全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４４(１): ４６￣５３(２０１４)
收稿日期: ２０１３￣０１￣１０ꎻ 修回日期: ２０１３￣１０￣２０
基金项目: 浙江丽水市科技计划项目(２０１０ＪＹＺＢ０８)ꎻ 浙江省自然科学基金资助项目(ＬＹ１２Ｃ１４００３)
通讯作者: 夏更寿ꎬ副教授ꎬ主要从事应用生物技术及植物抗性生理研究ꎻ Ｔｅｌ: ０５７８￣２２７１３１０ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｌｓｘｙｘｇｓ＠１６３.ｃｏｍꎮ
水稻白叶枯病菌酸性还原酮加双氧酶的鉴定分析
夏更寿１∗ꎬ 张 燕２ꎬ 宋从凤２ꎬ 王金生２
( １丽水学院生态学院ꎬ 丽水 ３２３０００ꎻ ２ 南京农业大学植物保护学院 分子植物病理学国家重点实验室ꎬ 南京 ２１００９５)
摘要:酸性还原酮加双氧酶(ＡＲＤ)催化很多原核和真核生物中的甲硫氨酸急救途径(ＭＳＰ)倒数第二步ꎮ 本研究鉴定了水
稻白叶枯病菌 Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ ( Ｘｏｏ)中的酸性还原酮加双氧酶ꎬ命名为 ｘａｒｄꎮ Ｘｏｏ 菌株 ＰＸＯ９９Ａ、
ＭＡＦＦ３１１０１８和 ＫＡＣＣ１０３３１中的 ｘａｒｄ核苷酸序列完全相同ꎮ ｘａｒｄ基因突变菌株在甲硫基腺苷(ＭＴＡ)为唯一硫源时不能
正常生长ꎮ 这一结果证明 Ｘａｒｄ在 ＭＳＰ中起作用ꎮ ｘａｒｄ突变体和野生型菌株 ＰＸＯ９９Ａ接种水稻 ＩＲ２４后病斑长度数据表明
该基因突变对 Ｘｏｏ在水稻上的毒性没有影响ꎮ
关键词: Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅꎻ 酸性还原酮加双氧酶ꎻ 鉴定ꎻ 分析
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｃｉｒｅｄｕｃｔｏｎｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ
ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ 　 ＸＩＡ Ｇｅｎｇ￣ｓｈｏｕ１ꎬ ＺＨＡＮＧ Ｙａｎ２ꎬ ＳＯＮＧ Ｃｏｎｇ￣ｆｅｎｇ２ꎬ ＷＡＮＧ Ｊｉｎ￣ｓｈｅｎｇ２ 　 ( １ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ
Ｅｃｏｌｏｇｙꎬ Ｌｉｓｈｕｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｌｉｓｈｕｉ ３２３０００ꎬＣｈｉｎａꎻ ２ Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃ￣
ｔｉｏｎꎬ Ｎａｎｊｉｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００９５ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ａｃｉｒｅｄｕｃｔｏｎｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ (ＡＲＤ) ｉｓ ａｎ ｅｎｚｙｍｅ ｃａｔａｌｙｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｅｎｕｌｔｉｍａｔｅ ｓｔｅｐ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ
ｓａｌｖａｇｅ ｐａｔｈｗａｙ (ＭＳＰ) ｉｎ ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ａｎｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ. Ｈｅｒｅ ｔｈｅ ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｘａｎ￣
ｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ (Ｘｏｏ)ꎬ ｎａｍｅｄ ｘａｒｄ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ. Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｘａｒｄ ｓｈａｒｅｄ ｔｈｅ
ｅｎｔｉｒｅ ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ ｉｎ Ｘｏｏ ｓｔｒａｉｎｓ ＰＸＯ９９Ａꎬ ＭＡＦＦ３１１０１８ ａｎｄ ＫＡＣＣ１０３３１. Ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｍ ｏｆ
