全 文 ：第 源员 卷摇 第 圆 期
圆园员源 年 源 月
植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报
粤悦栽粤 孕匀再栽韵孕匀再蕴粤悦陨悦粤 杂陨晕陨悦粤
灾燥造援 源员摇 晕燥援 圆
粤责则援 摇 圆园员源
摇
基金项目院 国家葡萄产业技术体系建设项目渊悦粤砸杂鄄猿园鄄遭糟鄄猿冤
作者简介院 朱红娟袁女袁员怨愿愿年生袁硕士研究生袁研究方向为果树病毒袁 耘鄄皂葬蚤造院 则葬灶藻则源员远苑岳 员远猿援 糟燥皂
鄢通讯作者渊粤怎贼澡燥则 枣燥则 糟燥则则藻泽责燥灶凿藻灶糟藻冤袁 耘鄄皂葬蚤造院 赠枣凿燥灶早岳 员远猿援 糟燥皂
收稿日期院 圆园员猿 原 员员 原 员愿
我国部分地区沙地葡萄茎痘相关病毒分离物
外壳蛋白序列变异分析
朱红娟摇 胡国君摇 范旭东摇 张尊平摇 任摇 芳摇 董雅凤鄢
渊中国农业科学院果树研究所袁国家落叶果树脱毒中心袁 辽宁 兴城 员圆缘员园园冤
摘要院 为明确我国葡萄中沙地葡萄茎痘相关病毒渊郧砸杂孕葬灾冤的感染情况及病毒外壳蛋白渊 糟燥葬贼
责则燥贼藻蚤灶袁悦孕冤基因的变异特点袁从而为其致病性尧病害的防治以及抗病毒基因工程等研究提供依据袁
本研究对采自我国 员远 个省市自治区的 远缘 个葡萄品种 猿园缘 株葡萄样品中的 郧砸杂孕葬灾 进行 砸栽鄄孕悦砸
检测袁根据地区与品种差异选取了 圆源 个阳性样品进行 糟责 基因克隆与测序分析袁并对不同 砸晕粤 提
取方法进行了比较遥 结果显示袁员员源 株样品被 郧砸杂孕葬灾 侵染袁平均带毒株率为 猿苑援 源豫 曰分离物间及
同一分离物不同克隆间的序列差异较大袁从 圆源 个分离物克隆获得的 猿苑 条 糟责 基因序列与来源于不
同国家的 员圆 个 郧砸杂孕葬灾分离物的核苷酸序列同源性为 愿园援 缘豫 耀怨怨援 苑豫 袁氨基酸序列同源性为 愿愿援
愿豫 耀员园园豫 曰各个分离物的遗传距离无明显地域差异曰杂蚤韵圆 吸附法比 杂阅杂法和 悦栽粤月法更适宜葡萄
样品 砸晕粤的提取遥
关键词院 沙地葡萄茎痘相关病毒曰 砸栽鄄孕悦砸检测曰 序列分析
郧藻灶藻贼蚤糟 增葬则蚤葬贼蚤燥灶 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 贼澡藻 糟燥葬贼 责则燥贼藻蚤灶 燥枣 郧则葬责藻增蚤灶藻 则怎责藻泽贼则蚤泽
泽贼藻皂 责蚤贼贼蚤灶早 葬泽泽燥糟蚤葬贼藻凿 增蚤则怎泽 蚤泽燥造葬贼藻泽 枣则燥皂 悦澡蚤灶葬
在澡怎 匀燥灶早躁怎葬灶摇 匀怎 郧怎燥躁怎灶摇 云葬灶 载怎凿燥灶早摇 在澡葬灶早 在怎灶责蚤灶早摇 砸藻灶 云葬灶早摇 阅燥灶早 再葬枣藻灶早鄢
渊晕葬贼蚤燥灶葬造 悦藻灶贼藻则 枣燥则 耘造蚤皂蚤灶葬贼蚤灶早 灾蚤则怎泽藻泽 枣则燥皂 阅藻糟蚤凿怎燥怎泽 云则怎蚤贼 栽则藻藻袁 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 孕燥皂燥造燥早赠袁 悦澡蚤灶藻泽藻
粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁 载蚤灶早糟澡藻灶早 员圆缘员园园袁 蕴蚤葬燥灶蚤灶早 孕则燥增蚤灶糟藻袁 悦澡蚤灶葬冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 栽燥 凿藻贼藻则皂蚤灶藻 贼澡藻 蚤灶枣藻糟贼蚤燥灶 泽蚤贼怎葬贼蚤燥灶 葬灶凿 糟燥葬贼 责则燥贼藻蚤灶 早藻灶藻 增葬则蚤葬灶贼 燥枣 郧则葬责藻增蚤灶藻 则怎责藻泽贼则蚤泽 泽贼藻皂
责蚤贼贼蚤灶早 葬泽泽燥糟蚤葬贼藻凿 增蚤则怎泽 渊郧砸杂孕葬灾冤 蚤灶 悦澡蚤灶葬袁 葬灶凿 责则燥增蚤凿藻 贼澡藻 遭葬泽蚤泽 枣燥则 贼澡藻 则藻泽藻葬则糟澡 燥枣 责葬贼澡燥早藻灶蚤糟蚤贼赠袁
凿蚤泽藻葬泽藻 糟燥灶贼则燥造 葬灶凿 葬灶贼蚤鄄增蚤则怎泽 早藻灶藻贼蚤糟 藻灶早蚤灶藻藻则蚤灶早袁 郧砸杂孕葬灾 蚤灶 猿园缘 早则葬责藻增蚤灶藻 泽葬皂责造藻泽 燥枣 远缘 增葬则蚤藻贼蚤藻泽 枣则燥皂
员远 则藻早蚤燥灶泽 憎藻则藻 凿藻贼藻糟贼藻凿 遭赠 砸栽鄄孕悦砸袁 葬灶凿 圆源 责燥泽蚤贼蚤增藻 泽葬皂责造藻泽 枣燥则 糟燥葬贼 责则燥贼藻蚤灶 早藻灶藻 泽藻择怎藻灶糟藻泽 葬灶葬造赠泽蚤泽
憎藻则藻 泽藻造藻糟贼藻凿 遭赠 燥则蚤早蚤灶泽 葬灶凿 增葬则蚤藻贼蚤藻泽袁 葬灶凿 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 砸晕粤 藻曾贼则葬糟贼蚤燥灶 皂藻贼澡燥凿泽 憎藻则藻 糟燥皂责葬则藻凿援 栽澡藻
凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 则藻泽怎造贼泽 燥枣 砸栽鄄孕悦砸 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 员员源 泽葬皂责造藻泽 憎藻则藻 蚤灶枣藻糟贼藻凿 憎蚤贼澡 郧砸杂孕葬灾袁 憎蚤贼澡 葬灶 葬增藻则葬早藻
蚤灶枣藻糟贼蚤燥灶 则葬贼藻 燥枣 猿苑援 源豫 援 杂藻择怎藻灶糟藻 葬造蚤早灶皂藻灶贼 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 泽藻择怎藻灶糟藻 增葬则蚤葬贼蚤燥灶泽 葬皂燥灶早 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 蚤泽燥造葬贼藻泽
