全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$国家自然科学基金"
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#
作者简介$舒小娟"
#11"
#!女!在读硕士研究生!主要从事果树栽培与分子生物学研究
2)34.5
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,783
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通信作者$胡建芳!教授!主要从事果树生理与分子生物学研究
2)34.5
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74:,<=:,70
葡萄原生质体分离及瞬时转化体系的建立
舒小娟!温腾建!邢佳毅!卢
!
龙!胡建芳"
"中国农业大学 农学与生物技术学院!北京
#""#1%
#
摘
!
要$为了建立葡萄原生质体进行遗传转化的技术!该研究以葡萄品种(黑香蕉)的叶片和愈伤组织为材料!分析
纤维素酶和离析酶的浓度与配比*渗透压和酶解时间等主要因素对葡萄原生质体分离的影响!探讨建立稳定*高效
的葡萄原生质体分离与瞬时转化体系!为鉴定目标基因的功能奠定基础结果表明$"
#
#葡萄叶片原生质体的分离
以
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纤维素酶和
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离析酶的酶组合!在
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甘露醇溶液中!酶解
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为宜!每克游离产量为
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& 个原生质体!活力为
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#葡萄愈伤组织原生质体的分离以
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纤维素酶和
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离析酶的酶组合!
在
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甘露醇溶液中!酶解
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为宜!每克游离产量为
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#利用该
方法得到的葡萄原生质体为受体!采用
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介导转化质粒载体
C
2DE)F?
!目标基因瞬时表达产物检测
表明!
BGA
蛋白表达稳定*清晰该研究建立的葡萄原生质体制备和转化体系!可以用较少量的质粒
HFI
获得外
源基因在原生质体内的表达!为葡萄功能基因的研究提供技术支持
关键词$葡萄&原生质体&叶片&愈伤组织&遗传转化&瞬时表达
中图分类号$
J+(#
文献标志码$
I
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VU40/.<0VC
U!!
植物原生质体是能够通过质壁分离与细胞壁分
开的具有生理活性和全能性的细胞系统其瞬时表
达实验可实现子基因在植物中的快速和高通量表达
分析+#)!,!因而被广泛用于基因功能验证拟南芥
"
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#
+
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*玉米"
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1
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#叶
片+*,*烟草"
2%3*%#-#*$#340 ?,
#愈伤组织+$,!烟
草表皮细胞+&,!洋葱"
!,,%403/
(
#?,
#表皮细胞+,
等原生质体被广泛用于基因瞬时表达*蛋白质的亚
细胞定位*蛋白质互作和蛋白质活性等研究并已
初步建立多种基因瞬时表达系统!如
A2B
介导的原
生质体转染+(,!基因枪轰击+1,和农杆菌介导的瞬时
转化+#",但是!现阶段原生质体的遗传转化研究主
要集中在模式植物!在果树上的相关研究较少
葡萄在中国栽培历史悠久!营养丰富!是果蔬栽
培中经济效益最高的品种之一但是葡萄生长周期
长*遗传背景较为复杂*基因数量多且多为杂合状
态+##,!所以通过传统育种方法和转基因方法进行品
种改良均有一定困难!品种改良工作受到一定制约!
葡萄分子机制研究也由于转基因困难这一技术壁垒
而寸步难行而原生质体分离和遗传转化则为克服
这一障碍开辟了一条可能的新途径+#!,作为单细
胞系统!原生质体是研究植物细胞超微结构*生理生
化过程和遗传学的良好的实验模型!也是遗传转化
的理想受体目前!葡萄原生质体研究进展缓慢!大
多处在分离阶段+#%)#&,!如吕长平等+#%,利用刺葡萄叶
片*根尖和愈伤组织分离获得原生质体俞超等+#*,
也利用(鄞红)葡萄茎段愈伤组织进行原生质体的分
离
F4V4794
等+#$,从葡萄果肉中分离得到了完整而
脆弱的原生质体袁彬等+#&,以毛葡萄愈伤组织*悬
浮培养细胞*无菌苗幼叶为材料!研究了毛葡萄原生
质体的分离纯化方法及影响因素但是有关原生质
体再生和目标基因瞬时表达体系的研究相对较少!
这可能与葡萄遗传背景不清!遗传转化的假阳性较
高有关+#+,因此开展葡萄原生质体转化体系的研
究迫在眉睫为此!本研究针对酶的浓度与配比*渗
透压*酶解时间等对葡萄原生质体分离影响较大的
因素进行了试验研究!旨在获得高效和高质量的原
生质体!并进行了遗传转化实验!为葡萄相关分子机
制的研究*体细胞融合育种*植株再生以及品种改良
奠定基础
#
!
