全 文 ：书无芒隐子草犛犃犕犛１基因的克隆及
干旱胁迫下的表达分析
孔令芳，张吉宇，刘志鹏，王彦荣
（兰州大学草地农业科技学院 草地农业生态系统国家重点实验室 农业部草地农业生态系统学重点开放实验室，甘肃 兰州７３００２０）
摘要：以无芒隐子草干旱诱导的ｃＤＮＡ文库中获得的一个与Ｓ腺苷甲硫氨酸合成酶（犛犃犕犛）基因同源性较高的
ＥＳＴ序列为基础，采用ＲＴ－ＰＣＲ技术克隆该基因全长序列（命名为犆狊犛犃犕犛１），该序列全长１３９９ｂｐ，编码３９７个
氨基酸，具有犛犃犕犛基因的典型结构特征。无芒隐子草ＳＡＭＳ１蛋白为亲水性蛋白，无跨膜结构域，其空间结构主
要由α螺旋和无规则卷曲结构构成。与近缘植物犛犃犕犛的氨基酸序列多重比较分析表明，不同植物的犛犃犕犛的
氨基酸相似程度非常高（９２％～１００％），其中无芒隐子草与水稻的相似性最高（９９％），说明犛犃犕犛基因在植物进
化中非常保守。犆狊犛犃犕犛１基因在无芒隐子草幼苗干旱过程中的半定量和实时定量ＲＴ－ＰＣＲ表达模式分析均表
明，干旱胁迫诱导该基因在根中大量表达，叶中表达量变化不明显。犆狊犛犃犕犛１基因受干旱胁迫的诱导表达，为进
一步探讨其应用于草类作物抗旱性的遗传改良奠定了基础。
关键词：无芒隐子草；犛犃犕犛；基因克隆；定量分析；生物信息学
中图分类号：Ｓ８１２；Ｓ５４３．０３；Ｑ９４３．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１３）０１０２６８０８
干旱、高盐和低温是限制植物生长和农作物产量的主要逆境因子，克服干旱、高盐和低温对农业生产的制约，
培育具有良好抗逆特性的作物品种，一直是各国科学家关注的焦点［１］。近年来，随着分子遗传育种的发展，利用
抗逆基因对作物进行基因工程改良已成为作物育种的重要途径并且成效显著［２］，而找到能够直接利用的抗性基
因是对作物进行基因工程改良的关键。
Ｓ腺苷甲硫氨酸合成酶（Ｓａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ＳＡＭＳ，ＥＣ２．５．１．６）是植物代谢中的１个关键
酶，它催化Ｌ甲硫氨酸与ＡＴＰ生物合成Ｓ腺苷甲硫氨酸（ＳＡＭ）。在生物学上，ＳＡＭ 是生物合成乙烯［３］以及多
胺［４］的前体，参与了植物的转甲基、转氨丙基和转硫反应等多种重要的生理过程［５］，ＳＡＭ 还可以与ＲＮＡ结合参
与基因表达调控［６］。犛犃犕犛基因与植物对干旱、盐碱和低温的抗性密切相关，并协助植物耐受多种非生物胁迫。
岳昌武等［７］研究表明甘薯（犐狆狅犿狅犲犪犫犪狋犪狋犪狊）犛犃犕犛 基因受低温胁迫诱导表达；林凡云等［８］发现糜子（犘犪狀犻犮狌犿
犿犻犾犻犪犮犲狌犿）犛犃犕犛 基因的表达涉及糜子响应干旱胁迫及干旱后复水过程，可能是糜子抗旱节水的关键基因；王
士强［９］应用ＢＳＭＶＶＩＧＳ技术对小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）的犛犃犕犛基因进行沉默导致沉默植株更易受干旱胁
迫的影响，初步确定了Ｓ腺苷甲硫氨酸合成酶基因和抗旱性的关系。化烨［１０］利用耐盐基因犌狊犛犃犕犛，构建了由
诱导性启动子ｒｄ２９Ａ和强组成型启动子Ｅ１２分别调控的犌狊犛犃犕犛基因的植物表达载体，培育出耐盐碱转基因
苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）新株系。截至目前，关于犛犃犕犛基因的研究多集中在玉米（犣犲犪犿犪狔狊）、小麦等农作物
中，很少涉及到草类植物。
无芒隐子草（犆犾犲犻狊狋狅犵犲狀犲狊狊狅狀犵狅狉犻犮犪）是禾本科多年生旱生草本植物，是荒漠草原和荒漠的建群种和优势
种［１１，１２］，饲用价值高，抗热性、抗旱性和耐寒性强，具有作为优良的草坪草和生态草引种驯化的价值［１２，１３］，对促进
畜牧业发展和维持脆弱生态系统具有重要作用［１４，１５］。近年来，对无芒隐子草种子萌发、出苗和幼苗生长对土壤
水分的响应及无芒隐子草不同节间部位的种子休眠对高温处理的响应等方面的研究较多［１６，１７］，而关于无芒隐子
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２０１３年２月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第２２卷 第１期
Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．１
收稿日期：２０１１０５１６；改回日期：２０１１０７０８
基金项目：国家“９７３”（２００７ＣＢ１０８９０４），科技部国际科技合作重点项目（２００４ＤＦＡ０２０００），国家科技支撑计划项目（２００８ＢＡＤＢ３Ｂ０３），甘肃省基
金（１０１０ＲＪＺＡ１０５）和国家自然科学基金（３１０７２０７２，３０８００５９３和３１１０１７５９）资助。
作者简介：孔令芳（１９８７），女，甘肃兰州人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｋｌｆ１９８７０６＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｊｙ＠ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
草中的犛犃犕犛基因尚未见报道。为了揭示无芒隐子草抗旱的分子基础，本研究采用ＳＭＡＲＴ技术构建了无芒隐
子草在干旱胁迫下的ｃＤＮＡ文库，以干旱诱导胁迫的ｃＤＮＡ文库中获得的犛犃犕犛１基因的ＥＳＴ序列为基础，克
隆其全长序列ｃＤＮＡ，并对其结构特点及其在干旱诱导过程中的表达模式等进行了初步分析，为进一步探讨犆狊
犛犃犕犛１基因的利用奠定基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料及处理
１．１．１ 材料与主要试剂 野生无芒隐子草种质于２００４年采自内蒙古阿拉善地区。采集后保存在农业部牧草与
草坪草种子质量监督检验测试中心（兰州）低温种子库，２０１０年在兰州大学草地农业科技学院盆栽试验。
实验所用的总ＲＮＡ分离试剂盒为ＲＮｅａｓｙＰｌａｎｔＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）、ＲＮａｓｅｆｒｅｅＤＮＡｓｅＳｅｔ（Ｑｉａｇｅｎ），ｃＤ
ＮＡ合成试剂盒为 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴＰＣＲ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）、ｐＧＥＭＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒＳｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＤＮＡ
Ｍａｒｋｅｒ，ＤＮＡ凝胶回收试剂盒，ＤＨ５α感受态细胞。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，其他试剂
采用国产或进口分析纯。
１．１．２ 干旱胁迫处理 无芒隐子草幼苗移栽２周后，选取生长旺盛、大小一致的植株用于干旱胁迫处理，将塑料
杯充分浇水后停止浇水进行自然干旱处理，干旱处理的时间从第１天到第１０天植物出现严重缺水而萎蔫，第１１
天恢复浇水１次，第１４天试验结束。在此试验期间，选取第０，４，６，８，１０，１１，１４天，分别测定土壤含水量和叶片
相对含水量，每处理１０次重复；同时分别收集不同处理点单株的根、茎和叶样品，液氮速冻后保存到－８０℃冰箱，
用于后续研究。
１．２ 方法
１．２．１ 总ＲＮＡ的提取及ｃＤＮＡ的合成 采用ＲＮｅａｓｙＰｌａｎｔＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）试剂盒提取无芒隐子草叶和根
中的总ＲＮＡ，用紫外分光光度计Ｎａｎｏｄｒｏｐ进行ＲＮＡ纯度测定，并通过琼脂糖凝胶电泳检验ＲＮＡ完整性。参
照ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ－ＰＣＲＫｉｔ（ＴａＫａＲａ）使用说明，取２μＬ无芒隐子草的总ＲＮＡ，以 ＯｌｉｇｏｄＴ为引物，进行
ｃＤＮＡ第一条链的合成。
１．２．２ 无芒隐子草犛犃犕犛１基因的全长ｃＤＮＡ克隆 根据获得的无芒隐子草ＥＳＴ核心序列在 ＮＣＢＩ上Ｂｌａｓｔ，