ｘａｒｄ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｇｒｏｗ ｎｏｒｍａｌｌｙ ｗｈｅｎ ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ (ＭＴＡ) ａｓ ｔｈｅ ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ ｓｕｌｆｕｒ ｓｏｕｒｃｅ. Ｔｈｉｓ ｒｅｓｕｌｔ
ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｔｈａｔ Ｘａｒｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｅｄ ｉｎ ＭＳＰ. Ｐｏｓｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｘａｒｄ ｍｕｔａｎｔ ａｎｄ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ ＰＸＯ９９Ａ ｏｎ ｒｉｃｅ
ｌｉｎｅ ＩＲ２４ꎬ ｔｈｅ ｌｅｓｉｏｎ ｌｅｎｇｔｈ ｄａｔａ ｏｆ １５ ｄａｙｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｘａｒｄ ｇｅｎｅ ｈａｄ ｎｏ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ
Ｘｏｏ ｉｎ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔ ＩＲ２４.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅꎻ ａｃｉｒｅｄｕｃｔｏｎｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅꎻ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎꎻ ａｎａｌｙｓｉｓ
中图分类号: Ｓ４３５.１１１.４７　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０１￣００４６￣０８
　 　 甲硫氨酸急救途径 ( ｔｈｅ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓａｌｖａｇｅ
ｐａｔｈｗａｙꎬ ＭＳＰ) 广泛存在于真核和原核生物
中[１~６]ꎮ ＭＳＰ是甲硫氨酸再循环途径ꎬ调节一些重
要代谢物ꎬ其中包括 Ｓ￣腺苷酰甲硫氨酸(Ｓ￣ａｄｅｎｏ￣
ｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅꎬ ＳＡＭꎬ或 ＡｄｏＭｅｔ)和甲硫基腺苷
(ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏａｄｅｎｏｓｉｎｅꎬ ＭＴＡ)ꎮ ＳＡＭ 由甲硫氨酸
合成ꎬ提供不同的基团生成其它代谢产物ꎬ调节甲
基化或者基因表达[７~９]ꎮ ＳＡＭ 合成多氨过程中生
成 ＭＴＡꎬＭＴＡ 是多氨合成和转甲基反应的抑制
子[１０~１２]ꎮ 多氨是细胞生长和增殖所必需的[１２]ꎮ
因此ꎬ细胞内 ＭＴＡ浓度必须通过 ＭＳＰ严格控制ꎮ
酸性还原酮加双氧酶 (Ａｃｉｒｅｄｕｃｔｏｎｅ ｄｉｏｘｙ￣
ｇｅｎａｓｅꎬ ＡＲＤ)催化 ＭＳＰ倒数第二步[２ꎬ ７]ꎮ 克雷伯
氏菌属(Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ)菌株 ８７２４ 中一种形式的酸性
还原酮加双氧酶(ＦｅＡＲＤ′)含有一个二价铁离子
(Ｆｅ２＋)ꎬ转变酸性还原酮 １ꎬ２￣二羟基￣３￣酮￣５￣甲硫
基￣１￣戊 烯 ( １ꎬ ２￣ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ￣３￣ｏｘｏ￣５￣ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ￣１￣
ｐｅｎｔｅｎｅ) 生成甲酸盐和 ２￣酮￣４￣甲硫基丁酸盐
　
　 １期 夏更寿ꎬ等:水稻白叶枯病菌酸性还原酮加双氧酶的鉴定分析
(２￣ｋｅｔｏ￣４￣ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｂｕｔｙｒａｔｅꎬ ＫＭＴＢ)ꎮ ＫＭＴＢ 是
ＭＳＰ中甲硫氨酸的前体ꎮ 菌株 ８７２４ 中另一种形
式的酸性还原酮加双氧酶(ＮｉＡＲＤ)含有一个二价
镍离子 Ｎｉ２＋ꎬ催化与 ＦｅＡＲＤ′相同底物的氧化支路
生成一氧化碳、甲酸盐和甲硫基丙酮酸盐(ｍｅｔｈｙｌ￣
ｔｈｉｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ) [３ꎬ１３]ꎮ 这两种形式的酶多肽序列相
同ꎬ且都是称为 ｃｕｐｉｎｓ 的结构超家族成员[１４]ꎬ唯一
不同 之 处 是 含 有 不 一 样 的 金 属 离 子[１３ꎬ１４]ꎮ
ＦｅＡＲＤ′和 ＮｉＡＲＤ 中与铁离子和镍离子作用的 ４
