全 文 ：书西北植物学报!
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!"#$)",)#& 基金项目$国家高技术研究发展计划"
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作者简介$张 ! 淼" #22( #!女!在读硕士研究生!主要从事小麦遗传育种研究工作 3)45.6$
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通信作者$马翎健!博士!教授!主要从事小麦抗病分子育种及雄性不育机理研究工作 3)45.6$
456.0
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0=/85>+?@8+:0
人工合成小麦
$%&( 条锈病成株抗性 基因的鉴定及分子标记定位 张 ! 淼#!!张增艳!!蒲宗君%!叶兴国!!郑建敏%!徐世昌$!
冯
!
晶$!魏学宁!!马翎健#" " # 西北农林科技大学 农学院!陕西杨陵 &#!#"" & ! 中国农业科学院作物科学研究所%农作物基因资源与基因改良国家重大科学 工程%农业部麦类生物学与遗传育种重点实验室!北京 #"""2# & % 四川省农业科学院作物研究所!成都 ,#"",, &$
中国农业科学院
植物保护研究所!北京
#"""$# 摘 ! 要$以硬粒小麦
)
粗山羊草人工合成小麦
AB#2$(感病品种)铭贤 #, *及其杂交组合的正反交 C # 以及 AB#2$
%)铭
贤
#,
*
C
!
(
C
!
$% 家系为材料!鉴定其条锈病抗性!对 AB#2$
条锈病抗性进行遗传分析&采用
DDE
分子标记技术和集
群分离分析法进行多态性筛选!以
C
%
抗病鉴定数据为依据!对
AB#2$中条锈病抗性基因进行分子标记定位结果 显示$"
#
#
AB#2$在苗期抗性鉴定中!对 %" 种小麦条锈菌生理小种表现抗性!但对中国四川新出现的条锈菌生理小 种 F!, 表现苗期感病&在田间成株抗性接种鉴定中! AB#2$
对中国流行的小麦条锈菌生理小种条中
%!
(条中
%%
(水
源
$(水源 * (水源 & 和 F!, 等表现出成株抗性" ! # AB#2$
中条锈病抗性由隐性基因位点控制"
%
#仅检测到一个
控制条锈病抗性的
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位点!位于
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染色体上
K
<
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和
K=4:,!,
之间!暂时命名为
G
L
M+99
+
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!在四川和北
京
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AB#2$中 #%+%,N 和 #2+"&N 的成株抗性贡献率"$
#
G
L
M+99
+
#J
位点的
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个
DDE
标记和
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#
个
DDE
标记可以区分该位点与
#J
染色体上的其他抗条锈病基因!如
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(
!"!$和 !"!, % !"#$$! 表 明 G L M+99 + #J 位点在小麦条锈病的抗病育种中具有潜在的应用价值 关键词$合成小麦&条锈菌&条锈病抗性基因&隐性基因位点&
DDE
标记
中图分类号$G&2 文献标志码$
1
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等一些全生育期抗病
基因!对中国的条锈病流行小种条中
%!
表现抗性!
然而!