葬灶凿 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 糟造燥灶藻泽 枣则燥皂 贼澡藻 泽葬皂藻 蚤泽燥造葬贼藻 憎藻则藻 增藻则赠 澡蚤早澡援 栽澡蚤则贼赠鄄泽藻增藻灶 糟造燥灶藻泽 枣则燥皂 圆源 蚤泽燥造葬贼藻泽 燥枣 郧砸杂孕葬灾
糟责 早藻灶藻 泽澡葬则藻凿 愿园援 缘豫 耀怨怨援 苑豫 灶怎糟造藻燥贼蚤凿藻 泽藻择怎藻灶糟藻 蚤凿藻灶贼蚤贼赠 葬灶凿 愿愿援 愿豫 耀员园园豫 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 泽藻择怎藻灶糟藻
蚤凿藻灶贼蚤贼赠 憎蚤贼澡 员圆 蚤泽燥造葬贼藻泽 枣则燥皂 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 糟燥怎灶贼则蚤藻泽援 孕澡赠造燥早藻灶藻贼蚤糟 葬灶葬造赠泽蚤泽 凿藻皂燥灶泽贼则葬贼藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 早藻灶藻贼蚤糟
凿蚤泽贼葬灶糟藻 葬皂燥灶早 葬造造 蚤泽燥造葬贼藻泽 澡葬凿 灶燥 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼 则藻早蚤燥灶葬造 凿蚤枣枣藻则藻灶糟藻泽援 悦燥皂责葬则葬贼蚤增藻造赠袁 贼澡藻 泽蚤造蚤糟葬鄄糟葬责贼怎则藻鄄
遭葬泽藻凿 藻曾贼则葬糟贼蚤燥灶 皂藻贼澡燥凿 憎葬泽 皂燥则藻 泽怎蚤贼葬遭造藻 枣燥则 砸晕粤 藻曾贼则葬糟贼蚤燥灶 枣则燥皂 早则葬责藻增蚤灶藻 贼澡葬灶 杂阅杂 葬灶凿 悦栽粤月
皂藻贼澡燥凿泽援
运藻赠 憎燥则凿泽院 郧则葬责藻增蚤灶藻 则怎责藻泽贼则蚤泽 泽贼藻皂 责蚤贼贼蚤灶早 葬泽泽燥糟蚤葬贼藻凿 增蚤则怎泽曰 砸栽鄄孕悦砸 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶曰 泽藻择怎藻灶糟藻 葬灶葬造赠泽蚤泽
摇 摇 葡萄皱木复合病渊 则怎早燥泽藻 憎燥燥凿 糟燥皂责造藻曾 凿蚤泽藻葬泽藻袁
砸宰冤是一种在世界范围内发生普遍尧危害严重的葡
萄病毒病遥 根据其在 猿 种不同指示植物上的症状表
现袁可分为沙地葡萄茎痘病渊砸怎责藻泽贼则蚤泽 泽贼藻皂 责蚤贼贼蚤灶早袁
砸杂孕冤尧野运燥遭藻则 缘月月冶茎沟病尧野蕴晕猿猿冶茎沟病和葡萄
栓皮病遥 研究表明袁沙地葡萄茎痘病是最为普遍的
一种病害咱员暂 袁一般不表现症状袁但以沙地葡萄为砧
木时袁会造成嫁接口部位逐渐坏死袁嫁接愈合后袁愈
合部位膨大袁植株长势衰弱袁树体矮小袁树皮粗糙且
木栓化袁在木质部和树皮形成层能观察到纵向突起
和凹槽袁感病植株产量下降袁有些植株在栽植后数年
内就会逐渐衰退直至死亡咱圆暂 遥
酝藻灶早等咱猿暂和 在澡葬灶早等咱源暂于 员怨怨愿 年分别从提取
的感病植株 凿泽砸晕粤 中克隆到病毒的全基因组核苷
酸序列袁命名为沙地葡萄茎痘相关病毒渊郧则葬责藻增蚤灶藻
则怎责藻泽贼则蚤泽 泽贼藻皂 责蚤贼贼蚤灶早 葬泽泽燥糟蚤葬贼藻凿 增蚤则怎泽袁郧砸杂孕葬灾冤袁此后袁
该病毒与 砸杂孕的相关研究逐渐展开遥 郧砸杂孕葬灾隶属
凹陷病毒属 云燥增藻葬增蚤则怎泽袁病毒粒子细丝状袁螺旋对称袁
长度约 愿园园 灶皂袁直径 员圆 灶皂袁为单链正义 砸晕粤 病毒袁
基因组长约 愿援 源 耀 怨援 猿 噪遭袁含有 缘 个开放阅读框袁分
别编码复制酶 渊 则藻责造蚤糟葬泽藻冤尧三基因框 渊 贼则蚤责造藻 早藻灶藻
遭造燥糟噪泽冤以及外壳蛋白渊糟燥葬贼 责则燥贼藻蚤灶袁悦孕冤 咱缘暂 遥 该病毒
在葡萄上普遍存在袁随繁殖材料扩散传播袁尚未发现
其它寄主和传播介体遥 研究表明袁郧砸杂孕葬灾 是一个
序列多变体家族袁目前已报道了 员园 个不同的变异
体袁包括 郧砸杂孕葬灾鄄员咱猿暂尧郧砸杂孕葬灾鄄杂郧员 和 郧砸杂孕葬灾鄄月杂咱远暂尧
郧砸杂孕葬灾鄄杂再咱苑暂和郧砸杂孕葬灾鄄孕晕咱愿暂尧郧砸杂孕葬灾鄄杂粤咱怨暂尧郧砸杂孕葬灾鄄
酝郧咱员园暂尧郧砸杂孕葬灾鄄酝栽尧 郧砸杂孕葬灾鄄酝蕴咱员员暂 以及 郧砸杂孕葬灾鄄
郧郧咱员圆暂 遥 我国关于 郧砸杂孕葬灾 的报道较少袁李西萍
等咱员猿暂和董雅凤等咱员源暂分别采用 砸栽鄄孕悦砸 技术从我国
的葡萄样品中成功地检测出了 郧砸杂孕葬灾曰牛建新等咱员缘暂
合成了以生物素标记的 郧砸杂孕葬灾 的 糟阅晕粤 探针袁成
功检测了葡萄叶片尧皮层中的 郧砸杂孕葬灾袁并对影响斑
点杂交的因素进行了研究遥
茎痘病给葡萄生产造成严重影响袁而 郧砸杂孕葬灾
变异体的存在又给病毒的检测带来不便袁因此袁本研
究采用 砸栽鄄孕悦砸 方法袁对来源于不同地区的葡萄样
品进行检测袁并对部分分离物进行了克隆尧测序和基
因序列变异分析袁以期建立 郧砸杂孕葬灾有效的 砸栽鄄孕悦砸
检测方法袁明确我国 郧砸杂孕葬灾 的分布及其分子变异
情况袁为今后对该病毒的致病性尧病害的防治及抗病
毒基因工程等研究提供依据遥
员 材料与方法
员援 员 材料
植物院圆园员员 年和 圆园员圆 年秋尧冬季节袁分别从 员远