个残基也相同ꎬ分别是 Ｈｉｓ９６、Ｈｉｓ９８、Ｇｌｕ１０２ 和
Ｈｉｓ１４０[１５]ꎮ ＮｉＡＲＤ催化的反应生成产物之前形成
一个 ４个原子的过氧化物环ꎬ而 ＦｅＡＲＤ′催化的反
应生成产物前形成一个 ５ 个原子的过氧化物
环[１６]ꎮ 这 ２个酶的活性在枯草芽胞杆菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ)中都已被证实[１７]ꎮ
真核生物中 ＡＲＤ 的同源物除了具有 ＡＲＤ 活
性外ꎬ还表现出许多其它的作用[１８￣２１]ꎮ 人类的
ＡＲＤ 同源物￣ＭＴＣＢＰ１ (ｍｅｍｂｒａｎｅ￣ｔｙｐｅ １ ｍａｔｒｉｘ
ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔａｉｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ￣１ꎬ
命名为 ｈＡＤＩ１)ꎬ证实在酵母中有 ＡＲＤ活性[１８ꎬ ２０]ꎮ
过表达 ＭＴＣＢＰ１ 抑制由 ＭＴ１￣ＭＭＰ (ｍｅｍｂｒａｎｅ￣
ｔｙｐｅ １ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ)促进的细胞移动和
侵入[１８]ꎮ 老鼠中 ＡＲＤ 同源物￣ＡＬＰ１ (ＡＲＤ￣ｌｉｋｅ
ｐｒｏｔｅｉｎ １)有促进凋亡的活性并且被雄性荷尔蒙强
烈诱导[１９]ꎮ ＭＴＣＢＰ１和 ＡＬＰ１ 分别在人肿瘤细胞
和鼠前列腺肿瘤细胞中表达下调[１８ꎬ１９]ꎮ ｈＡＤＩ１ 很
可能在信使 ＲＮＡ (ｍＲＮＡ)加工过程中起作用[２１]ꎮ
水稻白叶枯病菌 Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ.
ｏｒｙｚａｅ (Ｘｏｏ)推测的ＭＳＰ中已经鉴定了烯醇化酶￣
磷酸酯酶 ｘｅｐ (Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｅｎｏｌａｓｅ￣ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ)
基因[２２]ꎮ 但 Ｘｏｏ 推测的 ＭＳＰ 中其它基因的功能
还没有被证实ꎬ这些基因对 Ｘｏｏ 在水稻上的致病
性有没有影响ꎬ影响程度有多大均不明确ꎮ 本研究
克隆了水稻白叶枯病菌酸性还原酮基因ꎬ命名为
ｘａｒｄ (Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｃｉｒｅｄｕｃｔｏｎｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ)ꎬ证
实了该基因在 ＭＳＰ 中的功能ꎬ并验证了其是否影
响 Ｘｏｏ致病性ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 细菌菌株、质粒和培养条件
水稻白叶枯 Ｘｏｏ 菌株 ＰＸＯ９９Ａ、大肠杆菌
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α、Ｓ１７￣１ 和 Ｓ１７￣１ λ ｐｉｒꎬ以及
研究中用到的质粒与已发表的文章描述相同(表
１) [２２]ꎮ ｐＫＣｘａｒｄ 和 ｐＵｘａｒｄ 是 ２ 个构建的质粒ꎮ
ｐＫＣｘａｒｄ是载体 ｐＫＮＯＣＫ￣Ｃｍ 带有 ｘａｒｄ 基因中
２５４ ｂｐ 片段ꎮ ｐＵｘａｒｄ 是指载体 ｐＵＦＲ０３４ 带有整
个 ６４２ ｂｐ 的 ｘａｒｄ 基因ꎮ 水稻白叶枯 Ｘｏｏ 菌株接
在 Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ (ＮＢ)内ꎬ２８℃培养ꎮ 大肠杆菌接
在 Ｌｕｒｉａ￣Ｂｅｒｔａｎｉ (ＬＢ)培养基内ꎬ３７℃培养ꎮ
１.２　 ｘａｒｄ基因克隆和测序
根据 Ｘｏｏ 菌株 ＫＡＣＣ１０３３１ 基因组序列( ｔｈｅ
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎꎬ ｈｔ￣
ｔｐ: / / ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ)ꎬ设计特异性引物 Ｐｘ￣
ａｒｄ￣１和 Ｐｘａｒｄ￣２ (表 ２)ꎮ 以 Ｘｏｏ 菌株 ＰＸＯ９９Ａ基
因组 ＤＮＡ 为摸板ꎬＰＣＲ 扩增得到产物ꎬ纯化后连
接到载体 ｐＭＤ１８￣Ｔ 并测序ꎮ 序列比对使用
ＤＮＡＳｔａｒ软件ꎮ
１.３　 ｘａｒｄ 基因突变和互补试验
ｘａｒｄ 基因中 ２５４ ｂｐ 片段通过引物 ＰＭｘａｒｄ￣１
和 ＰＭｘａｒｄ￣２扩增得到ꎬ克隆到载体 ｐＫＮＯＣＫ￣Ｃｍ
中得到 ｐＫＣｘａｒｄꎮ 通过方法[２３] 得到 Ｓ１７￣１λｐｉｒ /
ｐＫＣｘａｒｄꎮ 用同样的方法得到 ｘａｒｄ 基因的突变
体[２２]ꎮ 引物 Ｐｘａｒｄ￣１和 Ｐｘａｒｄ￣２ 用来检测 ｘａｒｄ 基
因和“双拷贝”片段ꎮ 另一对引物 Ｐｃａｔ￣１和 Ｐｃａｔ￣２
用来检测氯霉素抗性基因(ｃａｔ)ꎮ
野生型菌株中 ｘａｒｄ基因克隆到载体 ｐＵＦＲ０３４