取相似性最高的全长序列，用ＤＮＡＭＡＮ５．２．２设计引物，上游引物为Ｐ１，下游引物为Ｐ２，以从无芒隐子草扩增
该基因的全长片段，预测片段长度为１３９９ｂｐ。
用琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒回收目标片段，并与ｐＧＥＭ－ＴＥａｓｙ载体连接，转化感受态大肠杆菌ＤＨ５ａ，
用蓝白斑筛选结合Ｓｐ６和Ｔ７引物菌落ＰＣＲ筛选阳性克隆。用Ｓｐ６和Ｔ７引物进行双向测序（上海生工技术有
限公司）。
１．２．３ 半定量ＲＴ－ＰＣＲ分析 利用ＤＮＡＭＡＮ５．２．２设计犆狊犛犃犕犛１基因半定量ＲＴ－ＰＣＲ分析引物，正向
引物为Ｐ３，反向引物为Ｐ４，产物大小为４５０ｂｐ。以无芒隐子草犌犃犘犇犎 基因作为内参基因（正向引物为Ｐ５，反
向引物为Ｐ６），产物大小为４４８ｂｐ。ＰＣＲ反应体系为３０μＬ，其中含３μＬ１０ｘＤｙｎａｚｙｍｅｂｕｆｆｅｒ，１．５μＬｄＮＴＰ，
上下游引物各１．５μＬ，１μＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＤｙｎａｚｙｍｅ，１μＬＦｉｒｓｔｓｔｒａｎｄｃＤＮＡ，２０．５μＬＤｅｉｏｎｉｚｅｄＨ２Ｏ。
ＰＣＲ循环为：９４℃预变性１ｍｉｎ，然后３５个循环，每个循环９４℃变性１５ｓ，６０℃退火３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，最后
７２℃延伸１ｍｉｎ，４℃保存。取５μＬ扩增产物用１％琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定后送上海生工生物工程有限公司
进行测序。
１．２．４ ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ 利用ＤＮＡＭＡＮ５．２．２设计实时定量ＲＴ－ＰＣＲ分析引物，正向引物为Ｐ７，反向引物为
Ｐ８，产物大小为１４８ｂｐ。以无芒隐子草犌犃犘犇犎 基因作为内参基因（正向引物为Ｐ９，反向引物为Ｐ１０），产物大
小为１５０ｂｐ。相对定量采用２－△△ＣＴ方法，△△ＣＴ＝（ＣＴ目的基因－ＣＴ内参基因）实验组－（ＣＴ目的基因－ＣＴ内参基因）对照，
２－△△ＣＴ表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数，定量过程中设置３Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｐｌｉｃａｎｔｓ×２
Ｔｅｃｈｎｉｃａｌｒｅｐｌｉｃａｎｔｓ，共６次重复［１８］。
ＰＣＲ反应体系为１０μＬ，其中含５μＬ２ｘＳＹＢＲｍｉｘ，上下游引物各０．４μＬ，３．２μＬ灭菌水，１μＬＴｅｍｐｌａｔｅ。
反应程序采用两步法：９５℃酶激活１０ｍｉｎ，然后４０个循环，每个循环９５℃变性３０ｓ，６０℃退火３０ｓ，结束。
９６２第２２卷第１期 草业学报２０１３年
表１ 实验所用的引物序列
犜犪犫犾犲１ 犘狉犻犿犲狉狊犲狇狌犲狀犮犲狊狑犪狊狌狊犲犱
上游引物
Ｕｐｓｔｒｅａｍｐｒｉｍｅｒ
引物序列（从５′－３′端）
Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ
下游引物
Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍｐｒｉｍｅｒ
引物序列（从５′－３′端）
Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ
熔解温度
Ｔｈｅｒｍｏ（℃）
产物大小
Ｐｒｏｄｕｃｔｓｉｚｅ（ｂｐ）
Ｐ１ ＧＧＣＣＣＡＣＣＧＧＡＴＣＧＧＡＴ Ｐ２ ＣＣＧＴＴＡＡＡＡＧＴＡＣＴＴＡＴＴＡＡＧ ５５ １３９９
Ｐ３ ＣＡＣＣＧＧＡＴＣＧＧＡＴＣＧＧＣＣ Ｐ４ ＣＧＧＧＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣ ６０ ４５０
Ｐ５ ＣＴＣＴＧＣＣＣＣＴＡＧＣＡＡＡＧＡＴＧ Ｐ６ ＧＡＧＣＴＴＧＣＣＣＴＣＡＡＡＡＡＣＡＧ ５８ ４４８
