全 文 ：书羊草乙醛脱氢酶基因犔犮犃犔犇犎的克隆与表达分析
李新玲，吴姝菊，王全伟
（哈尔滨师范大学生命科学与技术学院，黑龙江 哈尔滨１５００２５）
摘要：采用ＲＡＣＥ技术从羊草中克隆了乙醛脱氢酶基因犔犮犃犔犇犎 的ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＥＦ４９２０４５）。长为
１７１２ｂｐ的犔犮犃犔犇犎ｃＤＮＡ序列含有编码５００个氨基酸的１５０３ｂｐ的开放读码框、６６ｂｐ的５′非翻译区和１４４ｂｐ
的３′非翻译区。氨基酸序列中含有醛脱氢酶家族绝对保守的谷氨酸活性位点和半胱氨酸残基活性位点。分析
犔犮犃犔犇犎 基因在不同胁迫条件下的表达情况，结果表明，犔犮犃犔犇犎 的表达受到低温、干旱、高盐和 ＡＢＡ的正调控
作用。研究结果为进一步从分子水平探明羊草的抗逆机制，挖掘并利用植物抗逆基因奠定基础。
关键词：羊草；乙醛脱氢酶；抗逆性
中图分类号：Ｑ９４３．２；Ｓ５４３＋．９０３．５３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１１）０４０１８７０７
各种逆境条件如干旱、高盐、低温、水淹或重金属等环境胁迫，都可以使活性氧物质（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ，
ＲＯＳ）在植物细胞中快速、大量的积累，从而造成氧化胁迫。氧化胁迫的危害包括２个方面：一方面是活性氧物质
直接损伤蛋白质、氨基酸和核酸，并导致膜脂的过氧化反应［１，２］；另一方面是膜脂的过氧化反应能产生一些如醛
类、烃类、酮和羟酸类等高活性的、有毒的化学物质，毒害细胞甚至导致细胞死亡［３６］。醛是膜脂过氧化反应的主
要产物，是一种活性氧诱导的高毒性物质，它对核酸、氨基酸和蛋白质等会造成严重伤害［７］，最终导致细胞死亡。
醛脱氢酶是生物体内活性氧物质清除过程中一类重要的酶类，它可以催化有毒的醛类氧化，形成对应的无毒羧
酸，维持生物机体中醛类物质的微量平衡［７］。乙醛脱氢酶（ａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＡＬＤＨ）能够催化乙醛、正丁
醛、肉桂醛、苯甲醛等有毒醛类进行快速脱氢，其活性的增强代表植物机体对醛解毒的防御机制进一步增强［８］。
迄今已从拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）、烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）、水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）、小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻
狏狌犿）、大豆（犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓）、玉米（犣犲犪犿犪狔狊）、大麦（犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲）、高粱（犛狅狉犵犺狌犿犫犻犮狅犾狅狉）、苔藓（犅狉狔狅狆犺狔
狋犪）等多种植物中分离到了乙醛脱氢酶基因的编码序列，其中一些植物的乙醛脱氢酶基因经分析认为，其受干旱、
高盐、ＡＢＡ、紫外线辐射等非生物胁迫的诱导且上调表达［９１４］。羊草（犔犲狔犿狌狊犮犺犻狀犲狀狊犻狊）为东北松嫩草原的建群
种，是一种耐逆性很强的优良牧草，也是分离抗逆基因和研究植物抗逆机制的良好植物材料［１５，１６］。本实验从灰
绿色羊草中分离得到了乙醛脱氢酶基因犔犮犃犔犇犎，研究了其表达模式，并对其功能进行了生物信息学分析和预
测，对于研究羊草乙醛脱氢酶基因家族具有重要意义，为进一步挖掘其他重要抗逆功能基因在羊草中的表达和调
控机制奠定了基础。
１ 材料与方法
１．１ 植物材料与逆境胁迫处理
灰绿型羊草种子，于２００７年由黑龙江省农业科学院草业研究所提供。羊草种子经０．１％ＨｇＣｌ消毒后，用清
水冲洗干净并播种在蛭石中，人工覆盖塑料薄膜培养。出苗后，每２ｄ浇１次 Ｈｏａｇｌａｎｄ全营养液，待小苗长至４