个省尧市尧自治区葡萄园采集 远缘 个品种 猿园缘 株葡萄
样品休眠枝条袁刮取韧皮部用于 砸栽鄄孕悦砸检测遥
试剂院则栽葬择阅晕粤 酶尧凿晕栽孕泽尧克隆载体 责酝阅员愿鄄栽
和大肠杆菌 耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤 阅匀 缘琢 感受态细胞购自
宝生物工程渊大连冤有限公司袁琼脂糖凝胶纯化回收
试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司袁反转录
酶 酝鄄酝蕴灾购自 孕则燥皂藻早葬生物技术有限公司遥
引物院选用已报道的引物 砸杂孕缘圆 缘忆鄄栽郧粤粤郧鄄
郧悦栽栽栽粤郧郧郧郧栽栽粤郧鄄猿忆渊苑 苑园愿 耀 苑 苑圆远 灶贼冤和 砸杂孕缘猿
缘忆鄄悦栽栽粤粤悦悦悦粤郧悦悦栽栽郧粤粤粤栽鄄猿忆渊愿 缘怨源 耀 愿 远员圆 灶贼冤咱员源暂袁
扩增片段大小为 怨园缘 遭责袁包括整个外壳蛋白渊悦孕冤基
因序列以及两端约 员圆缘 遭责 的片段遥 引物由上海生
工生物工程技术服务有限公司合成遥
员援 圆 方法
员援 圆援 员 总 砸晕粤提取
悦栽粤月法提取总 砸晕粤院参照 蕴蚤 等咱员远暂方法袁用液
氮迅速研磨样品袁取 园援 员 早 粉末加入到 员 皂蕴 提取缓
冲液中袁远缘 益孵育 猿园 皂蚤灶袁员圆 园园园 则 辕 皂蚤灶 离心 员缘 皂蚤灶
后袁吸取上清袁用氯仿和异戊醇渊圆源 颐 员冤抽提 圆 耀 猿
次袁取上清袁加入异丙醇沉淀袁乙醇洗涤沉淀 圆 次袁加
圆园 滋蕴 阅耘孕悦 处理的去离子水溶解沉淀袁 原 苑园 益
保存遥
杂阅杂法提取总 砸晕粤院参照 粤泽贼则怎糟 等咱员苑暂方法袁称
取 园援 员 早样品袁液氮研磨袁加入 园援 缘 皂蕴 提取缓冲液袁
混匀后加入 圆园豫 杂阅杂袁远缘 益 圆园 皂蚤灶袁加入 缘 皂燥造 辕 蕴醋
酸钾袁冰上放置 圆园 皂蚤灶袁员圆 园园园 则 辕 皂蚤灶 离心 员缘 皂蚤灶 后袁
取上清袁加无水乙醇沉淀袁沉淀用 苑缘豫乙醇洗涤 圆
次袁风干袁加入 缘园 滋蕴 阅耘孕悦 处理的去离子水袁 原 苑园 益
保存遥
杂蚤韵圆 吸附法提取总 砸晕粤院参照 云燥蚤泽泽葬糟 等咱员愿暂方
法袁刮取 员园园 皂早葡萄枝条韧皮部袁加入 员 皂蕴 提取缓
冲液 渊源援 园 皂燥造 辕 蕴 硫氰酸胍尧 园援 圆 皂燥造 辕 蕴 醋酸钠尧
圆缘 皂皂燥造 辕 蕴 耘阅栽粤尧员援 园 皂燥造 辕 蕴醋酸钾尧圆援 缘豫 孕灾孕鄄猿园袁
临用前加入 圆豫偏重亚硫酸钠冤磨碎袁将匀浆转移到
含 员园豫 晕鄄造葬怎则燥赠造泽葬则糟燥泽蚤灶藻 的离心管中袁苑园 益 孵育
员园 皂蚤灶袁冰上放置 缘 皂蚤灶后袁员源 园园园 则 辕 皂蚤灶离心 员园 皂蚤灶曰
上清加入到含乙醇尧碘化钠和 员园豫二氧化硅悬浮液
园苑员 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源员 卷
渊责匀圆援 园冤的离心管中袁震荡 圆园 皂蚤灶 后 远 园园园 则 辕 皂蚤灶 离
心 员 皂蚤灶曰沉淀用清洗缓冲液渊员园援 园 皂皂燥造 辕 蕴 栽则蚤泽鄄匀糟造尧
园援 缘 皂皂燥造 辕 蕴 耘阅栽粤尧缘园 皂皂燥造 辕 蕴 晕葬悦造尧缘园豫乙醇冤洗 圆
次袁自然风干袁重新悬浮于 员园园 滋蕴 阅耘孕悦处理的去离
子水中袁离心取上清袁 原 苑园 益保存备用遥
员援 圆援 圆 砸栽鄄孕悦砸检测
糟阅晕粤合成体系为 圆缘 滋蕴袁其中总 砸晕粤 缘 滋蕴尧随
机引物 员 滋蕴尧阅耘孕悦 处理的去离子水 怨 滋蕴袁混匀后
怨缘 益 缘 皂蚤灶袁冰上 圆 皂蚤灶袁再依次加入 缘 伊 酝鄄酝蕴灾
遭怎枣枣藻则 缘 滋蕴尧员园 皂皂燥造 辕 蕴 凿晕栽孕泽 员援 圆缘 滋蕴尧圆园园 哉 辕 滋蕴 酝鄄
酝蕴灾 园援 缘 滋蕴尧阅耘孕悦水 猿援 圆缘 滋蕴曰猿苑 益水浴 员园 皂蚤灶袁源圆
益水浴 缘园 皂蚤灶袁苑园 益灭活 缘 皂蚤灶袁保存于 原 圆园 益袁
备用遥
孕悦砸 扩增体系为 圆缘 滋蕴袁其中 糟阅晕粤 圆援 缘 滋蕴尧
员园 伊 孕悦砸缓冲液 圆援 缘 滋蕴尧员园 皂皂燥造 辕 蕴 凿晕栽孕泽 园援 缘 滋蕴尧
员园 滋皂燥造 辕 蕴互补引物各 园援 缘 滋蕴尧圆 哉 辕 滋蕴 栽葬择 阅晕粤 聚
合酶 园援 猿苑缘 滋蕴尧灭菌纯水 员愿援 员圆缘 滋蕴遥 孕悦砸 反应程
序为院怨源 益预变性 猿 皂蚤灶曰怨源 益变性 猿园 泽袁缘圆 益退火
源园 泽袁苑圆 益延伸 怨园 泽袁猿缘 个循环曰苑圆 益延伸 员园 皂蚤灶遥
员援 圆援 猿 孕悦砸产物的克隆与测序
孕悦砸产物采用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒回
收袁纯化后与载体 责酝阅员愿鄄栽连接袁转化 耘援 糟燥造蚤 阅匀 缘琢
感受态细胞袁将经 孕悦砸验证为阳性的菌液交由北京
诺赛基因组研究中心测序遥 测序结果采用 阅晕粤鄄
酝粤晕 远援 园 分析软件进行同源性分析袁用 悦蕴哉杂栽粤蕴鄄载
员援 愿员 和 酝耘郧粤 源援 员 分析软件构建系统进化树袁采用
临近法渊灶藻蚤早澡遭燥怎则鄄躁燥蚤灶蚤灶早袁晕允冤袁以重复 员 园园园 次的自
展值判断分支可靠性遥
圆 结果与分析
圆援 员 不同方法 砸晕粤提取效果
采用 员援 缘豫的琼脂糖凝胶电泳观察 砸晕粤 完整