"#"
年新毒性突变株
F!,
在四川(甘肃等多
个省区出现,!"-!表现出更强的致病力!使含有
!"# $$! 的主栽品种)川麦 $! *和其它含有 !"!, 的 小麦品种都失去抗性,!#-至今!仍然没有对 F!, 有 效的抗性资源报道出现 为创新小麦抗病遗传资源!国际玉米小麦改良 中心" ABSSVH #利用不同品种硬粒小麦的 1J 基 因组和山羊草属的 b 基因组!人工合成(创制一系 列硬粒小麦 ) 粗山羊草人工合成小麦新种质!国内外 多个实验室已从上述人工合成小麦中鉴定出多个抗 性材料,#2!#)!!-本实验室从引自 ABSSVH 的 #"! 份硬粒小麦 ) 粗山羊草人工合成小麦中!鉴定出 AB#2$ 对中国的流行生理小种条中 %! (条中 %% (水 源 $ (水源 * (水源 & 和 F!, 表现出成株抗性 本研究对硬粒小麦 ) 粗山羊草人工合成小麦新 种质 AB#2$ 中抗条锈病基因进行遗传分析和 DDE 标记分析!筛选与该基因紧密连锁的 DDE 标记!为 小麦抗条锈病育种提供新的抗性基因资源以及辅助 选择的标记 # ! 材料和方法 &+& ! 供试材料 抗条锈病的硬粒小麦 ) 粗山羊草人工合成小麦 AB#2$ "系谱为 V1E % 12 3 *4. 5 &,(&)6**$% #由国际 !!# 西 ! 北 ! 植 ! 物 ! 学 ! 报 !!!!!!!!!!!!!!!!!!! %$ 卷 玉米小麦改良中心" ABSSVH #提供!系从引自 AB) SSVH 的 #"! 份硬粒小麦 ) 粗山羊草人工合成小麦 中鉴定出来感病小麦品种)铭贤 #, *由中国农业 科学院植物保护研究所徐世昌研究员提供 AB#2$ ( )铭贤 #, *及其杂交种正反交 C # 以及 AB#2$ %)铭贤 #, *自交后代 C ! $ % 家系均在四川和北京种植! AB#2$ %)铭贤 #, * C ! 群体在四川省种植!用于对 AB#2$ 中 抗 性 基 因 的 分 析 VM#* % ,c 1[;:?YD " 1[D #( VM!$ % %c1[D ( VM!, % %c1[D 和)川麦 $! * 分别含有位于 #J 染色体上的 !"#* ( !"!$ ( !"!, 和 !"#$$ !
这
$个全生育期抗性基因,#*-!这$
种材料
用于比较
AB#2$及其他材料的抗病程度的表现型 &+@ ! 条锈病菌和条锈病接菌试验 将 %# 个条锈病生理小种用于 AB#2$
(
VM#*
%
,c
1[D
(
VM!$% %c1[D ( VM!, % %c1[D )川麦$!
*()铭
贤
#,
*和
1[D
的苗期接菌试验待小麦长至一叶
一心期进行接菌!并将接菌后的幼苗放置在温度为
d
"
##d
(湿度为
#""N
的露水室
!$7 !然后转移 到温度为 #$d
"
#,d
(
#,7
光照%
27
黑暗光周期
的温室&
#$" #*@ 后!当条锈病在)铭贤 #, *叶片上 充分发病时!按照反应型 " "$
划分等级反应型被
简化为
!
个等级$" " ! 级为抗病! % "$
级为感
病,!%-
在田间成株抗性鉴定试验中!混合小种"含有条
中
%!
(条中
%%
(水源
$(水源 * (水源 & 和 F!, #被用 于鉴定材料的成株抗性在三叶期!对 AB#2$
()铭
贤
#,
*及其正反交
C
#
代以及
AB#2$%)铭贤 #, *的 C ! 群体( C !$
%
家系进行第一次接菌!为保证条锈菌充
分接种!试验材料发病完全!
#"@
之后再进行第二
次接菌
&AB
!
CD5
提取和
778
标记分析
参照
D75M
^
等,!$-描述的基因组 bQ1 的提取方 法!提取 AB#2$
()铭贤
#,
*和
C
!
$% 家系小麦植株的 叶片基因组 bQ1 选取 * 个高抗 C !$
%
家系的
bQ1
等量混合构成抗病池"
J
E
#!
*
个高感
C
!
$% 家系的 bQ1 等量混合构成感病池" J D #采用集群分离分 析" JD1 #法和 DDE 分子标记进行多态性筛选,##!*- 根据 Ee@?M 等,!,-( D;4?M/ 等,!&-和 7YY ^$%%
=7?5Y+
^
=+8/@5+
<
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%的报道!选取
**$对 DDE 引 物"奥科公司合成#用于筛选与 AB#2$
中抗性基因连
锁的标记
!"
#
ITAE
反应体系含
!c7,
8
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Y?MS."由
7,
8
bQ1 T;6
L
4?M5/?
(
TAE J8>>?M
(
S
<
!f和
@QHT/
以及
TAE
稳定剂和增强剂组成的
预混体系#(
*
^
4;6
上下游引物和
#""0
<
模板
bQ1
!参照
X50
<
等,#2-提供的程序进行
TAE
扩增
TAE
产物经
#!N
聚丙烯酰胺凝胶电泳(银染后!统
计
DDE
分析结果
&+(
!
