全 文 ：向日葵 S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因克隆与分析
周向红 王 萍
(淮海工学院海洋学院，222005，江苏连云港)
摘 要 为了研究 S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-
adenosylmethionine synthetase，SAMS)在向日葵(He-
lianthus annuus)抗旱和耐盐过程中的作用，先根据
计算机辅助克隆结果设计引物，抽提盐胁迫向日葵
叶片的总 RNA，然后采用 RT-PCR 扩增技术克隆了
向日葵的 1个 SAMS基因(命名为 HaSAMS 1) ，
HaSAMS1 基因的编码序列长 1 173bp，编码 390 个
氨基酸残基。HaSAMS1 没有跨膜结构域，没有信号
肽，含有 SAMS蛋白的特征序列。HaSAMS1 与其他
物种的 SAMS 具有较高的序列相似性，与茼蒿
(Chrysanthemum coronarium)和拟南芥(Arabidopsis
thaliana)等高等植物 SAMS的氨基酸序列一致性介
于 86. 8% ～ 96. 9%。HaSAMS1 基因的克隆为进一
步研究向日葵抗旱和耐盐机理奠定了基础。
关键词 向日葵;S-腺苷甲硫氨酸合成酶;
SAMS基因;克隆
S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine
synthetase，SAMS，EC:2. 5. 1. 6)在生物体内催化三
磷酸腺苷和 L-甲硫氨酸反应生成 S-腺苷甲硫氨酸
(S-adenosylmethionine，SAM)［1］。SAM 是生物体内
重要的中间代谢物，参与转甲基、转硫、转氨丙基等
反应［1］。SAM 作为前体或供体能合成乙烯(ethyl-
ene)、多胺(polyamine)和甜菜碱(betaine) ，这些物
质在植物体内参与了逆境的抵抗过程［2］，因此
SAMS在抗旱和耐盐过程中发挥积极作用。来自基
因表达分析的数据表明了 SAMS 基因受干旱和盐胁
迫的诱导表达［3 － 4］。不仅如此，超表达 SAMS 还能
提高转基因植物的抗旱和耐盐能力［5］。
向日葵(Helianthus annuus)是一种重要的油料
作物，在世界各地广泛栽培。它具有较强的抗旱性
作者简介:周向红，实验师，主要从事生物化学与分子生物学教学与
研究
王萍为通讯作者，教授，主要从事植物基因工程研究
基金项目:教育部大豆重点实验室开放课题(SB08A03) ;淮海工学院
自然科学研究项目(2010150023)
收稿日期:2011 － 08 － 10
和耐盐性，能生长于较干旱地区和盐碱地区。这种
特性引起了各国学者的关注，已从形态学和生理学
等多方面探讨了向日葵的抗旱和耐盐机理［6］。但
是目前尚无向日葵 SAMS 基因克隆的报道，而且
SAMS在向日葵的抗旱和耐盐过程中发挥何种作用
及其作用程度也不清楚。因此，本试验采用计算机
辅助克隆技术快速获得了向日葵的 1 个 SAMS 基因
(命名为HaSAMS1) ，并分析了其序列特征，为进一
步研究HaSAMS1 在抗旱和耐盐过程中的作用机理
乃至开展遗传改良工作奠定了基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
依据王萍等［7］的研究结果，选用耐盐性好的向
日葵品种长岭白作为试验材料，向日葵种子于室温
下浸种 24h 后播种，待向日葵长至四叶期时用
0. 8%的 NaCl浇灌，盐胁迫 2d后剪取幼嫩叶片用于
总 RNA抽提。
1. 2 总 RNA的分离纯化
参照周向红等［8］的 CTAB 改良法提取总 RNA。
取 100mg叶片，液氮研磨，加入 700μL CTAB裂解液
进行裂解，接着加氯仿抽提，用 LiCl 选择性沉淀总
RNA，75%乙醇漂洗沉淀，最后用无 RNase 水溶解
RNA沉淀。总 RNA的完整性和纯度通过琼脂糖凝
胶电泳和核酸蛋白定量仪(Bio-Rad)检测。
1. 3 计算机辅助克隆与引物设计
计算机辅助克隆技术路线参照易乐飞等［9］的
方法，利用向日葵 EST(expressed sequence tag)序列
拼接得到了HaSAMS1 基因的核酸序列。接着对此
序列进行编码区(coding region)预测，然后在编码区
两外侧设计 1 对引物，上游引物:5CTTCCCATCCT-
TCCCACG3，下 游 引 物:5 GAAAACAACATGC-
CGAGTGA3 ，预期的扩增产物长 1 288bp，且包含
HaSAMS1基因的完整编码区。
1. 4 RT-PCR反应
取 1μg总 RNA，以 Oligo(dT)为引物，按 Rever-
01
作物杂志 Crops2011. 6
DOI:10.16035/j.issn.1001-7283.2011.06.009
tAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis kit(Fer-
mentas)说明操作，反转录生成第一链 cDNA。PCR反