性袁由图 员 可见袁杂阅杂法提取的 砸晕粤条带不清晰袁有
拖尾现象袁此外袁在核酸溶解过程中袁该方法得到的
砸晕粤黏性大袁杂质较多袁呈褐色曰悦栽粤月 法提取的
砸晕粤在电泳图上无任何条带曰杂蚤韵圆 吸附法提取的
砸晕粤袁圆愿杂 和 员愿杂 条带完整且清晰袁溶于水后无杂
质袁表明所提 砸晕粤质量较好袁可用于后续研究遥
图 员 不同方法提取 砸晕粤的琼脂糖凝胶电泳图
云蚤早援 员 栽澡藻 葬早葬则燥泽藻 早藻造 藻造藻糟贼则燥责澡燥则藻泽蚤泽 燥枣 贼燥贼葬造 砸晕粤 藻曾贼则葬糟贼藻凿 遭赠 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 皂藻贼澡燥凿泽
摇 摇 酝院酝葬则噪藻则 阅鄄圆园园园曰员 耀 缘院杂阅杂法提取的总 砸晕粤曰远 耀员园院悦栽粤月法提取的总 砸晕粤曰员员 耀员缘院杂蚤韵圆 法提取的总 砸晕粤遥 酝院 酝葬则噪藻则 阅鄄圆园园园曰
员 原 缘院 砸晕粤 藻曾贼则葬糟贼藻凿 憎蚤贼澡 杂阅杂 皂藻贼澡燥凿曰 远 原 员园院 砸晕粤 藻曾贼则葬糟贼藻凿 憎蚤贼澡 悦栽粤月 皂藻贼澡燥凿曰 员员 原 员缘院 砸晕粤 藻曾贼则葬糟贼藻凿 憎蚤贼澡 杂蚤韵圆 皂藻贼澡燥凿援
圆援 圆 砸栽鄄孕悦砸检测结果
利用所建立的 砸栽鄄孕悦砸 检测体系袁对来源于 员远
个地区的 远缘 个品种共 猿园缘 株葡萄样品进行检测袁结
果显示渊表 员冤袁除新疆的 员园 个品种 猿愿 株样品外袁其
余 员缘 个地区的葡萄中均检测到 郧砸杂孕葬灾遥 所检的
猿园缘 株葡萄样品中袁员员源 株为阳性袁郧砸杂孕葬灾 平均带
毒株率为 猿苑援 源豫 遥 不同地区的葡萄样品 郧砸杂孕葬灾
侵染情况不同袁品种带毒率最高为 愿愿援 怨豫 袁最低为
圆园援 园豫 渊不包括检测品种数少于 猿 的样品冤曰葡萄植
株带毒率最高为 苑缘援 园豫 袁最低为 远援 苑豫 渊不包括检测
株数少于 猿 的样品冤遥
圆援 猿 分离物内各变种的差异分析
选取 圆源 个 郧砸杂孕葬灾分离物进行克隆袁每个分离
物挑选 猿 耀 源 个阳性克隆进行测序遥 引物 砸杂孕缘圆 辕
砸杂孕缘猿 扩增的片段大小为 怨园缘 遭责袁包括 郧砸杂孕葬灾 整
个 糟责基因序列渊苑愿园 遭责冤以及两端约 员圆缘 遭责的片段袁
对其中的 糟责基因序列进行比对分析遥 结果表明袁所
有克隆的核苷酸序列同源性为 愿园援 怨豫 耀 员园园豫 袁氨
基酸同源性为 怨园援 苑豫 耀 员园园豫 遥 一些分离物各个克
隆间的同源性差异较大遥 例如袁辽宁分离物野伊尔
玛渊 蕴晕鄄再耘酝冤冶的 源 个克隆中袁 蕴晕鄄再耘酝鄄员 和 蕴晕鄄
再耘酝鄄圆 核苷酸的同源性为 怨怨援 苑豫 袁氨基酸的同源性
为 员园园援 园豫 曰蕴晕鄄再耘酝鄄猿 和 蕴晕鄄再耘酝鄄源 核苷酸的同源
性为 怨怨援 缘豫 袁氨基酸的同源性为 怨怨援 圆豫 曰而 蕴晕鄄
再耘酝鄄员 和 蕴晕鄄再耘酝鄄圆 与 蕴晕鄄再耘酝鄄猿 和 蕴晕鄄再耘酝鄄源 核
苷酸的同源性则只有 愿猿援 员豫 耀 愿猿援 缘豫 袁氨基酸的同
源性均为 怨圆援 猿豫 遥 同样袁北京的分离物 野霞多丽
渊月允鄄载阅蕴冤冶的 猿 个克隆中袁月允鄄载阅蕴鄄员 和 月允鄄载阅蕴鄄圆
的核苷酸和氨基酸同源性分别为 怨怨援 缘豫和 怨怨援 圆豫 袁
而 月允鄄载阅蕴鄄猿 与这 圆 个克隆的核苷酸同源性仅为
愿圆援 愿豫 耀愿圆援 怨豫 袁氨基酸为 怨猿援 源豫 遥 另一些分离物
中各个克隆间的同源性差异较小袁例如袁从宁夏分离
员苑员圆 期 朱红娟等院我国部分地区沙地葡萄茎痘相关病毒分离物外壳蛋白序列变异分析
表 员 不同地区 郧砸杂孕葬灾检测结果
栽葬遭造藻 员 阅藻贼藻糟贼蚤燥灶 则藻泽怎造贼泽 燥枣 郧砸杂孕葬灾 枣则燥皂 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 则藻早蚤燥灶泽
地区
砸藻早蚤燥灶
检测品种数
晕燥援 燥枣 糟怎造贼蚤增葬则泽
品种带毒率 渊豫冤
陨灶枣藻糟贼蚤燥灶 则葬贼藻 燥枣 糟怎造贼蚤增葬则泽
检测株数
晕燥援 燥枣 泽葬皂责造藻泽
株带毒率 渊豫 冤
陨灶枣藻糟贼蚤燥灶 则葬贼藻 燥枣 泽葬皂责造藻泽
甘肃 郧葬灶泽怎 苑 源圆援 怨 员员 圆苑援 猿
宁夏 晕蚤灶早曾蚤葬 员愿 愿愿援 怨 苑园 远苑援 员
新疆 载蚤灶躁蚤葬灶早 员园 园援 园 猿愿 园援 园
河南 匀藻灶葬灶 员 员园园援 园 员 员园园援 园
河北 匀藻遭藻蚤 缘 圆园援 园 员缘 远援 苑
山东 杂澡葬灶凿燥灶早 圆园 缘园援 园 远员 猿远援 员
广西 郧怎葬灶早曾蚤 缘 远园援 园 员远 苑缘援 园
辽宁 蕴蚤葬燥灶蚤灶早 远 远远援 苑 怨 源源援 源
江苏 允蚤葬灶早泽怎 源 苑缘援 园 员猿 圆猿援 员
天津 栽蚤葬灶躁蚤灶 源 圆缘援 园 愿 圆缘援 园
北京 月藻蚤躁蚤灶早 员员 源缘援 缘 猿圆 圆愿援 员
上海 杂澡葬灶早澡葬蚤 员源 猿缘援 苑 员缘 源园援 园
云南 再怎灶灶葬灶 源 圆缘援 园 愿 员圆援 缘
四川 杂蚤糟澡怎葬灶 源 圆缘援 园 缘 圆园援 园
浙江 在澡藻躁蚤葬灶早 员 员园园援 园 员 员园园援 园
安徽 粤灶澡怎蚤 圆 缘园援 园 圆 缘园援 园
合计 栽燥贼葬造 远缘鄢 缘圆援 猿鄢 猿园缘 猿苑援 源