叶期时选取长势一致的羊草１２盆，随机分为４组，其中１组为对照（ＣＫ），单纯用 Ｈｏａｇｌａｎｄ全营养液浇灌，其他
４组分别进行高盐处理（５００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ）、ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ６０００）干旱处理（２０％）、低温处理（４℃）和
ＡＢＡ（ａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄ，脱落酸）处理（１００μｍｏｌ／Ｌ叶片喷施），处理后２，４，６，１２和２４ｈ分别取叶片，液氮速冻后
－８０℃保存备用。
第２０卷 第４期
Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．４
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
１８７－１９３
２０１１年８月
收稿日期：２０１１０１２０；改回日期：２０１１０３２３
基金项目：哈尔滨市青年科技创新人才基金（２００９ＲＦＱＸＮ１００）和哈尔滨师范大学博士启动基金资助。
作者简介：李新玲（１９７５），女，黑龙江龙江人，副教授。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｘｉｎｌｉｎｇ２００２＠１２６．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｓｈｕｊｕ１９６５＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
１．２ 羊草总ＲＮＡ的提取与ｃＤＮＡ第１链合成
总 ＲＮＡ提取采用ＴａＲａＫａ公司的 ＲＮＡｉｓｏ总ＲＮＡ 抽提试剂盒。用紫外分光光度计检测 ＲＮＡ 浓度并用
琼脂糖电泳检测 ＲＮＡ 完整性，经ＤＮａｓｅＩ处理后参照ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ ＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓ
ＳｙｓｔｅｍｆｏｒＲＴ－ＰＣＲｋｉｔ反转录获得ｃＤＮＡ第１链。
１．３ 乙醛脱氢酶基因犔犮犃犔犇犎 的克隆
根据ＧｅｎＢａｎｋ上公布的水稻、玉米、烟草、拟南芥的ＡＬＤＨ氨基酸序列，比较其同源性，在保守氨基酸ＡＰＡ
ＬＡＡＧＣＴ和 ＥＥＶＦＧＰＶ 区设计１对简并引物 Ｐ１：５′ＧＣＮＣＣＮＧＣＮＹＴＮＧＣＮＧＣＮＧＧＮＴＧＹＡＣ３′和 Ｐ２：
５′ＣＡＮＧＧＮＣＣＲＡＡＮＡＣＹＴＣＹＴＣ３′用于扩增基因保守序列（引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公
司完成，下同），获得的ＤＮＡ片段连接到ｐＧＥＭＴＥａｓｙ载体上，并送大连宝生物工程有限公司进行测序（下同）。
根据所获得保守序列的测序结果设计特异引物和巢式特异引物：ＲＡＣＥ５特异引物５′ＧＣＧＡＧＡＣＧＧＧＣＴＴ
ＧＡＧＧＴＴＧＣ３′和ＲＡＣＥ５巢式特异引物５′ＴＧＧＣＧＡＧＧＴＧＧＧＣＧＴＡＧＡＡＣＡ３′；ＲＡＣＥ３特异引物５′ＧＡＧ
ＣＡＧＡＣＧＣＣＣＣＴＣＴＣＣＧＣ３′和 ＲＡＣＥ３巢式特异引物 ５′ＧＴＣＧＧＡＧＡＴＣＣＴＴＴＣＡＡＣＣＣＣＡＡ３′，分别和
ＧｅｎｅＲａｃｅｒＫｉｔ提供的通用引物配对扩增基因ｃＤＮＡ５′端和３′端序列。具体操作参照Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的ＧｅｎｅＲ
ａｃｅｒＫｉｔ说明书进行。扩增的ＤＮＡ片段连接到ｐＧＥＭＴＥａｓｙ载体上进行测序，利用ＤＮＡＭＡＮ软件进行序列
拼接获得基因ｃＤＮＡ全长序列信息。根据拼接所得序列信息设计特异引物 ＡＦ：５′ＣＧＧＡＴＧＴＣＣＧＴＣＣＡＧＡＴ
ＣＡＣＡＡＣＣＡ３′，ＡＲ：５′ＣＡＡＧＧＧＡＣＧＡＡＣＧＧＡＡＣＧＧＧＣＧＡＴＧ３′，对犔犮犃犔犇犎 基因的完整ＯＲＦ（开放阅读
