧＲＳＰａＶ
的 ＲＴ￣ＬＡＭＰ 产物进行酶切ꎬ酶切电泳结果除 ２５０
ｂｐ上有少许未切开片段外ꎬ２５０ ｂｐ 以下显示该酶
切片段有 ５ 个片段组成ꎬ约为 ７６、１１９、１２１ꎬ１５２ 和
２４８ ｂｐꎬ与理论值一致(图 ３)ꎮ
Ｆｉｇ. ３　 ＨｈａⅠ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ ＧＲＳＰａＶ ＲＴ￣ＬＡＭＰ
ｐｒｏｄｕｃｔ
Ｍ: Ｍａｒｋ￣Ｄ(ｓｈｅｎｇｇｏｎｇ)ꎻ １:Ｔｈｅ ＲＴ￣ＬＡＭＰ ｐｒｏｄｕｃｔꎻ ２:Ｔｈｅ
ＲＴ￣ＬＡＭＰ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｆｔｅｒ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＨｈａⅠ.
２. ３　 ＲＴ￣ＬＡＭＰ和 ＲＴ￣ＰＣＲ灵敏度测验结果
灵敏度测验结果显示ꎬＲＴ￣ＬＡＭＰ 能够检测出
ＧＲＳＰａＶ的 ＲＮＡ 最大稀释倍数为 １０ －４(图 ４￣Ａ)ꎬ
ＲＴ￣ＰＣＲ能够检测出 ＧＲＳＰａＶ的 ＲＮＡ最大稀释倍
数为 １０ －２(图 ４￣Ｂ)ꎮ 因此ꎬ结果表明本实验建立
的 ＲＴ￣ＬＡＭＰ法与先前建立的 ＲＴ￣ＰＣＲ 法相比ꎬ能
够对更低浓度的 ＲＮＡ进行检测ꎮ
２. ４　 特异性检测
以 ＧＲＳＰａＶ阴性、阳性样品为对照ꎬ对 １５ 个已
知带毒情况的葡萄样品 ＲＮＡ 进行 ＧＲＳＰａＶ ＲＴ￣
ＬＡＭＰ检测ꎬＲＴ￣ＬＡＭＰ产物经过直接染色和电泳
分析ꎬ结果显示ꎬＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ⅰ染色和电泳结果
吻合ꎬ其中 １ ~ ９ 号样品为阴性样品ꎬ１０ ~ １５ 号样
品为阳性样品ꎬ结果与这些样品已知带毒情况一
致ꎬ初步证明了该方法具有特异性(图 ５￣Ａ、Ｂ)ꎮ
３　 讨论
引物、反应温度、试剂在 ＲＴ￣ＬＡＭＰ 反应过程
中均起着重要作用[２１ꎬ２２ꎬ２３]ꎮ 不同引物其退火温度
及引物间序列碱基大小的不同ꎬ直接影响 ＲＴ￣
ＬＡＭＰ反应中茎环结构的形成[１７]ꎬ从而影响 ＲＴ￣
ＬＡＭＰ反应的成败ꎮ 本文针对 ＧＲＳＰａＶ 的 ＲｄＲｐ
基因设计了 ３ 套 ＲＴ￣ＬＡＭＰ 引物ꎬ结果显示第Ⅰ、
Ⅱ组引物在所测试的温度范围均无 ＲＴ￣ＬＡＭＰ 反
应ꎬ这可能由于这两套引物不适应 ＲＴ￣ＬＡＭＰ反应
特点导致的ꎮ 第Ⅲ套引物在不同温度下的 ＲＴ￣
ＬＡＭＰ 反应结果表明ꎬ在 ６０、６１. ５ 和 ６３℃反应
１ ｈ均能获得较好的ＲＴ￣ＬＡＭＰ阶梯状反应条带ꎬ
０９２
　
　 ３ 期 　 　 范旭东ꎬ等:沙地葡萄茎痘相关病毒的 ＲＴ￣ＬＡＭＰ检测方法
Ｆｉｇ. ４　 ＲＴ￣ＬＡＭＰ ａｎｄ ＲＴ￣ＰＣＲ ｆｏｒ ＧＲＳＰａＶ
Ａ: ＲＴ￣ＬＡＭＰ ｐｒｏｄｕｃｔｓꎻ Ｂ: ＲＴ￣ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓꎻ Ｍ: Ｍａｒｋ￣Ｄꎻ Ｎ: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ
Ｌａｎｅｓ １００ －１０ －７: Ｉｎｄｉｃａｔｅ １０￣ｆｏｌｄ ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ.