中得到 ｐＵｘａｒｄꎮ ｐＵｘａｒｄ 转化到 Ｓ１７￣１ 中ꎬ两亲交
配方法转入 ｘａｒｄ 突变体中ꎬ进行功能互补试验ꎮ
１.４　 硫源利用测试
硫源利用培养基和试验方法参考文献[２２]ꎮ
Ｌ￣甲硫氨酸(Ｍ９６２５)和甲硫基酰苷(Ｄ５０１１)购自
Ｓｉｇｍａ公司ꎮ
１.５　 剪叶接种试验
菌株 ＰＸＯ９９Ａ、Ｍｘａｒｄ３ 和 Ｍｘａｒｄ３ / ｐＵｘａｒｄ 培
养到终浓度为 １０８ ＣＦＵ / ｍＬꎮ 用剪叶接种的方法
将 ３个菌株菌液接种到温室中苗龄 ２１ ｄ 的 ＩＲ２４
水稻品种的叶片上[２４]ꎬ１５ ｄ 后测量病斑ꎮ 得到 ５
张叶片病斑平均值ꎬ试验重复 ３次ꎮ
７４
　
植物病理学报 ４４卷
Ｔａｂｌｅ １　 Ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ Ｒｅｌｅｖａｎｔ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｏｒ ｓｏｕｒｃｅ
Ｓｔｒａｉｎｓ
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ
ＰＸＯ９９Ａ Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅ ｒａｃｅ ６ꎬ Ｒｉｆｒꎬ Ｓｐｓꎬ Ｋｍｓꎬ Ｃｍｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ. (１９９２) [２６]
Ｍｘａｒｄ２ ｘａｒｄ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ＰＸＯ９９Ａꎬ Ｒｉｆｒꎬ Ｃｍｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｍｘａｒｄ３ ｘａｒｄ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ＰＸＯ９９Ａꎬ Ｒｉｆｒꎬ Ｃｍｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＤＨ５α Ｆ’ｒｅｃＡꎬΦ８０ ｄ ｌａｃＺꎬ ΔＭ１５ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
Ｓ１７￣１ ２９４ ｒｅｃＡꎬ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｌｙ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＲＰ４ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅꎬ Ｔｐｒꎬ Ｓｐｒ Ｓｉｍｏｍ ｅｔ ａｌ. (１９８３) [２７]
Ｓ１７￣１ λｐｉｒ ２９４ ｒｅｃＡꎬ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｌｙ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＲＰ４ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅꎬ Ｔｐｒꎬ Ｓｐｒ
Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ
Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ(ＣＢＳ)
Ｐｌａｓｍｉｄｓ
ｐＭＤ１８￣Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ａｐｒꎬ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ
ＴａＫａＲａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ(Ｄａｌｉａｎ)
Ｃｏ.ꎬ Ｌｔｄ
ｐＵＦＲ０３４
ＩｎｃＷꎬ Ｍｏｂ(ｐ)ꎬ Ｍｏｂ＋ꎬ ＬａｃＺａ＋ꎬ
ＰＫ２ ｒｅｐｌｉｃｏｎꎬ ｃｏｓｍｉｄꎬ Ｋｍｒ
ＤｅＦｅｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ. (１９９０) [２８]