统计分析及遗传图谱构建
调查
C
!
群体的感病反应型"
.0>?:Y.;0Y
L^
?
!
BH
#
和
C
!
$% 家系的最大严重度" 45\.484@./?5/?/?[?M.) Y L ! SbD #运用 DTDD 统计软件对 SbD 进行相关 和方差分析!明确表现型数据的有效性广义遗传 力公式为$
6
!
g
!
!
3
%"
!
!
3
f
!
!
3
2
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2f
!
!
"
%
"2
#!其中!!
3
表示
基因型方差!!
3
2
表示基因和环境互作效应!!
"
表示
误差
2
表示环境的个数!
"
表示每个环境内重复的
次数根据分子标记基因型和
##$个 C !$
%
家系的最
大严重度进行
GHI
作图通过
GHIB:.S5
^^
.0
<
软件对获得的表现型与分子标记所检测到的基因型
之间进行关联分析!确定
GHI
位点在染色体上的
位置及贡献率公式
Ihbg6;
<
#"
,
I
"
M
#%
I"
+*
#
-用
于检测
GHI
存在的可靠性!
GHIB:.S5
^^
.0
<
软件
通常所用阈值"
Ihb
值#为
!+*
,
!2
-

!
!
结果与分析
@A&
!
人工合成小麦
$%&( 条锈病抗性鉴定 用 %# 个条锈病生理小种对 AB#2$
(
VM#*
%
,c
1[D
(
VM!$% %c1[D ( VM!, % %c1[D ()川麦$!
*()铭
贤
#,
*和
1[D
进行苗期抗病鉴定!调查其感病反应
型!结果见表
#
对上述
&
个材料对
%#
个生理小种
的感病反应型进行分析!发现人工合成小麦材料
AB#2$和)川麦$!
*在苗期对
F!,
表现感病!而对其
它
%"
个小种均表现抗病!感病对照品种)铭贤
#,
*
和
1[D
对
%#
个小种均表现感病
用条锈菌混合小种对
AB#2$( VM#* % ,c1[D ( VM!$
%
%c1[D
(
VM!,
%
%c1[D
()川麦
$! *和)铭贤 #, *等材料进行接菌!调查其成株期抗性!结果见表 ! 分析调查结果"表 ! #发现人工合成小麦材料 AB#2$
对混合小种表现抗病!而)川麦
$! *( VM#* % , c1[D ( VM!$
%
%c1[D
和
VM!,
%
%c1[D
等材料对该
混合小种均表现感病
所有
AB#2$和)铭贤 #, *的正(反交 C # 单株均 对混合小种表现为感病! ##$
株
C
!
植株中有
%,
株
抗病植株和
&2
株感病植株!说明
AB#2$中成株期抗 性可能由隐性基因决定 @+@ ! 最大严重度的分布和相关性分析 利用 DTDD 软件进行相关性分析显示! AB#2$
%
)铭贤
#,
*的
C
!
$% 家系在北京和四川 ! 个环境下!其 SbD 的相关系数为 "+!! !达到显著水平" % # "+"* # %!# & 期 !!!!!!!!! 张 ! 淼!等$人工合成小麦
AB#2$条锈病成株抗性基因的鉴定及分子标记定位 表 & ! E 个小麦材料对 B& 个条锈病菌系的反应 H5_6?# ! B0>?:Y.;0Y L^ ?/;>&=7?5Y:86Y.[5M/ % 6.0?/Y;%#M5:?/;>%())*+*,&"** - ."/*&>+/ ^ +"**)* 条锈病生理小种 T/Y./;65Y? % M5:? 材料 A86Y.[5M % 6.0? AB#2$ VM#*
%
,c1[D VM!$% %c1[D VM!, % %c1[D 川麦$!
A785045.$! 1[D 和铭贤 #, 1[D50@S.0 < \.50#, *22% " & f " " & " & f " &$
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感
D8/:?
^
Y._6?