应在 50μL 体系中进行，体系中含有 1 × PCR Buffer、
2mmol /L MgCl2、200μmol /L dNTP、0. 5μmol /L上游引
物、0. 5μmol /L 下游引物、2U Taq DNA 聚合酶(Fer-
mentas)和 1μL 第一链 cDNA。在 PCR 仪(Eppen-
dorf)上设置反应条件:95℃预变性 3min，接着 30 个
循环(每个循环中 95℃变性 30s，53℃退火 30s，72℃
延伸 80s) ，最后 72℃充分延伸 3min。扩增产物进行
正反双向测序。
1. 5 序列分析
采用 ProtParam［10］分析 HaSAMS1 的各种基本理
化特性，用 ScanProsite［11］分析HaSAMS1 的特征序列，
用 Clustal W［12］进行多序列比对，用 MEGA5［13］构建
进化树。
2 结果与分析
2. 1 总 RNA质量
总 RNA经电泳检测后呈现出清晰明亮的 28S
rRNA和 18S rRNA 条带以及一些细胞器 rRNA 条带。
经核酸蛋白定量仪检测后，总 RNA 的 A260 /A280 =
2. 07，A260 /A230 = 2. 16。这表明抽取的总 RNA片段完
整、纯度高，RNA质量能满足后续试验要求。
2. 2 基因克隆结果
从向日葵 EST 数据库中筛选出了 37 条符合聚
类条件的 EST 序列，这些 EST 序列拼接后获得了 1
条长 1 553nt 的 contig 序列(图 1)。据此设计引物，
接着进行 RT-PCR。扩增产物经电泳后呈现出 1 条长
灰色背景表示 SAMS蛋白的特征序列
图 3 HaSAMS1的 cDNA序列和氨基酸序列
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约 1 300bp的单一特异性片段(图 2) ，其长度与预
期大小相近。双向测序得到了HaSAMS1 基因的编
码序列(图 3) ，测序结果已提交至 GenBank。
2. 3 序列分析
测序所得 HaSAMS1 基 因 的 编 码 序 列 长
1 173bp，与拼接得到的 contig 序列之间仅 1 个碱基
差异，彼此间的核酸序列一致性达到了 99. 9%。这
个差异碱基出现在第 101 个密码子的第三位上，由
于密码子的简并性，这个差异碱基并没有改变编码
的氨基酸，所以彼此间的氨基酸序列一致性为
100%。这表明测序结果与拼接结果完全一致。
HaSAMS1 蛋白包含 390 个氨基酸残基，分子量
为 42. 6kDa，其碱性、酸性、疏水性和极性氨基酸数
量分别为 43、54、130 和 92 个，含量最丰富的氨基酸
是 Gly，占 9. 0%，含量最少的是 Trp，占 0. 8%，理论
等电点(pI)为 5. 58。HaSAMS1 包含 2 个 SAMS 蛋
白的特征序列(图 3) ，即 GAGDQGhmfGY(第 119 ～
129 位氨基酸残基)和 GGGAFSgKD(第 266 ～ 274 位
氨基酸残基)。同其他物种的 SAMS一样，HaSAMS1
以亲水性为主，没有跨膜结构域，没有信号肽。
将 HaSAMS1 的氨基酸序列在 GenBank 上进行
BLAST比对，结果显示该序列与其他物种的 SAMS
具有较高的序列相似性，但在向日葵的蛋白数据库
没有与之相似的序列。我们从 GanBank 中选取了
茼蒿(Chrysanthemum coronarium)、拟南芥(Arabidop-
sis thaliana)、水稻 (Oryza sativa)和莱茵衣藻
(Chlamydomonas reinhardtii)等生物的 SAMS 进行多
序列比对并构建进化树。结果(图 4)显示，除了莱
茵衣藻的 SAMS单独成簇外，其他高等植物的 SAMS
聚类成 2 大簇(命名为 I 型和 II 型 SAMS) ，与
Schrder等［14］的研究结果一致。这种聚类关系与
植物的分类地位无关，比如拟南芥、毛果杨(Populus
trichocarpa)和矮牵牛(Petunia × hybrida)同时具有 I
型和 II 型 SAMS。因此可能暗示着高等植物的
SAMS 具有两个彼此相似的原始祖先，它们在进化
过程中经过复制和变异产生了现在的各种 SAMS。
HaSAMS1 与同属菊科茼蒿的 SAMS 亲缘关系最近，
彼此间的序列一致性为 96. 9%，与拟南芥和水稻等
其他高等植物的序列一致性介于 86. 8% ～ 95. 4%，
与莱茵衣藻的序列一致性为 82. 7%，说明 SAMS 在
进化上高度保守。
用 NJ法构建进化树，节点前数字表示自举支持率，
GenBank索引号显示在括号中
图 4 不同生物 SAMS的系统进化树
3 讨论
SAMS是一个多基因家族，在不少生物中已发
现了多种 SAMS 同工酶，例如来自 GenBank 的数据
显示拟南芥、水稻、大麦(Hordeum vulgare)和毛果杨
分别具有 4、3、4 和 6 种 SAMS同工酶。这些同工酶
彼此间的氨基酸序列一致性较高，例如大麦 SAMS1
与 SAMS2 之间的氨基酸序列一致性为 99. 2%，拟