框）进行扩增。采用２５μＬ扩增体系：ｃＤＮＡ模板１μＬ，１０×Ｅｘｔａｑｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ
２＋）２．５μＬ，ｄＮＴＰ混合物（１０
ｍｍｏｌ／Ｌ）０．５μＬ，引物ＡＦ（２５μｍｏｌ／Ｌ）和ＡＲ（２５μｍｏｌ／Ｌ）各１μＬ，ＥｘＴａｑ酶（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ补足至
２５μＬ；反应条件为９４℃２ｍｉｎ，９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃６０ｓ，３０个循环，７２℃７ｍｉｎ，４℃保存。
１．４ 生物信息学分析
通过ＮＣＢＩ的ＯＲＦＦｉｎｄｅｒ工具分析犔犆犃犔犇犎 的开放读码框；利用ＳｉｇｎａｌＰ软件（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．
ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）进行信号肽分析；采用网上 ＴＭｐｒｅｄ程序（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＴＭ
ＰＲＥＤ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）进行蛋白质跨膜区段的预测分析；利用ＰｒｏｔＰａｒａｍ软件（ｈｔｔｐ：／／ｔｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｔ
ｐａｒａｍ．ｈｔｍｌ）预测推导蛋白的分子量及其等电点；用Ｐｓｏｒｔ软件（ｈｔｔｐ：／／ｗｏｌｆｐｓｏｒｔ．ｏｒｇ／）分析蛋白的亚细胞定
位。通过网站ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ和ｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉｂｉｎ／ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ．
ｐｌ？ｐａｇｅ＝／ＮＰＳＡ／ｎｐｓａ＿ｈｎｎ．ｈｔｍｌ来预测编码蛋白质的疏水性和二级结构；利用ＰｌａｎｔｓＰ（ｈｔｔｐ：／／ｐｌａｎｔｓｐ．ｇｅ
ｎｏｍｉｃｓ．ｐｕｒｄｕｅ．ｅｄｕ／ｈｔｍｌ／）和ＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅ软件（ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｓｉｔｅ／）进行蛋白功能结构域分析；应
用ＣｌｕｓｔａｌＸ２．０进行蛋白质多序列比较和分子进化树的绘制。
１．５ 基因表达特性分析
以羊草犃犮狋犻狀基因为内参照，采用半定量ＲＴ－ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＰＣＲ）方法检测羊草犃犔犇犎 基因
在不同胁迫条件下叶片中的表达情况。根据已克隆的ｃＤＮＡ 设计特定引物Ｐ３：５′ＡＣＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴ
ＧＡＴＴＣ３′和Ｐ４：５′ＡＧＧＧＣＧＴＧＴＴＧＴＡＧＡＧＴＧＧ３′用于犃犔犇犎 片段扩增，产物长度为２６５ｂｐ，ＰＣＲ扩增
体系同ＯＲＦ序列，扩增程序为９４℃２ｍｉｎ，９４℃３０ｓ，５８℃３０ｓ，７２℃６０ｓ，３０个循环，７２℃７ｍｉｎ，４℃保存。每
个反应进行３次重复，１％琼脂糖凝胶电泳分析。羊草 犃犮狋犻狀 基因正向引物犪犮狋Ｆ 为５′ＣＡＴＧＣＴＡＴＣ
ＣＣＴＣＧＴＣＴＣＧＡＣＣＴ３′，反向引物犪犮狋Ｒ为５′ＣＧＣＡＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＴＡＴ３′，产物长度３４０ｂｐ，ＰＣＲ
扩增体系同上，反应条件为９４℃１ｍｉｎ，９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃６０ｓ，３０个循环，７２℃７ｍｉｎ，４℃保存。每个反
应进行３次重复，１％琼脂糖凝胶电泳分析。