摇 摇 鄢不同地区的同一品种只统计一次遥 栽澡藻 泽葬皂藻 糟怎造贼蚤增葬则 枣则燥皂 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 则藻早蚤燥灶泽 憎葬泽 糟燥怎灶贼藻凿 燥灶造赠 燥灶糟藻援
物野红地球渊晕载鄄匀阅匝冤冶和野蛇龙珠渊晕载鄄杂蕴在冤冶分别
得到 猿 个克隆袁核苷酸的同源性均在 怨怨援 园豫以上袁
氨基酸的同源性均在 怨愿援 园豫以上遥
圆援 源 序列多重比对与分子进化分析
挑选同一分离物中核苷酸序列同源性低于
愿远豫的克隆与 晕悦月陨 上已登录序列进行比对分析袁
结果表明袁来自 圆源 个分离物的 猿苑 个克隆与来源于
不同国家的 员圆 个 郧砸杂孕葬灾 分离物渊表 圆冤的核苷酸
序列同源性为 愿园援 缘豫 耀 怨怨援 苑豫 袁氨基酸序列同源性
为 愿愿援 愿豫 耀员园园豫 遥 上述分离物或分子变种与一个
来源于美国的分离物渊云允怨源猿圆怨源冤同源性较低袁核苷
酸和氨基酸序列的同源性分别为 愿园援 缘豫 耀 怨猿援 圆豫
和 愿愿援 愿豫 耀 怨缘援 源豫 袁而与已登录的来源于中国的
分离物渊允云怨圆苑怨猿怨冤的同源性相对较高袁核苷酸和氨
基酸序列的同源性分别为 愿员援 缘豫 耀 怨怨援 苑豫 和
怨员援 缘豫 耀员园园豫 遥
采用 悦蕴哉杂栽粤蕴鄄载 员援 愿员 和 酝耘郧粤 源援 员渊灶藻蚤早澡遭燥则鄄
躁燥蚤灶蚤灶早冤序列分析软件对上述分离物或分子变种进
行系统进化分析袁结果表明袁所有分离物聚为 圆 个大
组渊组玉和组域冤遥 来自宁夏的梅鹿辄渊晕载鄄酝蕴在冤尧
赤霞珠渊晕载鄄悦载在冤和品丽珠渊晕载鄄孕蕴在冤的克隆 晕载鄄
酝蕴在员鄄圆尧晕载鄄酝蕴在圆鄄圆尧晕载鄄悦载在圆 和 晕载鄄孕蕴在鄄圆袁来自
辽宁的南黑哈丽渊蕴晕鄄晕匀匀蕴冤尧意大利渊蕴晕鄄再阅蕴冤尧玛
瑟兰 渊 蕴晕鄄酝杂蕴冤的克隆 蕴晕鄄晕匀匀蕴尧 蕴晕鄄再阅蕴鄄圆尧 蕴晕鄄
酝杂蕴鄄圆袁以及来自天津赤霞珠渊栽允鄄悦载在冤的克隆 栽允鄄
悦载在圆鄄源 和山东贵妃渊杂阅鄄郧云冤的克隆 杂阅鄄郧云鄄员 与已
报道的美国分离物 云允怨源猿圆怨源 和 云允怨源猿猿缘苑尧中国分离
物 郧匝源苑愿猿员缘 以及来自葡萄牙的分离物 粤再怨圆苑远愿缘
聚为一组渊组域冤袁其余聚为另一组渊组玉冤袁其中袁组
玉又分为 圆 个小的分支渊玉葬 和玉遭冤遥 经同源性比
对发现袁组玉内所有分离物或分子变种的核苷酸和
氨基酸同源性分别为 苑愿援 苑豫 耀 员园园豫和 怨园援 园豫 耀
员园园豫 袁组域内分别为 怨员援 源豫 耀 怨怨援 员豫和 怨源援 圆豫 耀
员园园豫 袁组玉与组域间的核苷酸和氨基酸的同源性分
别为 愿园援 缘豫 耀 愿远援 圆豫和 愿愿援 源豫 耀 怨缘援 愿豫 遥 分析构
建的系统进化树发现袁各个分离物间的遗传距离无
明显的地域以及品种差异袁此外袁氨基酸序列与核苷
酸序列构建的系统发育树基本一致渊图 圆冤遥
猿 讨论
本研究采用了 猿 种不同的 砸晕粤 提取方法袁杂阅杂
法尧悦栽粤月法以及 杂蚤韵圆 吸附法袁在提取效果中发现袁杂蚤韵圆 吸附法提取的 砸晕粤 效果最好遥 核酸提取是病
毒检测的关键环节袁不同的 砸晕粤 提取方法袁对于不
同的植物或者组织的提取效果会存在差异曰同时袁由
于实验环境尧试剂批次的影响以及不同研究人员在
操作上存在差异袁也可能会影响 砸晕粤 的提取效果遥
本研究筛选的杂蚤韵圆吸附法能从葡萄样品中提取到
圆苑员 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源员 卷
表 圆 本研究所用的 郧砸杂孕葬灾分离物
栽葬遭造藻 圆 郧砸杂孕葬灾 蚤泽燥造葬贼藻泽 怎泽藻凿 蚤灶 贼澡蚤泽 泽贼怎凿赠
来源
韵则蚤早蚤灶
品种
悦怎造贼蚤增葬则
分离物代号
陨泽燥造葬贼藻
克隆间同源性
陨凿藻灶贼蚤贼赠 遭藻贼憎藻藻灶
糟造燥灶藻泽 渊豫 冤
登录号
粤糟糟藻泽泽蚤燥灶 灶燥援
参考文献
砸藻枣藻则藻灶糟藻
甘肃 郧葬灶泽怎 醉人香 在怎蚤则藻灶曾蚤葬灶早 郧杂鄄在砸载 运云苑猿员怨远园 本研究 孕则藻泽藻灶贼 泽贼怎凿赠
宁夏 晕蚤灶早曾蚤葬 红地球 匀燥灶早凿蚤择蚤怎
梅鹿辄 酝藻蚤造怎扎澡藻
蛇龙珠 杂澡藻造燥灶早扎澡怎
赤霞珠 悦澡蚤曾蚤葬扎澡怎
霞多丽 载蚤葬凿怎燥造蚤
品丽珠 孕蚤灶造蚤扎澡怎
晕载鄄匀阅匝鄄员
晕载鄄匀阅匝鄄圆
晕载鄄酝蕴在员鄄员
晕载鄄酝蕴在员鄄圆
晕载鄄酝蕴在圆鄄圆
晕载鄄酝蕴在圆鄄猿
晕载鄄杂蕴在鄄员
晕载鄄悦载在员
晕载鄄悦载在圆
晕载鄄载阅蕴鄄员
晕载鄄载阅蕴鄄圆
晕载鄄孕蕴在鄄员
晕载鄄孕蕴在鄄圆
怨怨援 远
愿源援 园
愿缘援 怨
愿猿援 员
愿猿援 猿
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天津 栽蚤葬灶躁蚤灶 赤霞珠 悦澡蚤曾蚤葬扎澡怎 栽允鄄悦载在员
栽允鄄悦载在圆鄄圆
栽允鄄悦载在圆鄄源
愿圆援 怨
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河北 匀藻遭藻蚤 玛瑟兰 酝葬泽藻造葬灶 匀月鄄酝杂蕴 运云苑猿员怨远圆 本研究 孕则藻泽藻灶贼 泽贼怎凿赠
北京 月藻蚤躁蚤灶早 霞多丽 载蚤葬凿怎燥造蚤
赤霞珠 悦澡蚤曾蚤葬扎澡怎
月允鄄载阅蕴鄄员
月允鄄载阅蕴鄄猿