ｐＭｘａｒｄ２ Ｐｌａｓｍｉｄ ｐＭＤ１８￣Ｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ６４２ ｂｐ ｘａｒｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｐＭｘａｒｄ３ Ｐｌａｓｍｉｄ ｐＭＤ１８￣Ｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ６４２ ｂｐ ｘａｒｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｐＵｘａｒｄ２ Ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＵＦＲ０３４ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ６４２ ｂｐ ｘａｒｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｐＵｘａｒｄ３ Ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＵＦＲ０３４ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ６４２ ｂｐ ｘａｒｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｐＫＮＯＣＫ￣Ｃｍ Ｇａｍｍａ￣Ｒ６Ｋꎬ Ｃｍｒꎬ Ｍｏｂ＋
Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ
Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ(ＣＢＳ)
ｐＫＣｘａｒｄ２ ｐＫＮＯＣＫ￣Ｃｍ ｐｌａｓｍｉｄ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ２５４ ｂｐ ｉｎｓｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｘａｒｄ ｇｅｎｅ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｐＫＣｘａｒｄ３ ｐＫＮＯＣＫ￣Ｃｍ ｐｌａｓｍｉｄ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ２５４ ｂｐ ｉｎｓｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｘａｒｄ ｇｅｎｅ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′→ ３′) Ｐｕｒｐｏｓｅ
Ｐｘａｒｄ￣１ ＧＧＡＡＴＴＣＧＴＧＣＧＡＡＣＴＣＧＡＡＣＴＧＣＴ Ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ６４２ ｂｐ ｘａｒｄ ｇｅｎｅ
Ｐｘａｒｄ￣２ ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＴＧＡＧ
ＰＭｘａｒｄ￣１ ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＴＣＡＴＧＧＡＣ Ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ２５４ ｂｐ ｉｎｓｉｄｅ ｏｆ ｔｈｅ ｘａｒｄ ｇｅｎｅ
ＰＭｘａｒｄ￣２ ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＡＣＧＧＣＡＡＴＣＡＧＡＴＣＧＴ
Ｐｃｍｒ ￣１ ＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＴＣＡＣＴＧＧＡＴＡＴＡ Ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ (ｃａｔ) ｉｎ ｘａｒｄ ｍｕｔａｎｔ
ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ａｌｓｏ ｔｏ ｇａｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｂｅ ｆｏｒ ｍｕｔａｎｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＰｃｍｒ ￣２ ＴＴＡＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣＴＣＡＴＣＧ
　 　 Ｎｏｔｅ: Ｔｈｅ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ ｂａｓｅｓ ａｒｅ ｔｈｅ ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ.
２　 结果与分析
２.１　 ｘａｒｄ基因序列
ｘａｒｄ基因全长 ６４２ ｂｐꎬ编码 ２１３个氨基酸残基
蛋白序列ꎮ ＰＣＲ 方法得到的 ＰＸＯ９９Ａ ｘａｒｄ 核苷酸
序列与 ＧｅｎＢａｎｋ 中得到的 Ｘｏｏ 菌株 ＭＡＦＦ３１１０１８
(ＡＰ００８２２９)、ＫＡＣＣ１０３３１ (ＡＥ０１３５９８)和 ＰＸＯ９９Ａ
(ＣＰ０００９６７)相应基因序列具有 １００％一致性ꎮ 与
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ (ＡＭ０３９９５２)、
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｃｉｔｒｉ ｓｔｒ. ３０６ (ＡＥ００８９２３)、