Ｆｉｇ. ５　 Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ⅰ ｄｙｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ
ＲＴ￣ＬＡＭＰ ｐｒｏｄｕｃｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆｌｉｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ
Ａ:Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔꎻＢ:ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ⅰ ｄｙｅ ｒｅｓｕｌｔꎻ Ｍ: Ｍａｒｋ￣Ｄ (ｓｈｅｎｇｇｏｎｇ)ꎻ
Ｎ: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻＰ: Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ１￣１５:Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ｆｉｅｌｄ.
各条带无明显差异ꎬ这可能与本实验 ＲＴ￣ＬＡＭＰ 所
用第Ⅲ引物、模板 ＲＮＡ 及试剂更倾向于在 ６０ ~
６３℃进行反应有关ꎮ ＲＮＡ 各稀释样本的 ＲＴ￣
ＬＡＭＰ反应条带在亮度上差异不明显ꎬ这也说明了
１９２
　
植物病理学报 ４３ 卷
ＲＴ￣ＬＡＭＰ反应特点ꎬ即在短时间内聚集大量的产
物[２２ꎬ２３]ꎮ 由于 ＲＴ￣ＬＡＭＰ反应效率很高ꎬ如果操作
不当会造成环境污染ꎬ一旦造成污染ꎬ检测结果将
不可靠ꎬ因此ꎬ试验时要严格进行实验分区ꎮ 目前ꎬ
日本生产的实时浊度检测仪的逐渐应用ꎬ使得 ＲＴ￣
ＬＡＭＰ实验前期能在封闭系统中反应和检测ꎬ能有
效避免污染ꎬ且对反应体系的进一步优化有很大帮
助ꎮ
全世界已明确分类的葡萄病毒有 ５８ 种[２４]ꎬ国
内已报道了 １１ 种ꎮ 培育葡萄无病毒母本树和苗
木ꎬ以及开展葡萄病毒种类调查时ꎬ均需要对这些
病毒进行检测ꎮ 目前ꎬ中国很多基层单位尚未建立
高级专门的实验室进行病毒的检测和监控ꎬ这不利
于葡萄病毒的防治ꎮ 因此迫切需要建立更为简单、
快速、灵敏的病毒检测方法ꎮ 自 ＲＴ￣ＬＡＭＰ法建立
以来[１７]ꎬ已有很多研究表明 ＲＴ￣ＬＡＭＰ 法具有高
特异性、高灵敏度、操作简单的特点ꎬ与 ＲＴ￣ＰＣＲ等
其他检测方法相比ꎬ具有一定的优越性[１８ꎬ １９ꎬ２１ ~ ２４]ꎮ
因此ꎬＲＴ￣ＬＡＭＰ法非常适合作为基层单位检测果
树病毒的工具ꎮ 为此ꎬ本文建立了能够快速、灵敏、
特异地对 ＧＲＳＰａＶ进行检测的 ＲＴ￣ＬＡＭＰ体系ꎬ该
法无需专门仪器ꎬ与先前检测 ＧＲＳＰａＶ 的 ＲＴ￣ＰＣＲ
法[１５]相比ꎬ优越性较为明显ꎮ ＲＴ￣ＬＡＭＰ法直接以
ＲＮＡ为模板ꎬ反应时间仅为 １ ｈꎬ以 ｃＤＮＡ 为模板
的二步 ＬＡＭＰ 方法[２４]相比更加简便、快速ꎬ适合
基层单位对大量样品进行 ＧＲＳＰａＶ 的检测ꎮ 另
外ꎬＲＴ￣ＬＡＭＰ依其强大的核酸扩增能力ꎬ将来如
果能应用于基因芯片检测ꎬ将在葡萄病毒的多重检
测领域具有广阔的前景ꎮ
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ｓｔｅｍ ｐｉｔｔｉｎｇ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ￣ １ ｒｅｖｅａｌ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｔｏ
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ｓｃａｌｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ
ｓｔｅｍ ｐｉｔｔｉｎｇ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ￣１ [ Ｊ] . Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２０００ꎬ １０６ꎬ ３１１ －３１８.
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ｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ ｓｔｅｍ ｐｉｔ￣
ｔｉｎｇ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｄｅｃｌｉｎｉｎｇ Ｓｙｒａｈ ｇｒａ￣
ｐｅｖｉｎｅｓ. Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙꎬ ２００６ꎬ １５１: １８８９ －
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ｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＲＮＡｓ ｆｒｏｍ ａ ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｓｈｏｗｉｎｇ
Ｓｙｒａｈ ｄｅｃｌｉｎｅ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃ￣
ｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｉｎｃｌｕｄｅｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｖｉｒｕｓ[ Ｊ] . Ｖｉｒｏｌｏｇｙꎬ ２００９ꎬ
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２９２
　
　 ３ 期 　 　 范旭东ꎬ等:沙地葡萄茎痘相关病毒的 ＲＴ￣ＬＡＭＰ检测方法
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责任编辑:曾晓葳
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