２ 结果与分析
２．１ 羊草乙醛脱氢酶基因犔犮犃犔犇犎 全长ｃＤＮＡ克隆
以羊草幼苗ｃＤＮＡ第１链为模板，利用简并引物Ｐ１和Ｐ２进行扩增获得了与预测结果相一致的６７５ｂｐ的保
守区ｃＤＮＡ片段。根据保守区的测序结果，又分别设计了特异性引物ＲＡＣＥ５和ＲＡＣＥ３，分别与ＧｅｎｅＲａｃｅｒＫｉｔ
中的通用引物组合，克隆获得了约６８７ｂｐ的５′端序列和约６６０ｂｐ的３′端序列。利用ＤＮＡＭＡＮ软件将５′端序
８８１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．４
列和３′端序列与中间片段拼接得到了１条长度为１７１２ｂｐ的全长ｃＤＮＡ序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＥＦ４９２０４５）。
采用ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ工具分析显示，该基因包括１个长１５０３ｂｐ的开放阅读框序列（ＯＲＦ），编码５００个氨基酸，含有
６６ｂｐ的５′ＵＴＲ 和１４４ｂｐ的３′ＵＴＲ（图１）。利用 ＡＦ和 ＡＲ 引物组合，以羊草幼苗ｃＤＮＡ 为模板，对
犔犮犃犔犇犎 基因的开放阅读框进行ＰＣＲ扩增，克隆后的测序结果与拼接序列相应片段完全一致。
在ＧｅｎＢａｎｋ中进行序列比对后发现，该序列与其他禾本科植物的乙醛脱氢酶基因在核苷酸序列上具有较高
的相似性，其中与水稻犗狊犃犔犇犎１犪（ＡＢ０３７４２１）同源性为８６％，与玉米犣犿犚犉２犆 （ＡＦ３４８４１３）同源性为８５％。
经ＢＬＡＳＴｐ分析，该序列与水稻、玉米的乙醛脱氢酶同源性分别高达８７％和８５％。
图１ 犔犮犃犔犇犎基因的核苷酸和编码的氨基酸序列
犉犻犵．１ 犖狌犮犾犲狅狋犻犱犲犪狀犱犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犔犮犃犔犇犎
加框部分为ＬｃＡＬＤＨ蛋白的活性位点和保守功能域Ｔｈｅａｄｄｉｎｇｂｏｘｐａｒｔｉｓｔｈｅａｃｔｉｖｅｓｉｔｅａｎｄ
ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎｄｏｍａｉｎｏｆｔｈｅ犔犮犃犔犇犎ｐｒｏｔｅｉｎ
９８１第２０卷第４期 草业学报２０１１年
２．２ 羊草乙醛脱氢酶基因犔犮犃犔犇犎 的生物信息学分析
经ＰｒｏｔＰａｒａｍ软件分析可知羊草犔犮犃犔犇犎 基因所编码蛋白质的分子式为Ｃ２４２６Ｈ３８０８Ｎ６３２Ｏ７１１Ｓ２６，分子量为
５４０３８．２Ｄａ，理论等电点为６．０４。负电荷残基（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）数为５８个，正电荷残基（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）数为５３个。不稳
定系数为２１．９４，属于稳定蛋白质。
对蛋白质进行功能位点分析（图１），发现在第２６６～２７３位氨基酸之间有醛脱氢酶家族绝对保守的谷氨酸活
性位点，即 ＬＥＬＧＧＫＳＰ；在第２９４～３０５位氨基酸处有同样保守的半胱氨酸残基活性位点，即 ＹＴＮＫＧＥ
ＩＣＶＡＧＴ。这２个位点的突变可引起酶活性丧失［１７］。在第２３４位的 Ｈｉｓ对于形成有活性的ＡＬＤＨ分子的正确
折叠非常重要［１８］。对与其相似的其他蛋白质氨基酸序列进行同样的功能位点分析，发现它们均有这几个功能位
点。同时还发现在该蛋白的第２４２～２４６位氨基酸处有与 ＮＡＤ＋结合的 ｍｏｔｉｆｂｏｘ：ＦＴＧＳＴ；在靠近３′端的第
４００～４０３位和４６３～４６６位各有１个高度保守的功能域，这２个位点的功能还有待于研究，推测其可能对蛋白功
能的启动起着修饰或特化作用。通过以上的分析，证明犔犮犃犔犇犎 编码的蛋白质具有醛脱氢酶的功能。
用ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅ／ＳｉｇｎａｌＰ在线分析工具对羊草ＬｃＡＬＤＨ进行信号肽预测。隐马尔科夫
模型分析结果为：ＬｃＡＬＤＨ属于非分泌型蛋白，含有信号肽的可能性为０。因此认为羊草ＬｃＡＬＤＨ没有信号肽。