材料和方法
?,?
!
材
!
料
本试验选用葡萄品种(黑香蕉)"
5%*%)6%-%
7
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(
K<.Z.40
P-
.48
)#的无菌苗叶片和无菌苗叶片
诱导的胚性愈伤组织为材料!进行原生质体的分离
从温泉苗圃采集葡萄新梢!进行初代培养和继代培
养选较幼嫩的叶片作为分离原生质体的酶解材
料&剪取组培苗叶片!切成
$33@$33
的方形!接
种到愈伤组织诱导培养基上!选取质密*淡黄色状的
胚性愈伤组织作为分离原生质体的酶解材料
?,@
!
方
!
法
?,@,?
!
原生质体的分离和纯化
!
从田间取葡萄一
年生枝条!经过外植体消毒!放入初代培养基"
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%
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进行生根培养"
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P
%
?
活性炭#!获得无菌苗剪取
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"
*"=
叶龄的组培苗叶片!切成
$33@$33
的方形!接
种到愈伤组织诱导培养基"
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P
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#,"3
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*)H_",!3
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#上进行培养!培
养温度为"
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#
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!光周期为
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%
(9
!光照强度
!"""5Z
!进行
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的暗培养后转入光下培养!经继
代后获得结构致密*淡黄色的胚性愈伤组织
选取
#
P
左右叶龄
!"
"
%"=
的幼嫩叶片作为分
离原生质体的酶解材料!切成
#
"
!33
宽的细丝&
另选取
#
P
左右愈伤组织作为分离材料!切碎分
别置于盛有
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"纤维素
酶!
d4]:5V
#和
3473< )^#"
"离析酶!
d4]:5V
#
混合酶液的培养皿中!静置在
!(`
黑暗的环境酶
解酶解后的材料用
!""
目孔径的尼龙网筛过滤!
除去没有酶解完全的组织和杂质"本试验采用离心
法去杂质!滤液在"
&""
"
(""
#
U
%
3.0
转速下离心
#"
3.0
!去掉上清收集原生质体#用含有甘露醇的原
生质体清洗液"
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*
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*
-
$K
!
e
#进行重悬清洗!再离心洗去杂质!重复操作
!
次最后用原生质体培养液
N$
培养基"
*3385
%
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*
#$* 3385
%
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*
#!$ 3385
%
? T4T5
!
*
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期
!!!!!!!!!!!!!
舒小娟!等$葡萄原生质体分离及瞬时转化体系的建立
3385
%
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!
C
K$,(
#洗涤
!
次!获取纯化原生
质体+#(,
试验所用的酶解液的处理设置见表
#
首先在
渗透压稳定剂甘露醇浓度为
",&385
%
?
和酶解时间
为
#*9
条件下!对酶解液组合进行筛选!测定原生
质体产量和活力!确定最佳的酶解液组合然后!根
据确定的最佳酶解液组合!在酶解时间
#*9
条件
下!渗透压稳定剂甘露醇的浓度设置
*
个处理"
,*
*
",$
*
",&
和
",+385
%
?
#!测定原生质体产量和活力!
确定最佳的渗透压稳定剂浓度最后!根据筛选得
到的最佳酶解液组合和最佳渗透压稳定剂甘露醇的
浓度!酶解时间设置
*
个处理"
#!
*
#*
*
#&
和
#(9
#!
测定原生质体产量和活力!从中确定最佳酶解时间
各实验重复
%
次
?,@,@
!
原生质体产量与活力的测定
!
利用血球计
数板测定原生质体产量$将纯化后的原生质体重悬
至一定体积!吸取少量滴入血球计数板中!在显微镜
下观察形态并计数!重复
%
次同时利用伊文思蓝
染色法测定原生质体活力"
H.U<7VW5:<$%
#$吸取
#
滴原生质体悬浮液置于载玻片上!用
",!$>
伊文思
蓝进行染色!静置
$3.0
!在显微镜下观察!检测原
生质体活性+#1,随机选取
%
个视野统计有活力原
生质体的百分比按如下公式计算+!",$
每克材料中原生质体总产量
f!$
个大方格中原
生质体总数
@#"
*
@
悬浮液总体积
g
材料质量
表
?
!
酶解液组合
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!