８４
　
　 １期 夏更寿ꎬ等:水稻白叶枯病菌酸性还原酮加双氧酶的鉴定分析
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ (ＡＥ００８９２２、
ＡＭ９２０６８９和 ＣＰ００００５０)中该基因序列具有 ９９％
一致性ꎮ
ＰＸＯ９９Ａ 中 Ｘａｒｄ 氨基酸序列与 Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ
ｐｎｅｕｍｏｎｉｏｎ ( ＡＡＤ１１７９３ ) 中 Ｅ￣２ / Ｅ￣２′ ( ＡＲＤ /
ＡＲＤ′)有 ４８.３％序列同源性ꎮ 序列比对结果显示ꎬ
Ｘａｒｄ中 ４ 个残基 １２２(Ｈｉｓ)、１２４(Ｈｉｓ)、１２８(Ｇｌｕ)
和 １６６ ( Ｈｉｓ) 分别对应于 Ｋ. ｐｎｅｕｍｏｎｉｏｎ 菌株
ＡＴＣＣ８７２４ ４ 个相同氨基酸残基 ９６ (Ｈｉｓ)ꎬ ９８
(Ｈｉｓ)ꎬ １０２(Ｇｌｕ)和 １４０ (Ｈｉｓ) (图 １)ꎬＡＴＣＣ８７２４
的这 ４ 个残基已被证明是与二价离子结合的位
点[１５]ꎮ 表明 Ｘａｒｄ能正常结合 Ｆｅ２＋或者 Ｎｉ２＋ꎮ
２.２　 ｘａｒｄ突变体获得与鉴定
突变体菌株 Ｍｘａｒｄ２ 和 Ｍｘａｒｄ３ 通过同源单交
换得到(图 ２￣Ａ)ꎮ 为验证 Ｍｘａｒｄ２ 和 Ｍｘａｒｄ３ 基因
组的确带有一个失活的 ｘａｒｄ 基因ꎬ通过 ＰＣＲ 和
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ检测了备选菌株ꎮ 以 Ｍｘａｒｄ２ 和 Ｍｘ￣
ａｒｄ３基因组为模板、以 Ｐｃａｔ￣１和 Ｐｃａｔ￣２为引物ꎬ扩
增 ６６０ ｂｐ 氯霉素抗性基因ꎬ产物电泳后条带明显
大于 ５００ ｂｐꎬ 而用同样引物并以 ＰＸＯ９９Ａ 基因组
为模板时扩增不出条带(图 ２￣Ｂ)ꎮ 使用引物 Ｐｘ￣
ａｒｄ￣１和 Ｐｘａｒｄ￣２ꎬ以Ｍｘａｒｄ２和Ｍｘａｒｄ３基因组为模
板时ꎬＰＣＲ产物电泳条带大于 ２.０ ｋｂ 双拷贝ꎬ而以
ＰＸＯ９９Ａ基因组 ＤＮＡ 为摸板ꎬ扩增的 ＰＣＲ 产物电
泳条带在 ５００ ｂｐ和 ７５０ ｂｐ之间(图 ２￣Ｂ)ꎮ
提取 ＰＸＯ９９Ａ、 Ｍｘａｒｄ２ 和 Ｍｘａｒｄ３ 基因组
ＤＮＡꎬＫｐｎ Ⅰ(质粒 ｐＫＮＯＣＫ￣Ｃｍ中只有一个该酶
切位点)酶切后电泳转膜ꎬ与 ＤＩＧ 标记的和 ｃａｔ 基
因片段杂交ꎬＭｘａｒｄ２ 和 Ｍｘａｒｄ３ 基因组 ＤＮＡ 与
ｘａｒｄ基因标记片段杂交后出现 ２ 条带ꎬ大条带在
４~５ ｋｂ 之间ꎬ小条带在 １. ５ ~ ２. ０ ｋｂ 之间ꎬ而
ＰＸＯ９９Ａ 基因组 ＤＮＡ 与 ｘａｒｄ 基因标记片段杂交
后只出现一条带ꎬ大小也在 ４ ~ ５ ｋｂ 之间ꎬ但略小
于突变体基因组与 ｘａｒｄ 基因标记片段杂交带ꎮ
Ｍｘａｒｄ２和 Ｍｘａｒｄ３基因组与抗氯霉素基因标记片
段杂交后ꎬ出现一条接近 ５.０ ｋｂ 杂交带ꎬＰＸＯ９９Ａ
基因组 ＤＮＡ 与抗氯霉素基因标记片段杂交无条
带出现(图 ２￣Ｃ)ꎮ
２.３　 以 Ｌ￣甲硫氨酸或ＭＴＡ为唯一硫源的生长
为了解 ｘａｒｄ 基因是否在 Ｘｏｏ 推测的 ＭＳＰ 途
径下游起作用ꎬ检测了细菌在不同硫源上生长情
况ꎮ 菌株 ＰＸＯ９９Ａ、突变体 Ｍｘａｒｄ３ 和互补菌株
Ｍｘａｒｄ３ / ｐＵｘａｒｄ接种在不同硫源培养基上ꎬ２８°Ｃ
培养ꎮ ３个菌株在不含硫源培养基上均不能生长ꎬ
而在 Ｌ￣甲硫氨酸为唯一硫源培养基上均生长正
常ꎮ ＰＸＯ９９Ａ 和 Ｍｘａｒｄ３ / ｐＵｘａｒｄ能在 ＭＴＡ为唯一
硫源培养基上生长ꎬ但突变体 Ｍｘａｒｄ３ 在 ＭＴＡ 为
唯一硫源培养基上不能生长(图 ３)ꎮ 上述结果证
明 ｘａｒｄ 基因在甲硫氨酸急救途径中起作用ꎮ
２.４　 ｘａｒｄ基因对 Ｘｏｏ菌株 ＰＸＯ９９Ａ 致病性影响
菌株 ＰＸＯ９９Ａ、突变体 Ｍｘａｒｄ２和 Ｍｘａｒｄ３ 培养
至浓度为 １０８ ＣＦＵ / ｍＬꎬ接种水稻品种 ＩＲ２４ꎬ１５ ｄ
后测量病斑ꎬ取平均值ꎮ 如表 ３ 所示ꎬ突变体 Ｍｘ￣
ａｒｄ２和Ｍｘａｒｄ３与野生型菌株 ＰＸＯ９９Ａ 平均病斑长
度相差不到 １ ｃｍꎬ最大病斑长度相差 １.５ ｃｍ左右ꎬ
方差分析结果表明突变体和野生型菌株在水稻品
种 ＩＲ２４上病斑长度没有显著差异ꎬ说明 ｘａｒｄ 基因
突变对 Ｘｏｏ ＰＸＯ９９Ａ 菌株在 ＩＲ２４上致病性没有影
响ꎮ
Ｆｉｇ. １　 Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅｓ ｆｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｍｅｔａｌ ｉｏｎ ｉｎ Ｘａｒｄ
Ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｆｏｕｒ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ Ｘａｒｄ ａｎｄ ＡＡＤ１１７９３ ａｒｅ ｍａｒｋｅｄ ｉｎ ｇｒｅｙ ａｎｄ