Ｐｓｏｒｔ软件预测表明，ＬｃＡＬＤＨ蛋白定位于线粒体，同其他大多数物种的乙醛脱氢酶的位置是相同的。通过在线
软件ＴＭＰＲＥＤ分析得知，此蛋白质的跨膜区域为５个，其中从内到外的跨膜区域为３个，从外到内的跨膜区域
为２个，第１７０～１９０位和第４４４～４６７位的２段区域跨膜明显，所以预测此蛋白是典型的跨膜蛋白。蛋白质疏水
性分析结果表明，ＬｃＡＬＤＨ疏水性最大值为２．１２２，最小值为－２．５４４，疏水性平均值为－０．０３５，不具有明显的
亲、疏水性。二级结构分析表明，ＬｃＡＬＤＨ主要以α螺旋和不规则盘绕为蛋白最大量的结构元件，是蛋白质二级
结构的骨架。
２．３ 羊草乙醛脱氢酶的进化分析
用ＣｌｕｓｔａｌＸ２．０软件对该基因及其他植物的ＡＬＤＨ氨基酸序列进行多序列比对，绘制分子进化树的结果
（图２）表明，ＬｃＡＬＤＨ与水稻ＯｓＡＬＤＨ１ａ和玉米ＺｍＲＦ２Ｃ的亲缘关系较近，而与水稻和玉米中其他的乙醛脱氢
酶及同为禾本科植物的大麦、高粱、小麦等的乙醛脱氢酶亲缘关系相对较远一些，它们分属于不同的系统发生种
群。这说明乙醛脱氢酶这个大基因家族中的各个成员可能具有不同的功能，还有待于进一步的发掘。此外，从图
中还可以看出单子叶植物与双子叶植物的乙醛脱氢酶在进化过程中是相互交叉的，这可能表明植物的乙醛脱氢
酶基因家族起源于一个早于单、双子叶植物分化前的共同祖先。
图２ 植物犃犔犇犎蛋白的系统进化树
犉犻犵．２ 犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲狅犳犃犔犇犎狆狉狅狋犲犻狀犻狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋狆犾犪狀狋狊
水稻犗．狊犪狋犻狏犪；大豆犌．犿犪狓；小麦犜．犪犲狊狋犻狏狌犿；拟南芥犃．狋犺犪犾犻犪狀犪；玉米犣．犿犪狔狊；羊草犔．犮犺犻狀犲狀狊犻狊；
烟草犖．狋犪犫犪犮狌犿；大麦犎．狏狌犾犵犪狉犲ｓｕｂｓｐ．狏狌犾犵犪狉犲；高粱犛．犫犻犮狅犾狅狉
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２．４ 羊草幼苗叶片中乙醛脱氢酶基因犔犮犃犔犇犎 在不同胁迫下的表达
利用半定量ＲＴ－ＰＣＲ分析方法，以羊草犃犮狋犻狀为内参照，分析了羊草幼苗中乙醛脱氢酶基因犔犮犃犔犇犎 在
不同胁迫下叶片中的表达变化。结果表明（图３），幼苗在４℃低温、高盐（５００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ）和模拟干旱（２０％
ＰＥＧ６０００）处理４ｈ后，犔犮犃犔犇犎 的表达量均明显增加，其中高盐和模拟干旱条件下犔犮犃犔犇犎 高表达持续的时
间明显高于４℃低温，随后又都逐渐恢复到原来的表达水平；而幼苗受１００μｍｏｌ／ＬＡＢＡ处理后，犔犮犃犔犇犎 的表
达量呈现“高－低－高－低”的趋势，这可能是受到羊草内源和外源ＡＢＡ共同诱导而产生的。从以上的结果可
以看出犔犮犃犔犇犎 的表达受到低温、干旱、高盐和ＡＢＡ的正调控作用。
图３ 羊草乙醛脱氢酶基因犔犮犃犔犇犎在不同胁迫下的表达分析
犉犻犵．３ 犃狀犪犾狔狊犻狊狅犳犔犮犃犔犇犎犵犲狀犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犻狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊狋狉犲狊狊
３ 讨论
醛脱氢酶基因家族起源于共同的以多种醛化合物为底物的古老基因，在随后的进化中分化为不同底物专一
性或在不同细胞组分中表达的众多家族成员。乙醛脱氢酶（ＡＬＤＨ）是生物体内一类依赖ＮＡＤ（Ｐ）的酶，它们能
够催化脂肪性的和芳香性的醛转变成酸。近年来，有关乙醛脱氢酶的研究逐渐增多，尤其是酵母、动物以及人类
等物种的乙醛脱氢酶已经得到了较为广泛的研究，但对于植物的乙醛脱氢酶研究却比较少。ＯｐＤｅｎＣａｍｐ和
Ｋｕｈｌｅｍｅｉｅｒ［１８］在烟草中克隆的犃犔犇犎 基因在花粉、花柱等生殖器官中表达量较高，他们认为该基因在烟草花粉
发育的生物合成和能量产生中发挥作用。Ｃｕｉ等［１９］在玉米中克隆的编码乙醛脱氢酶的基因犚犉２，是玉米Ｔｃｍｓ