T83
C
8/.V.808;<0S
3;8U
C
U8V8
C
54/V./854V.80
处理
OU<4V3<0V
纤维素酶
T<5:58/<808\:]4
)^#"
%
>
离析酶
a473<
)^#"
%
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!!
原生质体活力
f
"视野内未被染色的原生质体
数
g
视野内原生质体总数#
@#"">
每克材料中有活力的原生质体产量
f
原生质体
总产量
@
原生质体活力
由于原生质体分离一般是为了下一步进行遗传
转化或者原生质体融合!需要的都是具有活力的原
生质体!所以!本试验统计具有活力的原生质体数!
并以此作为评价指标
?,@,A
!
原生质体的转化试验
!C
2DE)F?
质粒载体
是含有绿色荧光蛋白基因"
BGA
#的植物表达载体
"
9VV
C
$%%
=<<
CP
U<<0,/V40;8U=,<=:
#!表达框由花椰
菜花叶病毒"
T4ah
#
%$E
启动子*绿色荧光蛋白
"
BGA
#基因构成!可以在真核细胞中高水平表达绿
色荧光蛋白
BGA
用中科瑞泰"北京#普通质粒小
提试剂盒提取质粒!
!"`
保存备用
将收集的葡萄叶片和愈伤组织原生质体重分别
悬浮于
aaB
溶液中"
,$385
%
?
甘露醇*
#$3385
%
?a
P
T5
!
*
3385
%
?a2E
!
C
K$,(
#!浓度稀释至每
毫升溶液内含
!,"@#"
$ 个取
#$
"
!"
#
P
质粒
HFI
加入
!3?
离心管!与
!""
#
?
原生质体
aaB
悬浊液混合!轻弹管底以混匀!室温放置
(
"
#"
3.0
加入
!!"
#
?*"> A2B)T4
!_
"
*"> A2B)
*"""
*
",!385
%
?
甘露醇*
#""3385
%
?T4T5
!
#!轻弹
管底以混匀!室温放置
#$3.0
随后加入
(("
#
?
N$
溶液"
#$*3385
%
?F4T5
*
#!$3385
%
?T4T5
!
*
$
3385
%
?bT5
*
3385
%
?a2E
!
C
K$,(
#重新悬浮!
轻弹管底以混匀!终止转化然后!
#""
P
离心
!
3.0
!弃上清液!收集转化后的原生质体加入
NQ
"
,$385
%
?
甘露醇*
*3385
%
? a2E
*
!"3385
%
?
bT5
!
C
K$,(
#
3?
重悬浮!并转移至经
WEI
预冲
洗过的培养皿中!室温*暗培养过夜!用荧光显微镜
"
FQbeF
!
275.
C
/<1"Q
!
R4
C
40
#观察记录转化效果和
转化率
?,@,B
!
数据分析
!
应用
2Z7<5
软件进行单因素方
差分析&用
EAEE#&,"
统计软件对结果多重比较
!
!
结果与分析
@,?
!
酶解液组合对原生质体产量和活力的影响
叶片中分离原生质体产量和活力的酶解浓度处
理结果"图
#
#显示!处理
##
"
%,">
纤维素酶
_
",+$>
离析酶#的每克叶片中分离的原生质体产量
%,"1@#"
& 个!具有活力的原生质体产量
!,*$@#"
&
个!活力可达
+1,!1>
!是所有叶片酶解处理中最高
的!与其他处理的具有活力的原生质体产量多呈显
*&!#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
著性差异"
8
#
","$
!下同#
愈伤组织分离原生质体产量和活力的酶解组合
结果"图
!
#显示!处理
&
"
!,">
纤维素酶
_",$">
离
析酶#的每克愈伤组织中分离的原生质体产量
$,(&
@#"
& 个!具有活力的原生质体产量
*,+%@#"
& 个!
活力
(",+#>
!是愈伤组织的所有酶解处理中最高
的!与其他处理的具有活力的原生质体产量多呈显
著性差异"图
!
#
根据以上不同酶解液处理效果!最终得出适宜
(黑香蕉)葡萄叶片原生质体分离的酶组合是
%,">
纤维素酶
_",+$>
离析酶&适宜愈伤组织原生质体
分离的酶组合是
!,">
纤维素酶
_",$">
离析酶
@,@
!
不同渗透压对葡萄叶片和愈伤组织分离的原
生质体产量及活力的影响
采用上述所得到的最佳酶解液组合"即酶液组
合
##
处理葡萄叶片和用酶液组合
&
处理葡萄愈伤
组织#!酶解
#*9
!分析不同浓度甘露醇"
,*
*
",$
*
",&
*
",+385
%
?