南芥 SAMS1 与 SAMS2 之间的一致性也高达
96. 4%。那么在向日葵中是否也存在多种 SAMS 同
工酶，以及如何设定拼接参数才能避免这种序列高
度一致性的影响呢?如果拼接参数设置过于宽松，
那么会将来自不同基因的 EST 拼接成 1 条序列;如
果拼接参数设置过于严格，那么会将来自 1 个基因
的若干个 EST 拼接成多条序列。因为 EST 是经一
次测序产生的，测序错误率平均在 3%左右，因此设
定拼接参数为:2 条 EST序列的重叠区超过 40 个碱
基，且该区域的碱基一致性大于 94%［15］。对向日
葵 13 万多条 EST 序列进行了筛选，将符合聚类条
件的挑选出来进行拼接，获得了 2 条可能的 SAMS
基因序列。其中一条序列已在本试验中克隆，而且
实际测序结果与拼接结果相符。这表明拼接参数设
置正确，拼接结果可靠，那么也就意味着在向日葵中
至少存在 2 个 SAMS同工酶。随着向日葵 EST序列
不断增加，也许还能发现更多 SAMS同工酶。
大量数据表明 SAMS基因受干旱和盐胁迫的诱
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导表达，例如盐地碱蓬(Suaeda salsa)［3］和糜子
(Panicum miliaceum)［4］的 SAMS基因受干旱胁迫的
诱导表达，大洋洲滨藜(Atriplex nummularia)［16］、烟
草(Nicotiana tabacum)［17］和盐地碱蓬［3］的 SAMS 基
因受盐胁迫的诱导表达。但是不同 SAMS 同工酶对
干旱和盐胁迫的应答反应不完全相同，例如在盐胁
迫下长春花(Catharanthus roseus)的 3 种 SAMS 同工
酶在不同组织中具有不同的表达［14］，烟草的 2 种
SAMS同工酶对盐胁迫的反应也不同［17］。因此，在
向日葵的抗旱和耐盐过程中HaSAMS1 基因的组织
表达模式和作用方式都有待于进一步研究。
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Molecular Cloning and Bioinformatic Analysis
of S-adenosylmethionine Synthetase Gene
from Helianthus annuus
Zhou Xianghong，Wang Ping
(School of Marine Science ＆ Technology，HuaiHai Institute of Technology，Lianyungang 222005，Jiangsu，China)
Abstract To investigate contributions of S-adenosylmethionine synthetase (SAMS)to tolerance to drought and salt
in Helianthus annuus，we cloned one SAMS gene (designated as HaSAMS1)using RT-PCR from H． annuus． The
primers were designed according to results of computer-assisted cloning． Total RNAs were isolated from the leaves of
H． annuus treated by salt． The HaSAMS1 gene contained a complete coding sequence of 1173 bp，encoding the pro-
tein of 390 amino acids． HaSAMS1 contained signature motifs of SAMS family，but had no membrane spanning do-
main and signal peptide． The HaSAMS1 shared high amino acid sequence identity with the SAMSs from other organ-
isms． The amino acid sequence of HaSAMS1 showed 86． 8% － 96． 9% identity with the SAMSs from Chrysanthe-
mum coronarium，Arabidopsis thaliana and other higher plants． The cloning of HaSAMS1 laid a foundation for further
investigation of tolerance mechanism to drought and salt in H． annuus．
Key words Helianthus annuus;S-adenosylmethionine synthetase;SAMS gene;Cloning
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