雄性不育的恢复基因。本实验所克隆的羊草乙醛脱氢酶基因属于典型的醛脱氢酶基因家族，它具有乙醛脱氢酶
特异的保守结构域及保守的氨基酸残基，经ＮＣＢＩＢｌａｓｔｐ同源比较发现该蛋白的氨基酸序列与Ｌｉ等［２０］从水稻中
克隆的犗狊犃犔犇犎１犪基因的同源性最高，其次与Ｓｋｉｂｂｅ等［７］从玉米中克隆的犚犉２犆基因的同源性较高，但水稻
犗狊犃犔犇犎１犪和玉米犚犉２犆的具体生理功能目前还不十分清楚。
事实上，现有的从植物中克隆到的乙醛脱氢酶基因中，只有Ｎａｋａｚｏｎｏ等［１３］在水稻中克隆的犗狊犃犔犇犎２犪基
因和Ｓｕｎｋａｒ等［１４］在拟南芥中克隆的犃狋犺犃犔犇犎３基因的功能研究的较为透彻，尤其是犗狊犃犔犇犎２犪基因。水稻
犗狊犃犔犇犎２犪基因是线粒体编码的，在水淹等胁迫下其表达量明显升高。本实验克隆的犔犮犃犔犇犎 基因与
犗狊犃犔犇犎１犪基因的同源性很高，而与犗狊犃犔犇犎２犪基因同源性较差，但它们都属于乙醛脱氢酶基因家族。基于
Ｎａｋａｚｏｎｏ等［１３］对犗狊犃犔犇犎２犪基因和Ｓｕｎｋａｒ等［１４］对犃狋犺犃犔犇犎３基因的研究策略，本实验选择了４种不同的
胁迫条件来处理羊草，用以研究犃犔犇犎 基因的表达情况。从研究结果可看出，犔犮犃犔犇犎 基因在不同的逆境诱导
下均有超量表达，但与犗狊犃犔犇犎２犪基因在诱导条件下的表达方式不同，犗狊犃犔犇犎２犪基因的表达量是随着诱导
时间的增加而逐渐增加，诱导３６ｈ的表达量要高于诱导１２ｈ的表达。而犔犮犃犔犇犎 基因是在受到胁迫的初期随
着时间的增加而表达量不断升高，但一段时间后其表达量又会显著降低，维持在一个中等的表达水平。可见，这
２个基因的表达模式是不同的。但最终可以得出一个结论：犔犮犃犔犇犎 基因受干旱、高盐、低温及ＡＢＡ等逆境胁
１９１第２０卷第４期 草业学报２０１１年
迫的诱导，并在这些诱导条件下其表达量显著升高。这些环境胁迫的共同特点是它们都能够导致氧化胁迫的发
生，这也表明乙醛脱氢酶基因在抵御氧化胁迫的作用中扮演着一个重要的角色。
参考文献：
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（ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＨａｒｂｉｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ１５００２５，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｉｎｔｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈ，ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．ＥＦ４９２０４５）ｏｆａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｇｅｎｅ犔犮犃犔犇犎ｗａｓｉｓｏ
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ｔａｉｎｉｎｇａｎｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｏｆ１５０３ｂｐｅｎｃｏｄｉｎｇ５００ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ，ｗｉｔｈａ５′ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎｏｆ６６ｂｐａｎｄ
ａ３′ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎｏｆ１４４ｂｐ．Ｔｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｃｏｎｔａｉｎｓａｂｓｏｌｕｔｅｌｙｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄａｎｄ
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３９１第２０卷第４期 草业学报２０１１年