Ｐ７ ＴＡＣＣＣＡＧＣＡＴＧＡＣＧＡＧＡＣＴＧ Ｐ８ ＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＡＴＧＡＣＡＡＡＧＣ ６０ １４８
Ｐ９ ＧＴＣＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＴＧＧＡＧＡＧ Ｐ１０ ＡＣＡＣＡＴＣＧＡＣＴＧＴＴＧＧＧＡＣＡ ６０ １５０
１．２．５ 序列的生物信息学分析 通过ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．Ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）网站进行Ｂｌａｓｔ检索，
利用ＤＮＡＭＡＮ６．０和Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ４．９Ｄｅｍｏ生物技术软件进行序列翻译、多重比对以及同源树等分析，采用
ＮＣＢＩ的ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ预测开放阅读框，ＮＣＢＩ的Ｂｌａｓｔｐ进行蛋白序列保守结构域分析。利用 ＴＭＨＭＭ２．０
Ｓｅｒｖｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ）和ＴＭｐｒｅｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＴＭ
ＰＲＥＤ）２个软件同时对该蛋白序列的跨膜区域进行分析，利用 ＰｒｏｔＳｃａｌｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／
ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｈｔｍｌ）网站进行该氨基酸序列的疏水性／亲水性预测。利用 ＮＰＳＡ（ｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／）中的
ＭＬＲＣ程序在线分析蛋白质二级结构中α螺旋、无规则卷曲和延伸链等结构的预测。
２ 结果与分析
２．１ 犛犃犕犛１基因的全长ｃＤＮＡ扩增
图１ 犘犆犚扩增产物电泳
犉犻犵．１ 犌犲１犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狅犳犘犆犚狉犲狊狌犾狋
Ｍ：１ｋｂＰｌｕｓＤＮＡＬａｄｄｅｒ；１：ＰＣＲ产物ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔ．
图２ 犆狊犛犃犕犛１在未干旱及干旱胁迫下的犚犜－犘犆犚结果
犉犻犵．２ 犜犺犲犚犜－犘犆犚狉犲狊狌犾狋狊狅犳犆狊犛犃犕犛１狌狀犱犲狉
狀狅狀犱狉狅狌犵犺狋犪狀犱犱狉狅狌犵犺狋狊狋狉犲狊狊
以无芒隐子草该基因全长片段设计的上游引物
Ｐ１，下游引物Ｐ２，经ＰＣＲ扩增，产物由琼脂糖凝胶电
泳分离后呈现一条长约１３９９ｂｐ的特异性条带，与预
期的片段大小一致（图１），暂命名为犆狊犛犃犕犛１（Ｇｅｎ
ｂａｎｋ登陆号ＦＪ９７２８２１）。
２．２ 无芒隐子草犛犃犕犛１基因的表达模式分析
利用半定量和实时定量ＲＴ－ＰＣＲ对犆狊犛犃犕犛１
基因在干旱胁迫处理条件下的响应机构进行分析，分
析所用的总ＲＮＡ来自干旱胁迫８ｄ后和未经胁迫处
理的叶片和根系材料。半定量ＲＴ－ＰＣＲ结果表明，
干旱时犆狊犛犃犕犛１基因在叶中的表达量与未干旱对照
基本一致而根中的表达量显著增加（图２）。
实时荧光定量ＰＣＲ的分析结果表明，干旱时犆狊
犛犃犕犛１基因在叶中的表达量没有增加，在根中的表达
量明显上升，为未干旱对照的２倍，与半定量 ＲＴ－
ＰＣＲ的分析结果相符，说明犆狊犛犃犕犛１基因的大量表
达受干旱的诱导（图３）。
２．３ 犆狊犛犃犕犛１基因ｃＤＮＡ序列的生物信息学分析
ＯＲＦＦｉｎｄｅｒ程序在犆狊犛犃犕犛１ｃＤＮＡ序列的第
６８～１２５８ｎｔ处发现有一连续 ＯＲＦ，第６８～７０ｎｔ处
是该ｃＤＮＡ序列的第一个ＡＴＧ密码子，其下游的＋４
位是Ｇ，上游－３位是Ａ，符合典型的ｋｏｚａｋ规则［１９］，
结合推导的氨基酸序列Ｎ端同源性比较结果，可以认
０７２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．１