ｔｈｏｓｅ ｆｏｕｒ ｉｎ ＡＡＤ１１７９３ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｔｏ ｂｅ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅｓ ｆｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｍｅｔａｌ ｉｏｎ.
９４
　
植物病理学报 ４４卷
Ｆｉｇ. ２　 Ｍｕｔａｎｔ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
Ａ:Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ａ ２５４ ｂｐ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｘａｒｄ ｇｅｎｅ
ｃｌｏｎｅｄ ｉｎ ｐＫＮＯＣＫ￣Ｃｍ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ＰＸＯ９９Ａ ｓｔｒａｉｎ. Ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ｌｏｃａｔｉｏｎｓ ｓｈｏｗｎ ｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ
ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ. Ｔｈｅ Ｋｐｎ Ⅰ ｓｉｔｅ ｓｈｏｗｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｏｒ ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ.
Ｂ:Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｔ ｇｅｎｅꎬ ｘａｒｄ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｘａｒｄ “ ｔｗｏ ｃｏｐｉｅｓ” ｆｒａｇｍｅｎｔｓ (ｓｈｏｗｎ ｉｎ Ａ ) ｂｙ ＰＣＲ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｕｔａｎｔｓ ａｎｄ ＰＸＯ９９Ａ . Ｃ: Ｋｐｎ Ⅰ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗａｓ ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ ｔｏ ｘａｒｄ ａｎｄ ｃａｔ
ｇｅｎｅ ｐｒｏｂｅｓ. Ｍ: ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒꎻ １ꎬ Ｍｘａｒｄ２ꎻ ２ꎬ Ｍｘａｒｄ３ꎻ ３ꎬ ＰＸＯ９９Ａꎻ ４ꎬ ＣＫꎬ ｎｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗａｓ ａｄｄｅｄ.
０５
　
　 １期 夏更寿ꎬ等:水稻白叶枯病菌酸性还原酮加双氧酶的鉴定分析
３　 讨论
硫是生命存在的六大元素之一ꎬ与碳、氢、氧、
氮和磷元素代谢研究相比ꎬ硫元素的研究甚少ꎮ
ＭＳＰ是硫代谢中含硫氨基酸补救途径之一[２５]ꎮ
预测的 Ｘｏｏ ＭＳＰ途径中已经克隆并验证了催化倒
数第三步的烯醇化酶￣磷酸酯酶 Ｘｅｐ[２２]ꎬ 本研究克
隆了催化倒数第二步的酸性还原酮加双氧酶
Ｘａｒｄꎬ 并验证了其在 ＭＳＰ 中起作用ꎬ这些结果表
明预测的 ＭＳＰ 中 ２ 个反应在 Ｘｏｏ 菌株中的确存
在ꎮ 尽管这 ２个酶的突变对 Ｘｏｏ致病性没有影响ꎬ
仍然不能断定 ＭＳＰ 中断或者 ＭＳＰ 中其它代谢物
生成与否对 Ｘｏｏ致病性没有影响ꎬ因此ꎬＭＳＰ 上游
基因的突变仍有待于研究ꎬ尤其是催化甲硫氨酸生
Ｆｉｇ. ３　 Ｇｒｏｗｔｈ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＰＸＯ９９Ａꎬ Ｍｘａｒｄ３ ａｎｄ Ｍｘａｒｄ３ / ｐＵｘａｒｄ ｏｎ ｖａｒｉｏｕｓ ｓｕｌｆｕｒ ｓｏｕｒｃｅｓ
Ａ: Ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｎｅｉｔｈｅｒ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｓｕｌｆａｔｅ ｎｏｒ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｕｌｆｕｒ. Ｂ: Ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｓ Ｌ￣ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ａｓ ｔｈｅ ｓｏｌｅ ｓｕｌｆｕｒ ｓｏｕｒｃｅ.