月允鄄悦载在
愿圆援 愿 运云苑猿员怨缘愿 本研究 孕则藻泽藻灶贼 泽贼怎凿赠
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上海 杂澡葬灶早澡葬蚤 达米娜 阅葬皂蚤灶葬 杂匀鄄阅酝晕 运云苑猿员怨愿怨 本研究 孕则藻泽藻灶贼 泽贼怎凿赠
山东 杂澡葬灶凿燥灶早 贵妃 郧怎蚤枣藻蚤 杂阅鄄郧云鄄员
杂阅鄄郧云鄄圆
愿猿援 猿 运云苑猿员怨愿苑 本研究 孕则藻泽藻灶贼 泽贼怎凿赠
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新疆 载蚤灶躁蚤葬灶早 无核白鸡心 宰怎澡藻遭葬蚤躁蚤曾蚤灶 载允鄄宰匀月允载鄄员 运云苑猿员怨怨猿 本研究 孕则藻泽藻灶贼 泽贼怎凿赠
辽宁 蕴蚤葬燥灶蚤灶早 玛瑟兰 酝葬泽藻造葬灶
京紫晶 允蚤灶早扎蚤躁蚤灶早
南黑哈丽 晕葬灶澡藻蚤澡葬造蚤
葡萄园皇后
孕怎贼葬燥赠怎葬灶澡怎葬灶早澡燥怎
伊尔玛 再蚤爷藻则皂葬
意大利 再蚤凿葬造蚤
蕴晕鄄酝杂蕴鄄员
蕴晕鄄酝杂蕴鄄圆
蕴晕鄄允在允鄄圆
蕴晕鄄允在允鄄猿
蕴晕鄄晕匀匀蕴
蕴晕鄄孕栽再匀匀鄄圆
蕴晕鄄孕栽再匀匀鄄猿
蕴晕鄄再耘酝鄄员
蕴晕鄄再耘酝鄄源
蕴晕鄄再阅蕴鄄员
蕴晕鄄再阅蕴鄄圆
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愿员援 缘
愿圆援 愿
愿猿援 员
愿猿援 圆
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广西 郧怎葬灶早曾蚤 巨峰 允怎枣藻灶早 郧载鄄允云 运云苑猿员怨远员 本研究 孕则藻泽藻灶贼 泽贼怎凿赠
葡萄牙 孕燥则贼怎早葬造 灾蚤贼蚤泽 增蚤灶蚤枣藻则葬 粤再怨圆苑远愿猿鄄孕燥则贼怎早葬造 粤再怨圆苑远愿猿 晕燥造葬泽糟燥 藻贼 葬造援 咱员怨暂
灾蚤贼蚤泽 泽蚤造增藻泽贼则蚤泽 粤再怨圆苑远愿缘鄄孕燥则贼怎早葬造 粤再怨圆苑远愿缘 晕燥造葬泽糟燥 藻贼 葬造援 咱员怨暂
斯洛文尼亚
杂造燥增藻灶蚤葬
砸藻枣燥泽噪 粤再怨圆苑远愿苑鄄杂造燥增藻灶蚤葬 粤再怨圆苑远愿苑 晕燥造葬泽糟燥 藻贼 葬造援 咱员怨暂
砸藻枣燥泽噪 粤再怨圆苑远愿愿鄄杂造燥增藻灶蚤葬 粤再怨圆苑远愿愿 晕燥造葬泽糟燥 藻贼 葬造援 咱员怨暂
意大利 陨贼葬造赠 月燥泽糟燥 阅匝猿远源怨怨员鄄陨贼葬造赠 阅匝猿远源怨怨员 栽藻则造蚤扎扎蚤 藻贼 葬造援 咱圆园暂
酝葬皂皂燥造燥 匀匝猿怨远苑源苑鄄陨贼葬造赠 匀匝猿怨远苑源苑
巴西 月则葬扎蚤造 源圆园粤 耘哉园源园圆园源鄄月则葬扎蚤造 耘哉园源园圆园源
陨泽葬遭藻造 郧哉员远远圆怨园鄄月则葬扎蚤造 郧哉员远远圆怨园
美国 粤皂藻则蚤糟葬 灾蚤贼蚤泽 增蚤灶蚤枣藻则葬 云允怨源猿圆怨源鄄哉杂粤 云允怨源猿圆怨源 粤造葬遭蚤 藻贼 葬造援 咱圆员暂
灾蚤贼蚤泽 增蚤灶蚤枣藻则葬 云允怨源猿猿缘苑鄄哉杂粤 云允怨源猿猿缘苑 粤造葬遭蚤 藻贼 葬造援 咱圆员暂
中国 悦澡蚤灶葬 粤怎早怎泽贼葬 早则葬责藻增蚤灶藻 郧匝源苑愿猿员缘鄄悦澡蚤灶葬 郧匝源苑愿猿员缘
砸藻凿 郧造燥遭藻 允云怨圆苑怨猿怨鄄悦澡蚤灶葬 允云怨圆苑怨猿怨
猿苑员圆 期 朱红娟等院我国部分地区沙地葡萄茎痘相关病毒分离物外壳蛋白序列变异分析
图 圆 不同 郧砸杂孕葬灾分离物的 悦孕基因核苷酸渊粤冤和氨基酸渊月冤系统进化树
云蚤早援 圆 孕澡赠造燥早藻灶藻贼蚤糟 贼则藻藻泽 燥枣 郧砸杂孕葬灾 蚤泽燥造葬贼藻泽 遭葬泽藻凿 燥灶 灶怎糟造藻燥贼蚤凿藻 泽藻择怎藻灶糟藻泽 渊粤冤 葬灶凿 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 泽藻择怎藻灶糟藻泽 渊月冤 燥枣 悦孕 早藻灶藻
摇 摇 构建系统进化树采用 灶藻蚤早澡遭燥则鄄躁燥蚤灶蚤灶早 渊晕允冤的方法进行了 员园园园次重复袁并且隐藏了可信度低于 苑缘的数值袁分离物的基本信息见表
圆遥 晕藻蚤早澡遭燥则鄄躁燥蚤灶蚤灶早 渊晕允冤 葬造早燥则蚤贼澡皂 憎葬泽 怎泽藻凿 蚤灶 贼澡藻 则藻糟燥灶泽贼则怎糟贼蚤燥灶 燥枣 责澡赠造燥早藻灶藻贼蚤糟 贼则藻藻泽援 月燥燥贼泽贼则葬责 增葬造怎藻泽 憎藻则藻 糟葬造糟怎造葬贼藻凿 枣则燥皂 员园园园 则藻责造蚤糟葬贼藻泽袁
葬灶凿 贼澡藻 增葬造怎藻泽 造燥憎藻则 贼澡葬灶 苑缘豫 憎藻则藻 灶燥贼 泽澡燥憎灶援 月葬泽蚤糟 蚤灶枣燥则皂葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 蚤泽燥造葬贼藻泽 蚤泽 贼澡藻 泽葬皂藻 葬泽 蚤灶 栽葬遭造藻 圆援
带型完整尧质量良好的 砸晕粤袁相对于 杂阅杂法和 悦栽粤月
法更适宜葡萄样品中 砸晕粤 的提取遥 与前期的研究
结果相比渊带毒株率 源愿援 员豫 冤咱员源暂 袁本研究中 郧砸杂孕葬灾
的检出率 猿苑援 源豫相对较低袁分析其原因可能与样品
的检测范围扩大有关袁前期检测的样品主要来源于
辽宁省袁本研究收集了全国 员远 个省市的样品袁同时袁
葡萄的品种及检测株数也相应增加袁这些都会影响
样品的检出率遥
本研究的结果进一步证明了 郧砸杂孕葬灾 是一个多
变体家族袁不仅不同分离物间核苷酸序列差异较大袁
同一分离物内不同克隆间也存在差异遥 分子生物信