定第一个ＡＴＧ是该基因的起始密码子（图４）。因此
图３ 犆狊犛犃犕犛１在未干旱及干旱胁迫下的狇犚犜－犘犆犚结果
犉犻犵．３ 犜犺犲狇犚犜－犘犆犚狉犲狊狌犾狋狊狅犳犆狊犛犃犕犛１狌狀犱犲狉
狀狅狀犱狉狅狌犵犺狋犪狀犱犱狉狅狌犵犺狋狊狋狉犲狊狊
ＬＣ：对照组叶Ｌｅａｆｏｆｃｏｎｔｒｏｌｔｒｅａｔｍｅｎｔ；ＲＣ：对照组根
Ｒｏｏｔｏｆｃｏｎｔｒｏｌｔｒｅａｔｍｅｎｔ；ＬＳ：处理组叶Ｌｅａｆｏｆｓｔｒｅｓｓ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔ；ＲＳ：处理组根Ｒｏｏｔｏｆｓｔｒｅｓｓｔｒｅａｔｍｅｎｔ．
克隆得到的ｃＤＮＡ序列含有完整的ＯＲＦ，编码蛋白长
３９７ＡＡ。
疏水性分析结果表明（图５），犆狊犛犃犕犛１多肽链具
有最低的分值－２．０５６，亲水性最强；最高的分值
１．７３３，疏水性最强。整个多肽链表现为亲水性，没有
明显的疏水区域，对犆狊犛犃犕犛１基因进行跨膜域预测，
没有跨膜结构域，结果与疏水性分析相符合。将犆狊
犛犃犕犛１基因氨基酸序列利用ＳＯＰＭＡ软件进行二级
结构分析，可以看出该基因含有比较丰富的二级结构，
以ａ螺旋和无规卷曲为主，其中无规卷曲（ｃｃ）由１６４
个氨基酸残基组成，占４１．４１％；ａ螺旋（Ｈｈ）由１３９
个氨基酸残基组成，占３５．１０％；连接条带由５９个氨
基酸残基组成，占１４．５９％；β转角由３４个氨基酸残基
组成，占８．５９％（图６）。利用Ｐｆａｍ数据库分析犆狊犛犃犕犛１基因的保守域，共含有３个保守域，Ｎ端从５到１０４个
氨基酸残基，Ｃ端从２４３到３８５个氨基酸残基，中间是从１１９到２４１个氨基酸残基。这个肽段包括甲硫氨酸结合
域ＧＨＰＤＫ；ＡＴＰ结合域ＧＡＧＤＱＧ；一个九肽的以ｐ环形式存在的磷酸盐结合区ＧＧＧＡＦＳＧＫＤ；同时含有一个
控制别越基因催化效率的活性中心ＰＤＩＡＱＧＶＨＧＨＦＴＫＲＰＥＥＩ（图７）。
图４ 犆狊犛犃犕犛１的犮犇犖犃全长序列及推导的氨基酸序列
犉犻犵．４ 犜犺犲犮犇犖犃犳狌犾犾犲狀犵狋犺狅犳犆狊犛犃犕犛１犪狀犱犻狋狊犱犲犱狌犮犲犱犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲
阴影ＡＴＧ和ＴＡＡ分别表示起始密码子和终止密码子。ＴｈｅＡＴＧｉｎｉｔｉａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅＴＡＡｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｃｏｄｏｎｉｓｉｎｔｈｅｓｈａｄｏｗ．
１７２第２２卷第１期 草业学报２０１３年
２．４ 不同植物犛犃犕犛基因的多重比较
图５ 犆狊犛犃犕犛１的疏水性分析
犉犻犵．５ 犎狔犱狉狅狆犺狅犫犻犮犻狋狔狆狉犲犱犻犮狋犻狅狀狉犲狊狌犾狋狅犳犆狊犛犃犕犛１
小麦、大麦（犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲）、玉米、粳稻（犗狉狔
狕犪狊犪狋犻狏犪ｊａｐｏｎｉｃａ）、籼稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪ｉｎｄｉｃａ）、石斛
兰（犇犲狀犱狉狅犫犻狌犿犮狉狌犿犲狀犪狋狌犿）、普通蓖麻 （犚犻犮犻狀狌狊
犮狅犿犿狌狀犻狊）、胡!子（犈犾犪犲犪犵狀狌狊狌犿犫犲犾犾犪狋犲）、甘氨酸大
豆（犌犾狔犮犻狀犲狊狅犼犪）、毛果杨（犘狅狆狌犾狌狊狋狉犻犮犺狅犮犪狉狆犪）、拟
南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）、长春花（犆犪狋犺犪狉犪狀狋犺狌狊
狉狅狊犲狌狊）、蒺藜苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪）、大洋洲滨
藜（犃狋狉犻狆犾犲狓狀狌犿犿狌犾犪狉犻犪）、无芒隐子草（犆犾犲犻狊狋狅犵犲狀犲狊
狊狅狀犵狅狉犻犮犪）、红薯（犐狆狅犿狅犲犪犫犪狋犪狋犪狊）及番木瓜（犆犪狉犻犮犪
狆犪狆犪狔犪）１７种植物的犛犃犕犛基因的氨基酸序列的系
统进化树分析显示，不同组的基因被分到不同的分支，