Ｃ: Ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｓ ＭＴＡ ａｓ ｔｈｅ ｓｏｌｅ ｓｕｌｆｕｒ ｓｏｕｒｃｅ.５０ μＬ ６７０ μｍｏｌ / Ｌ ＭＴＡ ｗａｓ
ａｄｄｅｄ ｔｏ ｅａｃｈ ｓｔｅｒｉｌｅ ｒｅｃｔａｎｇｌｅ ｏｆ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ.
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｌｅｓｉｏｎ ｌｅｎｇｔｈｓ ｏｆ ｍｕｔａｎｔｓ ａｎｄ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ＩＲ２４
ＩＲ２４
Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｐｏｔ / ｃｍ Ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｐｏｔ / ｃｍ
ＰＸＯ９９Ａ Ｍｘａｒｄ２ Ｍｘａｒｄ３ ＰＸＯ９９Ａ Ｍｘａｒｄ２ Ｍｘａｒｄ３
９.４０±１.７０ ８.５０±０.４０ ８.３４±０.０５ １３.３０ １１.８０ １１.２０
１５
　
植物病理学报 ４４卷
成 Ｓ￣腺苷酰甲硫氨酸(ＳＡＭ)的酶(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
中的 ＭｅｔＫ)以及催化 ＳＡＭ 生成 ＭＴＡ 的酶ꎬ这些
酶的突变研究对全面了解 Ｘｏｏ菌株中ＭＳＰ过程以
及与致病性的关系具有非常重要的意义ꎮ
甲硫氨酸是 ＭＳＰ 起始反应物ꎬ也是该急救途
径最后生成物ꎮ 甲硫氨酸是 ｍＲＮＡ翻译成蛋白时
需要的第一个氨基酸ꎬ因此ꎬ在维持细胞生存中起
举足轻重的作用ꎮ ｘａｒｄ 基因的突变ꎬ不一定会影
响 Ｘｏｏ细胞内甲硫氨酸的量ꎬ因为生成甲硫氨酸
有另外的途径存在ꎬ并且 Ｘｏｏ 菌株致病过程中很
可能从水稻叶片细胞中获得足够的甲硫氨酸为营
养ꎬ完成蛋白翻译等生命过程ꎮ
ＳＡＭ在硫代谢中起着非常重要的作用ꎬＳＡＭ
是合成多胺的代谢物ꎬ并且提供多种基团ꎬ包括甲
基、氨丁基、腺苷基等ꎬ参与调节甲基化等一系列重
要的生命活动过程[７ꎬ ２５]ꎮ 突变 ｘｅｐ 基因导致 ＳＡＭ
量降低 ４倍ꎬ并不影响 Ｘｏｏ在水稻上的致病性[２２]ꎮ
但如果突变催化生成 ＳＡＭ 的酶的基因ꎬ导致细胞
内不能生成 ＳＡＭꎬ是否会影响 Ｘｏｏ 致病性并不清
楚ꎮ
研究 Ｘｏｏ 预测的 ＭＳＰ 途径涉及的反应催化
酶ꎬ以及中间产物生成与量的改变ꎬ甚至与 ＭＳＰ途
径交叉相关的过程及产物ꎬ对于了解 Ｘｏｏ 的硫代
谢以及硫代谢与 Ｘｏｏ 致病性的关系都具有重要意
义ꎮ
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ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｇｒａｍ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ[ Ｊ] .
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ｓｈｕｔｔｌｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ [ Ｊ ] . Ｇｅｎｅꎬ
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责任编辑:于金枝
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