#对叶片和愈伤组织中分离的原生
质体产量和活力的影响结果"图
%
#显示!原生质
体只有在渗透压最适宜的时候!产量和活力才较高!
否则无论渗透压高低!产量和活力都会下降其中!
当甘露醇浓度为
",&385
%
?
时!每克叶片原生质体
产量达到最高"
%,"1@#"
& 个#!具有活力的原生质
体产量
!,*$@#"
& 个!活力
+1,!1>
!与其他处理具
有活力的原生质体产量多有显著差异"图
%
!
I
#&当
甘露醇浓度为
",$385
%
?
时!每克愈伤组织产量和
活力达到最佳!产量为
$,1*@#"
& 个!具有活力的原
生质体产量
*,(!@#"
& 个!活力
(#,#*>
!与其他处
理具有活力的原生质体产量有显著差异"图
%
!
W
#
@,A
!
不同酶解时间对葡萄叶片和愈伤组织原生质
体产量及活力的影响
采用上述所得到的最佳酶解液组合和最佳甘露
醇浓度!进行连续取样观察!分析不同酶解时间对葡
萄叶片和愈伤组织中原生质体分离效果的影响结
果"图
*
#显示!叶片和愈伤组织的最佳酶解时间均
为
#*9
此时每克叶片原生质体产量
*,"1@#"
&
个!具有活力的原生质体产量
%,*"@#"
& 个!活力
(%,#!>
!是叶片所有处理中最高的!与其他处理具
图
#
!
不同酶组合对(黑香蕉)葡萄叶片原生质体产量和活力的影响
不同小写字母表示各处理间
","$
水平差异显著性&下同
G.
P
,#
!
2;;<7V/8;<0S
3<783
C
8/.V.8080
S
.<5=40=X.4Y.5.V
S
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P-
.48
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U8V8
C
54/V
W4U/[.V9=.;;P
0.;.740V5
S
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O9图
!
!
不同酶组合对(黑香蕉)葡萄愈伤组织原生质体产量和活力的影响
G.
P
,!
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.<5=40=X.4Y.5.V
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C
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C
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$&!#
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期
!!!!!!!!!!!!!
舒小娟!等$葡萄原生质体分离及瞬时转化体系的建立
图
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不同浓度甘露醇对(黑香蕉)葡萄原生质体产量和活力的影响
I,
叶片&
W,
愈伤组织&图
*
同
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不同酶解时间对(黑香蕉)葡萄原生质体产量和活力的影响
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有活力的原生质体产量均有显著差异"图
*
!
I
#&每
克愈伤组织原生质体产量
&,"$@#"
& 个!具有活力
的原生质体产量
$,"1@#"
& 个!活力
(*,#%>
!是愈
伤组织所有处理中最高的!与其他处理均有显著差
异"图
*
!
W
#原生质体在酶解时间最适宜的时候其
产量和活力才能达到最高随着酶解时间的增长!
原生质体活力和产量先增后降!因此!有效的原生质
体产量会在一定时间段内达到最高&若酶解时间过
短!原生质体之间会出现较多的粘连片段和较大细
胞团!而若酶解时间过长!原生质体的活力会大大降
低因此!为确保得到活力较高的原生质体!葡萄叶
片和愈伤组织的酶解时间尽量控制在
#*9
左右
@,B
!
葡萄叶片和愈伤组织原生质体的转化
由于叶肉细胞中含有叶绿体!其自发荧光会干
扰
BGA
的观测效果!所以日常实验中常用愈伤组织
或黄化子叶进行原生质体的转化实验由于葡萄愈
伤组织无论是原生质体产量还是活力都大于叶片!
并且没有叶绿体的自发荧光信号干扰!因此利用葡
萄愈伤组织分离的原生质体是一种理想材料而本
试验利用葡萄叶片和愈伤组织分离的原生质体进行
了遗传转化体系的比较和研究
将制备好的葡萄叶片和愈伤组织的原生质体用
C
2DE)F?
载体转化!在
!*`
条件下黑暗培养
#!
"
#&9
!用荧光显微镜观察结果"图
$
#显示$未进行
质粒转化的叶片原生质体只有红色的叶绿体自发荧
光"图
$
!
I
#利用叶片原生质体进行质粒转化后!