在进化上犆狊犛犃犕犛１与禾本科稻属的犛犃犕犛亲缘关
系最近，与大麦属和小麦属的亲缘关系次之，与兰科石
斛兰属的亲缘关系较远（图８）。
从１７种植物中挑选与犆狊犛犃犕犛１基因氨基酸序列相似度较高的５种植物的犛犃犕犛基因氨基酸序列进行多
重比较，结果表明无芒隐子草中犛犃犕犛１基因的氨基酸序列与粳稻（籼稻）、大麦、小麦和玉米的犛犃犕犛基因的氨
基酸序列相似度分别高达９８．８７％（９８．６２％），９８．４１％，９８．０７％，９７．５６％（图９），说明该基因在植物进化中非常
保守。
图６ 犆狊犛犃犕犛１基因的二级结构
犉犻犵．６ 犜犺犲狊犲犮狅狀犱犪狉狔狊狋狉狌犮狋狌狉犲狅犳犆狊犛犃犕犛１犵犲狀犲
图７ 犆狊犛犃犕犛１基因的保守区分析
犉犻犵．７ 犆狅狀狊犲狉狏犲犱犱狅犿犪犻狀狊狅犳犆狊犛犃犕犛１
３ 讨论
由犛犃犕犛所催化反应的产物Ｓ腺苷甲硫氨酸（ＳＡＭ）是生物合成乙烯前体［２０］，而外源乙烯被证明可以诱导
植物产生内源乙烯，因此乙烯利的处理可以诱导犛犃犕犛 基因的大量表达。而ＳＡＭ 又是生物合成多胺的前
体［２１］，近年来的研究表明乙烯和多胺都参与了植物抗逆反应［２２］，所以犛犃犕犛 在植物抗逆生理方面发挥一定作
用，大量研究发现犛犃犕犛基因受多种非生物胁迫诱导。
本研究对犛犃犕犛基因进行分析发现该基因全长为１３９９ｂｐ，编码３９７个氨基酸，含有典型的Ｎ端结构域，中
间结构域和Ｃ端结构域。疏水性结果表明没有明显的疏水区域，没有跨膜结构域，整个多肽链表现为亲水性。
易乐飞等［２３］对条斑紫菜（犘狅狉狆犺狔狉犪狔犲狕狅犲狀狊犻狊）的犛犃犕犛基因进行疏水性分析结果表明，其亲水性区域均匀分布
在整个肽链中，犘狔犛犃犕犛在一级结构上以亲水性为主。犘狔犛犃犕犛基因没有跨膜结构域，结果与疏水性分析相符
合。贾丽娜等［２４］用ＰｒｏｔＳｃａｌｅ对玉米犛犃犕犛氨基酸序列的疏水性／亲水性进行预测，结果表明整个多肽链表现
为亲水性，没有明显的疏水区域，犛犃犕犛基因没有跨膜结构域，结果与疏水性分析相符合。
２７２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．１
图８ １７种植物犛犃犕犛氨基酸序列的进化树
犉犻犵．８ 犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲犫犪狊犲犱狅狀犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犛犃犕犛犳狉狅犿狊犲狏犲狀狋犲犲狀狆犾犪狀狋狊
图９ ６种植物的犛犃犕犛氨基酸序列的多重比较
犉犻犵．９ 犕狌犾狋犻狆犾犲犪犾犻犵狀犿犲狀狋狅犳犛犃犕犛犳狉狅犿狊犻狓狆犾犪狀狋狊
３７２第２２卷第１期 草业学报２０１３年
用ｎｅｉｇｈｂｏｕｒｊｏｉｎｉｎｇ（ＮＪ）法对无芒隐子草及有亲缘关系的１７种植物，构建系统发生进化树（图８），结果表
明在进化上犆狊犛犃犕犛１与禾本科稻属的犛犃犕犛亲缘关系最近，与大麦属和小麦属的亲缘关系次之，与兰科石斛
兰属的亲缘关系较远。将上述生物中与无芒隐子草亲缘关系最近的５种植物的犛犃犕犛基因和犆狊犛犃犕犛１进行
多重序列比对，对比结果显示多种生物的犛犃犕犛基因高度相似，说明犛犃犕犛基因在其进化过程中非常保守。易
乐飞等［２４］将条斑紫菜的犛犃犕犛基因与其他４种植物的犛犃犕犛基因进行比对发现，犘狔犛犃犕犛与绿藻门莱茵衣藻
的犛犃犕犛亲缘关系最近，与高等植物的亲缘关系次之，与细菌的亲缘关系最远，进化树反映出的亲缘关系与传统
分类相符。
用半定量和实时定量ＲＴ－ＰＣＲ的方法对犆狊犛犃犕犛１基因在干旱胁迫下的表达分析结果均表明，该基因在
干旱胁迫时根中表达量显著增加，为对照的２倍，而叶中的表达量在干旱胁迫前后无明显变化。犆狊犛犃犕犛１基因
在干旱胁迫第８天时表达量明显增加，说明该基因主要参与无芒隐子草对干旱胁迫的响应过程。余涛等［２５］在烟
草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）中克隆了一个犛犃犕犛基因，发现其表达受氧化胁迫、盐胁迫及高温胁迫的诱导。Ｍａ
等［２６］发现盐地碱蓬（犛狌犪犲犱犪犵犾犪狌犮犪）的犛犃犕犛基因受ＮａＣｌ胁迫的正调控，酶活性检测表明ＮａＣｌ胁迫条件下该