铭贤
#,S.0
<
\.50#, $感 D8/:? ^ Y._6? 此外!方差分析表明!该群体植株表现型" SbD #在 不同株系(不同环境及基因型与环境互作间差异均 达到极显著水平"表 % #!条锈病最大严重度" SbD # 的广义遗传力为 "+&2 !说明该群体田间表现型数据 的有效性 在苗期!人工合成小麦 AB#2$
对条锈菌生理小
种
F!,
均表现感病!而成株期则表现抗病!表明
AB#2$是一个典型的条锈病成株抗性小麦材料由 图 # 可知! AB#2$
在所有的种植环境下其
SbD
均在
*N
左右!而)铭贤
#,
*则相对较高!在
2*N
左右
$!# 西 ! 北 ! 植 ! 物 ! 学 ! 报 !!!!!!!!!!!!!!!!!!! %$
卷
图
#
显示!含有
##$个家系的 AB#2$
%)铭贤
#,
*
C
%
群体!其
SbD
在多个环境条件下均呈现出
连续性分布!表明
AB#2$所含成株抗性基因属于典 型的数量性状遗传 表 B !$%&(
!铭贤
&FGH
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"
B
家系田间
最大严重度方差分析
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基因型
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环境
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基因型
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环境
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JK
分析
研究共选用
**$对 DDE 引物用于 AB#2$
和)铭
贤
#,
*双亲间多态性筛选其中!有
2%
对引物在
抗感两亲本间有多态性!而只有
,
对引物在抗感池
及抗感亲本间有一致的多态性!这
,
对引物均位于
#J
染色体上!分别是
K=4:,$( K < =4## ( K_5M:#2& ( K < =4#2 ( K=4:,!, 和 K=4:,# 用这 , 对引物检 测 ##$
个
C
!
$% 家系获取其基因型!以平均的最大严 重度和标记的基因型为作图依据!运用 GHIB:.) S5 ^^ .0 < 软件对 G L M+99 + #J 进行作图"图 ! # G L M+ 99 + #J " Ihb$
!+*
#位于
K
<
=4#2
和
K=4:,!,
之
间
G
L
M+99
+
#J
解释了
#%+%,N
"四川#和
#2+"&N
"北京#成株抗性贡献率其紧密连锁标记
K
<
=4#2
和
K=4:,!,
进行扩增对应的电泳图如图
%
所示
@A(
!
用分子标记区分
&L
抗条锈病基因
用与
G
L
M+99
+
#J
紧密连锁的
DDE
标记
K
<
)
图
%
!
紧密连锁分子标记
K
<
=4#2
"
1
#和
K=4:,!,
"
J
#扩增结果
箭头为抗病目标带&
J
E
+
抗病池&
J
/
+
感病池&
T
E
+
抗病亲本
"
AB#2$#& T / + 感病亲本"铭贤 #, #& E+ 抗病株系& D+ 感病株系 C. < +% ! 36?:YM; ^ 7;M?/./;>TAE ^ M;@8:Y/;>K < =4#2 " 1 # 50@ K=4:,!, " J # 45Ma?M/:6;/?6 L 6.0a?@Y;Y7?M?/./Y50:? < ?0? H7?5MM;=.0@.:5Y?/Y7?Y5M < ?Y_50@>;MM?/./Y50:? & J E +E?/./Y50Y_86a & J / +D8/:? ^ Y._6?_86a & T E +E?/./Y50Y ^ 5M?0Y " AB#2$
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%
家系进行条锈病抗性
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检测&
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条锈病成株抗性基因的鉴定及分子标记定位
图
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#&
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/
+
感病亲本
"铭贤
#,
#&箭头分别为
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M+99
+
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K
<
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(
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G
L
M+99
+
#J
与
#J
染色体上其他抗条锈病基因
!"#*
(
!"!$和 !"!, % !"#$$! 关系"图$
!
1
#结果表明!
G
L
M+99
+
#J
特
异带不同于
!"#*
(
!"!$和 !"!, % !"#$$! 用与 !"#* 紧密连锁 DDE 标记 K < =4%% 对 #J 染色体上 其他抗条锈病基因进行分析!结果如图$
!
J
所示!