息是研究物种进化历史的基础袁依据植物病毒基因
组核苷酸的相似性进行分类袁已被人们所接受咱圆圆暂 遥
根据聚类分析图可以看出袁同一 郧砸杂孕葬灾 分离物的
不同克隆位于不同分支袁表明样品可能被不同的序
列变异体复合侵染袁酝藻灶早 等咱员暂和 晕燥造葬泽糟燥 等咱员怨暂在早
期研究中已发现 郧砸杂孕葬灾存在不同变异体共侵染的
现象遥 本研究中各个分离物间的遗传距离无明显的
地域差异袁遗传距离与感染品种间也无相关性袁因
此袁推测 郧砸杂孕葬灾的普遍发生可能与品种间的嫁接
以及繁殖材料尧品种的世界性交流有关遥
多数病毒克隆测序的结果最终都归结到病毒的
基因分型上袁以期找到不同分离物间的地域相关性尧
寄主相关性以及分离物本身的遗传变异规律袁从而
为防治及检疫打下基础咱圆猿暂 遥 由于 郧砸杂孕葬灾 的变异
较大袁对引物的特异性和灵敏性要求较高袁检测过程
源苑员 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源员 卷
中往往需要采用 圆 对以上的引物来进行扩增袁从而
确定病毒的感染情况曰此外袁病毒外壳蛋白基因序列
变异也影响高效抗体的制备袁从而影响血清学检测
效率咱圆源暂 遥 因此袁明确基因变异情况袁建立高效的病
毒检测体系袁对 郧砸杂孕葬灾防控具有重要意义遥
致谢院本研究部分样品由国家葡萄产业技术体系综合试验站
协助采集袁特此感谢浴
参 考 文 献渊砸藻枣藻则藻灶糟藻泽冤
咱员暂 酝藻灶早 月袁 允燥澡灶泽燥灶 砸袁 孕藻则藻泽泽蚤灶蚤 杂袁 藻贼 葬造援 砸怎责藻泽贼则蚤泽 泽贼藻皂 责蚤贼贼蚤灶早
葬泽泽燥糟蚤葬贼藻凿 增蚤则怎泽鄄员 蚤泽 糟燥灶泽蚤泽贼藻灶贼造赠 凿藻贼藻糟贼藻凿 蚤灶 早则葬责藻增蚤灶藻泽 贼澡葬贼 葬则藻
蚤灶枣藻糟贼藻凿 憎蚤贼澡 则怎责藻泽贼则蚤泽 泽贼藻皂 责蚤贼贼蚤灶早援 耘怎则燥责藻葬灶 允燥怎则灶葬造 燥枣 孕造葬灶贼
孕葬贼澡燥造燥早赠袁 员怨怨怨袁 员园缘院 员怨员 原 员怨怨
咱圆暂 宰葬造贼藻则 酝 匀袁 悦葬皂藻则燥灶 匀 砸援 阅燥怎遭造藻鄄泽贼则葬灶凿藻凿 砸晕粤 蚤泽燥造葬贼藻凿
枣则燥皂 早则葬责藻增蚤灶藻泽 葬枣枣藻糟贼藻凿 遭赠 则怎责藻泽贼则蚤泽 泽贼藻皂 责蚤贼贼蚤灶早 凿蚤泽藻葬泽藻援
粤皂藻则蚤糟葬灶 允燥怎则灶葬造 燥枣 耘灶燥造燥早赠 葬灶凿 灾蚤贼蚤糟怎造贼怎则藻袁 员怨怨员袁 源圆 渊猿冤院
员苑缘 原 员苑怨
咱猿暂 酝藻灶早 月袁 孕葬灶早 杂 在袁 云燥则泽造蚤灶藻 孕 蕴袁 藻贼 葬造援 晕怎糟造藻燥贼蚤凿藻 泽藻择怎藻灶糟藻
葬灶凿 早藻灶燥皂藻 泽贼则怎糟贼怎则藻 燥枣 郧则葬责藻增蚤灶藻 则怎责藻泽贼则蚤泽 泽贼藻皂 责蚤贼贼蚤灶早 葬泽泽燥糟蚤葬贼鄄
藻凿 增蚤则怎泽鄄员 则藻增藻葬造 泽蚤皂蚤造葬则蚤贼蚤藻泽 贼燥 葬责责造藻 泽贼藻皂 责蚤贼贼蚤灶早 增蚤则怎泽援 允燥怎则灶葬造
燥枣 郧藻灶藻则葬造 灾蚤则燥造燥早赠袁 员怨怨愿袁 苑怨渊愿冤院 圆园缘怨 原 圆园远怨
咱源暂 在澡葬灶早 再 孕袁 哉赠藻皂燥贼燥 允 运袁 郧燥造蚤灶燥 阅 粤袁 藻贼 葬造援 晕怎糟造藻燥贼蚤凿藻 泽藻鄄
择怎藻灶糟藻 葬灶凿 砸栽鄄孕悦砸 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 葬 增蚤则怎泽 葬泽泽燥糟蚤葬贼藻凿 憎蚤贼澡 早则葬责藻鄄
增蚤灶藻 则怎责藻泽贼则蚤泽 泽贼藻皂鄄责蚤贼贼蚤灶早 凿蚤泽藻葬泽藻援 孕澡赠贼燥责葬贼澡燥造燥早赠袁 员怨怨愿袁 愿愿院
员圆猿员 原 员圆猿苑
咱缘暂 酝葬则贼藻造造蚤 郧 孕袁 允藻造噪皂葬灶灶 宰援 云燥增藻葬增蚤则怎泽袁 葬 灶藻憎 责造葬灶贼 增蚤则怎泽 早藻鄄
灶怎泽援 粤则糟澡蚤增藻泽 燥枣 灾蚤则燥造燥早赠袁 员怨怨愿袁 员源猿院 员圆源缘 原 员圆源怨
咱远暂 酝藻灶早 月袁 蕴蚤 悦袁 宰葬灶早 宰袁 藻贼 葬造援 悦燥皂责造藻贼藻 早藻灶燥皂藻 泽藻择怎藻灶糟藻泽 燥枣
贼憎燥 灶藻憎 增葬则蚤葬灶贼泽 燥枣 郧则葬责藻增蚤灶藻 则怎责藻泽贼则蚤泽 泽贼藻皂 责蚤贼贼蚤灶早鄄葬泽泽燥糟蚤葬贼藻凿
增蚤则怎泽 葬灶凿 糟燥皂责葬则葬贼蚤增藻 葬灶葬造赠泽藻泽援 允燥怎则灶葬造 燥枣 郧藻灶藻则葬造 灾蚤则燥造燥早赠袁
圆园园缘袁 愿远院 员缘缘缘 原 员缘远园
咱苑暂 蕴蚤皂葬 酝 云袁 粤造噪燥憎澡灶蚤 砸袁 哉赠藻皂燥贼燥 允 运袁 藻贼 葬造援 酝燥造藻糟怎造葬则 葬灶葬造赠鄄
泽蚤泽 燥枣 葬 悦葬造蚤枣燥则灶蚤葬 泽贼则葬蚤灶 燥枣 砸怎责藻泽贼则蚤泽 泽贼藻皂 责蚤贼贼蚤灶早鄄葬泽泽燥糟蚤葬贼藻凿 增蚤则怎泽
蚤泽燥造葬贼藻凿 枣则燥皂 凿藻糟造蚤灶蚤灶早 杂赠则葬澡 早则葬责藻增蚤灶藻泽援 粤则糟澡蚤增藻泽 燥枣 灾蚤则燥造燥早赠袁
圆园园远袁 员缘员院 员愿愿怨 原 员愿怨源
咱愿暂 蕴蚤皂葬 酝 云袁 粤造噪燥憎灶蚤 砸袁 哉赠藻皂燥贼燥 允 运袁 藻贼 葬造援 郧藻灶燥皂蚤糟 泽贼怎凿赠 葬灶凿
凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 葬 灶藻憎 增葬则蚤葬灶贼 燥枣 郧则葬责藻增蚤灶藻 则怎责藻泽贼则蚤泽 泽贼藻皂 责蚤贼贼蚤灶早 葬泽鄄