酶的活性增强。番茄（犔狔犮狅狆犲狉狊犻犮狅狀犲狊犮狌犾犲狀狋狌犿）中犛犃犕犾和犛犃犕３特异地受盐、甘露醇和ＡＢＡ的诱导表达［２７］。
Ｇｕｐｔａ等［２８］证实白杨犛犃犕犛基因受高浓度ＣＯ２ 和Ｏ２ 胁迫的诱导。拟南芥、水稻中犛犃犕犛基因的表达在水分
胁迫时表达量增加亦有报道［２９］。小麦中的犛犃犕犛基因的表达受干旱和复水的诱导［３０］。有研究证明玉米犛犃犕犛
基因参与逆境胁迫响应，在玉米逆境应答中起作用［３１］。
本研究从无芒隐子草中克隆得到了犛犃犕犛１基因的全长ｃＤＮＡ序列，具有犛犃犕犛基因的典型结构特征。通
过与近缘植物犛犃犕犛 的氨基酸序列多重比较发现，不同植物的犛犃犕犛 的氨基酸相似程度非常高（９２％～
１００％），说明犛犃犕犛基因在植物进化中非常保守。犆狊犛犃犕犛１基因在无芒隐子草幼苗干旱胁迫诱导时，在根中大
量表达，叶中表达量变化不明显，表明犆狊犛犃犕犛１基因可能是无芒隐子草抗旱性相关的基因。这为研究犛犃犕犛１
基因在无芒隐子草中的表达分析、功能验证、蛋白的分子结构及其结构与功能的关系等奠定了基础，有助于阐明
无芒隐子草犛犃犕犛１基因在逆境应答中的调控机制和功能，获得的基因资源对抗旱草类作物的遗传改良具有重
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犆犾狅狀犻狀犵狅犳犪犛犪犱犲狀狅狊狔犾犿犲狋犺犻狅狀犻狀犲狊狔狀狋犺犲狋犪狊犲犵犲狀犲犳狉狅犿犆犾犲犻狊狋狅犵犲狀犲狊狊狅狀犵狅狉犻犮犪犪狀犱
犻狋狊犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狌狀犱犲狉犱狉狅狌犵犺狋狊狋狉犲狊狊
ＫＯＮＧＬｉｎｇｆａｎｇ，ＺＨＡＮＧＪｉｙｕ，ＬＩＵＺｈｉｐｅｎｇ，ＷＡＮＧＹａｎｒｏｎｇ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＰａｓｔｏｒａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＬａｎｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；Ｓｔａｔｅ
ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄＡｇｒｏｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ；ＴｈｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄ
ＡｇｒｏＥｃｏｓｙｓｔｅｍｓｏｆＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００２０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｍｏｒｅｇｅｎｅｓｆｏｒｔｈｅｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｄｒｏｕｇｈｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｐｌａｎｔｓ，犆犾犲犻狊狋狅犵犲狀犲狊狊狅狀犵狅狉犻犮犪
ｗａｓｕｓｅｄｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｕｎｄｅｒｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓ．ＡｆｕｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｏｆｔｈｅＳａｄｅｎｏｓｙｌ
ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（犛犃犕犛）ｇｅｎｅｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍ犆．狊狅狀犵狅狉犻犮犪．Ｉｔｗａｓｎａｍｅｄ犆狊犛犃犕犛１ａｎｄｗａｓ１３９９
ｂｐｉｎｌｅｎｇｔｈａｎｄｅｎｃｏｄｅｄ３９７ａｍｉｎｏａｃｉｄｓｗｉｔｈｔｈｅｔｈｒｅｅｔｙｐｉｃａｌｄｏｍａｉｎｓｏｆ犛犃犕犛．ＴｈｅＣｓＳＡＭＳ１ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓ
ａｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈｎｏｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎｂｕｔｗｉｔｈａｎαｈｅｌｉｘｓｐａｔｉａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｎｇａｒａｎｄｏｍ
ｃｏｉｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅａｌｉｇｎｍｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓｂａｓｅｄｏｎａｍｉｎｏａｃｉｄｓｏｆ犛犃犕犛ｇｅｎｅｓｆｒｏｍｋｉｎｄｒｅｄｐｌａｎｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔ
犛犃犕犛ｗａｓｖｅｒｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄｂｅｔｗｅｅｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｐｅｃｉｅｓｗｉｔｈ９２％－９９％ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｉｎａｍｉｎｏａｃｉｄｌｅｖｅｌ．犆狊犛犃犕犛１
ｈａｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｗｉｔｈｔｈａｔｏｆ犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪 （９９％）．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓｏｆ犆狊犛犃犕犛１ｕｎｄｅｒ
ｄｒｏｕｇｈｔｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｂｙｓｅｍｉｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎｄｒｅａｌｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲＴ－ＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓ
ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓｉｎｄｕｃｅｄａｌａｒｇｅａｍｏｕｎｔｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｒｏｏｔｓ，ｂｕｔｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ｃｈａｎｇｅｉｎｌｅａｖｅｓ．Ｔｈｅ犆狊犛犃犕犛１ｇｅｎｅｗａｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓ，ａｎｄｉｔｉｓａｂａｓｉｓｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙｏｎｇｅ
ｎｅｔｉｃｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｇｒａｓｓｄｒｏｕｇｈｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犆犾犲犻狊狋狅犵犲狀犲狊狊狅狀犵狅狉犻犮犪；犛犃犕犛；ｇｅｎｅｃｌｏｎｅ；ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓ；ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ
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