G
L
M+99
+
#J
特异带不同于
!"#*
和
!"!,
%
!"# $$! 这些结果也暗示 G L M+99 + #J 可能不同于 #J 上的这 些已知抗条锈病基因 % ! 讨 ! 论 小麦条锈病菌毒性小种的变异非常迅速,!!$- 如)川麦 $! *在四川省不仅是作为抗病品种广泛种 植!也一度被育种家们用作抗病亲本%抗源!曾在小 麦抗条锈病育种中发挥了重要作用然而!自 !"#" 年小麦条锈病菌毒性新小种 F!, 出现以来!)川麦 $! *已对其表现感病,!"-迄今为止!尚未见关于抗 F!, 小麦材料的报道因此!抗 F!, 新毒性小种基 因的发现!对于小麦抗条锈病育种非常重要本研 究中!鉴定出一个 ABSSVH 人工合成小麦 AB#2$ ! 对中国当前的流行小种条中 %! (条中 %% 以及水源 $ (水源 * (水源 & 和 F!, 表现成株抗性利用 JD1 法( DDE 标记在 AB#2$ %)铭贤 #, *的 C % 群体进行作 图分析!鉴定出 # 个 GHI 位点 G L M+99 + #J !并定位 于 #J 染色体 DDE 标记 K < =4#2 和 K=4:,!, 之 间 G L M+99 + #J 可解释 AB#2$ 中 #%+%,N "四川#和 #2+"&N "北京#的贡献率 AB#2$ 的成株抗性位点 可能会在小麦抗条锈病育种中发挥重要的作用 利用 JD1 法检测与抗病基因紧密连锁的分子 标记!构建抗(感池的后代株系数目不可太多!一般 * " #" 个最佳!若是选用的株系数目过多!分子标记 在抗(感池间多态性太低!抗病基因较易丢失&若是 选用的株系数目过少!工作量将会加大!达不到对目 标基因的筛选,#%-本研究在 C ! 代分别选用 #" 株 极抗和极感植株构建抗(感池!仅检测到一个抗性位 点故此!在 C % 代分别选用 * 个极抗和极感株系构 建抗(感池!且同时构建 ! 个抗(感池!仍然仅检测到 一个抗性位点!且该位点的遗传贡献率均小于 !"N 这可能是由于筛选的引物数量还不够多!其 它可能存在的微效 GHI 位点丢失!还有待于进一 步筛选确认 研究表明!成株抗性一般是非小种专化性的!由 一个或几个基因控制,!!##-而且!成株抗性往往表 现出更持久的抗性!其抗性经常在挑旗期才开始表 达!这一时期正是小麦产量积累的重要阶段!有利于 小麦产量的稳定因此!相对于苗期抗性!成株抗性 在应用方面具有更高的利用价值由于四川省是中 国条锈病发生和流行很重要的区域!因此!本研究选 取混合小种对 AB#2$ ()铭贤 #, *及其正反交 C # 代( AB#2$ %)铭贤 #, * C ! 群体和 C ! $ % 家系!同时在四川 和北京 ! 点的大田进行成株抗性鉴定!其中 C ! 仅种 植于四川遗传分析发现! AB#2$ 和)铭贤 #, *的 正(反交 C # 单株均对包含条中 %! (条中 %% (水源 $ ( 水源 * (水源 & 和 F!, 的混合小种表现为感病! ##$ 株 C ! 植株共有 %, 株抗病植株和 &2 株感病植株!说 明 AB#2$ 的成株抗性可能由一个隐性位点 G L M+99 + #J 控制因该位点与 !"#* ( !"!$ 和 !"!, % !"#$$ !
都位于
#J
染色体上!且位置比较接近!本实验用
G
L
M+99
+
#J
的
%
个
DDE
标记和
!"#*
的
#
个
DDE
标
记对
#J
染色体上的抗条锈病基因进行鉴别!结果
表明!
G
L
M+99
+
#J
的抗病特异带型不同于
!"#*
(
!"!$和 !"!, % !"#$$! !这个结果暗示 G L M+99 + #J 可能不同于这些 #JD 上已知的抗条锈病基因但 是!更精确的结论还需后续实验验证 参考文献" , # - ! X3BRE "魏国荣#! X1QRKW "王晓杰# +X7?5Y/YM. ^ ?M8/Y>80 < 8/ ^ 8M.>.:5Y.;050@ ^ M?/?M[5Y.;04?Y7;@/ , W - +<.("+,4. -$2+,+1
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