由于自身具有叶绿体应发红光!但与绿色荧光信号
"
BGA
#叠加后则呈现黄色荧光"图
$
!
W
#利用愈伤
组织分离的原生质体进行质粒转化后!由于体内没
有叶绿体自发荧光!因此清晰地观察到有稳定表达
的绿色荧光信号!与明场叠加发现绿色荧光信号与
原生质体位置吻合"图
$
!
T
#说明带有
BGA
的质
粒
HFI
可高通量进入葡萄叶片和愈伤组织原生质
体中并稳定表达
%
!
讨
!
论
在其他物种原生质体的分离过程中!研究人员
用纤维素酶*离析酶*果胶酶*半纤维素酶*崩溃酶等
多种酶类做过酶解效率的探索!其中纤维素酶*离析
酶的使用较为广泛+(,孙鹤等+!#,用纤维素酶和离
析酶从玉米*小麦*水稻中游离出较高质量的原生质
体&廖嘉明等+!!,在拟南芥中使用这
!
种酶!每克叶
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西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
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卷
图
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载体转化葡萄原生质体
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未经转化的叶片原生质体&
W,
转入
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的叶片原生质体&
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转入
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的愈伤组织原生质体
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& 个!活力为
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景艳春等+!%,在每克新疆杨叶肉中游离出
原生质体达
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& 个!活力为
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李玉
珠等+!*,以
*
个适宜西北内陆黄土高原地区栽培的
苜蓿愈伤组织为材料!探索了各影响因素对原生质
体分离和培养的影响!每克组织游离出的原生质体
#@#"
&
"
!@#"
& 个!活力最高可达
(">
"
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在
本研究中发现!用浓度为
!>
纤维素酶和
",$>
离析
酶消化葡萄愈伤组织&用浓度为
%>
纤维素酶和
",+$>
离析酶消化葡萄叶片已经可以分离出足够量
的原生质体!效率较高
此外!其他研究人员在试验中发现!酶解时间*
溶液渗透压*分离的离心速度和离心时间对原生质
体分离的产量和活力也有较大影响+!,!但是不同物
种间最佳酶解时间和溶液渗透压差别较大!最适的
离心速度和离心时间几乎没有差别常用的渗透压
稳定剂主要有甘露醇*蔗糖*山梨醇等!其中甘露醇
在原生质体分离中的应用最为广泛+*!(!#$,!本研究使
用的渗透压稳定剂就是甘露醇发现葡萄叶片原生
质体分离的最适酶解时间为
#*9
!最适甘露醇浓度
为
",&385
-
?
#
!与袁彬等+#&,取得的结果相似同
时发现愈伤组织原生质体的渗透压小于叶片原生质
体!可以推断在葡萄中叶片胞质较浓!愈伤组织胞内
的渗透压小于叶片
对不同物种的研究表明!植物不同组织最佳体
系分离得到的原生质体产量一般为
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+
个!活力一般为
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"
1">
本研究中!应用最佳
体系!每克叶片游离得到的原生质体产量为
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& 个!活力为
(%,#!>
&每克愈伤组织原生质体产
量为
&,"$@#"
& 个!活力为
(*,#%>
使用愈伤组
织来制备原生质体无论是产量还是活力都要优于使
用叶片!所以如果不是探究叶绿体相关的生理生化
和分子特性!推荐使用葡萄愈伤组织进行原生质体
的分离
目前虽然已经有关于葡萄的原生质体分离体系
的报道!但是关于葡萄原生质体遗传转化的试验还
鲜有报道采用
BGA
"绿色荧光蛋白#*
TGA
"青色
荧光蛋白#*
dGA
"黄色荧光蛋白#等荧光标记*通过
荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜检测!可以简单
方便地确定目标蛋白在细胞中的定位通过本试验
可观察到!葡萄原生质体中的叶绿体会产生自发荧
光!影响绿色荧光蛋白的观测!而暗培养的愈伤组织
+&!#
&
期
!!!!!!!!!!!!!
舒小娟!等$葡萄原生质体分离及瞬时转化体系的建立
没有成熟的叶绿体!所以愈伤组织分离的原生质体
可以作为瞬时转化的理想材料本研究利用葡萄叶
片和愈伤组织原生质体原生质体!采用
A2B
介导法
顺利将
C
2DE)F?)BGA
载体导入原生质体并成功表
达!为相关分子机制研究奠定基础此外!分离出高
质量的叶片原生质体!也可为分子育种和杂交育种
提供材料依据
参考文献!
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