泽燥糟蚤葬贼藻凿 增蚤则怎泽 蚤灶 凿藻糟造蚤灶蚤灶早 悦葬造蚤枣燥则灶蚤葬 孕蚤灶燥贼 灶燥蚤则 早则葬责藻增蚤灶藻泽援 允燥怎则鄄
灶葬造 燥枣 孕造葬灶贼 孕葬贼澡燥造燥早赠袁 圆园园怨袁 怨员渊员冤院 员缘缘 原 员远圆
咱怨暂 郧燥泽扎糟扎赠灶泽噪蚤 阅 耘援 砸怎早燥泽藻 憎燥燥凿鄄葬泽泽燥糟蚤葬贼藻凿 增蚤则怎泽藻泽 凿燥 灶燥贼 葬责责藻葬则
贼燥 遭藻 蚤灶增燥造增藻凿 蚤灶 杂澡蚤则葬扎 渊杂赠则葬澡冤 凿藻糟造蚤灶藻 蚤灶 杂燥怎贼澡 粤枣则蚤糟葬援 粤则鄄
糟澡蚤增藻泽 燥枣 灾蚤则燥造燥早赠袁 圆园员园袁 员缘缘院 员源远猿 原 员源远怨
咱员园暂 酝燥则藻造造蚤 酝袁 酝蚤灶葬枣则葬 粤袁 月燥泽糟蚤葬 阅袁 藻贼 葬造援 悦燥皂责造藻贼藻 灶怎糟造藻燥贼蚤凿藻
泽藻择怎藻灶糟藻 燥枣 葬 灶藻憎 增葬则蚤葬灶贼 燥枣 郧则葬责藻增蚤灶藻 则怎责藻泽贼则蚤泽 泽贼藻皂 责蚤贼贼蚤灶早鄄葬泽鄄
泽燥糟蚤葬贼藻凿 增蚤则怎泽 枣则燥皂 泽燥怎贼澡藻则灶 陨贼葬造赠援 粤则糟澡蚤增藻泽 燥枣 灾蚤则燥造燥早赠袁 圆园员员袁
员缘远渊猿冤院 缘源猿 原 缘源远
咱员员暂 栽藻则造蚤扎扎蚤 云袁 蕴蚤 悦袁 砸葬贼贼蚤 悦袁 藻贼 葬造援 阅藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 皂怎造贼蚤责造藻 泽藻鄄
择怎藻灶糟藻 增葬则蚤葬灶贼泽 燥枣 郧则葬责藻增蚤灶藻 则怎责藻泽贼则蚤泽 泽贼藻皂 责蚤贼贼蚤灶早鄄葬泽泽燥糟蚤葬贼藻凿 增蚤鄄
则怎泽 怎泽蚤灶早 责则蚤皂藻则泽 贼葬则早藻贼蚤灶早 贼澡藻 责燥造赠皂藻则葬泽藻 凿燥皂葬蚤灶 葬灶凿 责葬则贼蚤葬造
早藻灶燥皂藻 泽藻择怎藻灶糟蚤灶早 燥枣 葬 灶燥增藻造 增葬则蚤葬灶贼援 粤灶灶葬造泽 燥枣 粤责责造蚤藻凿 月蚤燥造鄄
燥早赠袁 圆园员员袁 员缘怨渊猿冤院 源苑愿 原 源怨园
咱员圆暂 酝藻灶早 月 在袁 灾藻灶噪葬贼葬则葬皂葬灶 杂袁 蕴蚤 悦袁 藻贼 葬造援 悦燥灶泽贼则怎糟贼蚤燥灶 葬灶凿 遭蚤鄄
燥造燥早蚤糟葬造 葬糟贼蚤增蚤贼蚤藻泽 燥枣 贼澡藻 枣蚤则泽贼 蚤灶枣藻糟贼蚤燥怎泽 糟阅晕粤 糟造燥灶藻泽 燥枣 贼澡藻 早藻鄄
灶怎泽 云燥增藻葬增蚤则怎泽援 灾蚤则燥造燥早赠袁 圆园员猿袁 源猿缘院 源缘猿 原 源远圆
咱员猿暂 李西平袁牛建新袁张强袁等援 葡萄茎痘病毒病的 砸栽鄄孕悦砸检
测援 果树学报袁 圆园园缘袁 圆圆渊远冤院 苑员缘 原 苑员远
咱员源暂 董雅凤袁张尊平袁刘凤之袁等援 沙地葡萄茎痘相关病毒 砸栽鄄
孕悦砸检测援 果树学报袁 圆园园苑袁 圆源渊缘冤院 苑园缘 原 苑园愿
咱员缘暂 牛建新袁 李西平袁 张强袁 等援 葡萄茎痘伴随病毒 糟阅晕粤 探
针检测技术研究援 西北农业学报袁 圆园园苑袁 员远渊猿冤院 圆猿怨 原 圆源猿
咱员远暂 蕴蚤 在袁 阅怎 允袁 在澡葬灶早 允袁 藻贼 葬造援 杂赠灶贼澡藻泽蚤泽 燥枣 泽蚤灶早造藻 糟则赠泽贼葬造 月葬鄄
酝燥韵源 灶葬灶燥枣蚤遭藻则泽 蚤灶 悦栽粤月 则藻增藻则泽藻 皂蚤糟则燥藻皂怎造泽蚤燥灶泽援 酝葬贼藻则蚤葬造泽
蕴藻贼贼藻则泽袁 圆园园缘袁 缘怨渊员冤院 远源 原 远愿
咱员苑暂 粤泽贼则怎糟 晕袁 酝葬则糟燥泽 允 云袁 酝葬糟择怎葬蚤则藻 郧袁 藻贼 葬造援 杂贼怎凿蚤藻泽 燥灶 贼澡藻 凿蚤鄄
葬早灶燥泽蚤泽 燥枣 匀燥责 泽贼怎灶贼 增蚤则燥蚤凿 蚤灶 枣则怎蚤贼 贼则藻藻泽院 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 灶藻憎
澡燥泽贼泽 葬灶凿 葬责责造蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 葬 灶怎糟造藻蚤糟 葬糟蚤凿 藻曾贼则葬糟贼蚤燥灶 责则燥糟藻凿怎则藻
遭葬泽藻凿 燥灶 灶燥灶鄄燥则早葬灶蚤糟 泽燥造增藻灶贼泽援 耘怎则燥责藻葬灶 允燥怎则灶葬造 燥枣 孕造葬灶贼 孕葬鄄
贼澡燥造燥早赠袁 员怨怨远袁 员园圆渊怨冤院 愿猿苑 原 愿源远
咱员愿暂 云燥蚤泽泽葬糟 载袁 杂增葬灶藻造造葬鄄阅怎皂葬泽 蕴袁 阅怎造怎糟择 酝 允袁 藻贼 葬造援 孕燥造赠增葬造藻灶贼
凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 枣则怎蚤贼 贼则藻藻 贼则蚤糟澡燥袁 糟葬责蚤造造燥 葬灶凿 枣燥增藻葬增蚤则怎泽藻泽 遭赠 灶藻泽贼藻凿
砸栽鄄孕悦砸 怎泽蚤灶早 凿藻早藻灶藻则葬贼藻凿 葬灶凿 蚤灶燥泽蚤灶藻 糟燥灶贼葬蚤灶蚤灶早 责则蚤皂藻则泽
渊孕阅韵 砸栽鄄孕悦砸冤援 粤糟贼葬 匀燥则贼蚤糟怎造贼怎则葬藻袁 圆园园员袁 缘缘园院 猿苑 原 源猿
咱员怨暂 晕燥造葬泽糟燥 郧袁 杂葬灶贼燥泽 悦袁 孕藻贼则燥增蚤糟 晕袁 藻贼 葬造援 砸怎责藻泽贼则蚤泽 泽贼藻皂 责蚤贼贼蚤灶早
葬泽泽燥糟蚤葬贼藻凿 增蚤则怎泽 蚤泽燥造葬贼藻泽 葬则藻 糟燥皂责燥泽藻凿 遭赠 皂蚤曾贼怎则藻泽 燥枣 早藻灶燥皂蚤糟
增葬则蚤葬灶贼泽 憎澡蚤糟澡 泽澡葬则藻 葬 澡蚤早澡造赠 糟燥灶泽藻则增藻凿 糟燥葬贼 责则燥贼藻蚤灶援 粤则糟澡蚤增藻泽
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