全 文 ：林业科学研究 ２０１６，２９（１）：４１ ４７
ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ
文章编号：１００１１４９８（２０１６）０１００４１０７
荔波连蕊茶 ＧＡ２ｏｘ１基因的克隆及表达分析
肖 政１，２，李纪元２，范正琪２，李辛雷２，殷恒福２
（１．江苏省农业科学院园艺研究所／江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室，江苏 南京 ２１００１４；
２．中国林业科学研究院亚热带林业研究所，浙江 杭州 ３１１４００）
收稿日期：２０１５０３３１
基金项目：“十二五”国家科技支撑计划课题（２０１２ＢＡ０１Ｂ０７０３）；国家国际科技合作项目（２０１１ＤＦＡ３０４９０）；浙江省花卉新品种选育重大
科技专项（２０１２Ｃ１２９０９－６）；浙江省省院合作林业科技项目（２０１２ＳＹ０２）
作者简介：肖 政（１９８４—），男，福建三明人，助理研究员，博士，主要从事花卉分子育种研究．
通讯作者：湖南湘阴人，研究员，博导．Ｅｍａｉｌ：ｊｉｙｕａｎ＿ｌｉ＠１２６．ｃｏｍ
摘要：［目的］ＧＡ２氧化酶是赤霉素生物合成代谢过程中关键酶之一，ＧＡ２ｏｘ家族基因常被用于植物矮化基因工程
育种。［方法］根据植物ＧＡ２氧化酶基因编码区的保守序列设计引物，以山茶属荔波连蕊茶嫩枝为材料，提取总
ＲＮＡ，进行ＲＴＰＣＲ。采用ＲＡＣＥ技术扩增获得１３７１ｂｐ的ＧＡ２ｏｘ基因全长 ｃＤＮＡ序列，命名为 ＣｌＧＡ２ｏｘ１（ＧｅｎＢａｎｋ
登录号ＫＪ５０２２９０）。［结果］序列分析表明，ＣｌＧＡ２ｏｘ１放阅读框（ＯＲＦ）为１００２ｂｐ，编码３３３个氨基酸，５’非编码区
５９ｂｐ，３’非编码区３１０ｂｐ。预测的蛋白质分子量为３７．３１ｋＤ，等电点为５．９２，具有ＧＡ２ｏｘ超基因家族的保守结构域
和特有的氨基酸残基。ＣｌＧＡ２ｏｘ１蛋白与ＧｅｎＢａｎｋ中收录的其它植物 ＧＡ２ｏｘ蛋白氨基酸的相似性达到８０％。构建
系统进化树，结果显示山茶ＧＡ２氧化酶与烟草ＧＡ２ｏｘ蛋白的亲缘关系最为密切。实时定量ＰＣＲ结果显示，该基因
在荔波边蕊茶不同器官及发育不同时期的均有表达，表达量有所不同：ＣｌＧＡ２ｏｘ１基因在２年生茎段中的表达量最
高，在嫩枝和根中也有较高的表达，而在新抽生的嫩叶中最低。［结论］试验结果为进一步明确 ＣｌＧＡ２ｏｘ１基因的功
能特征及揭示其参与调控植物生长的分子机制奠定基础。
关键词：荔波连蕊茶；ＧＡ２氧化酶：实时荧光定量ＰＣＲ；克隆
中图分类号：Ｓ７１８４６ 文献标识码：Ａ
ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＧＡ２ｏｘ１ＧｅｎｅｆｒｏｍＣａｍｅｌｉａｌｉｐｏｅｎｓｉｓ
ＸＩＡＯＺｈｅｎｇ１，２，ＬＩＪｉｙｕａｎ２，ＦＡＮＺｈｅｎｇｑｉ２，ＬＩＸｉｎｌｅｉ２，ＹＩＮＨｅｎｇｆｕ２
（１．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，ＪｉａｎｇｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＪｉａｎｇｓｕＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌＣｒｏｐＧｅｎｅｔｉｃＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，
Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００１４，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ；２．ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＳｕｂｔｒｏｐｉｃａｌＦｏｒｅｓｔｒｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１１４００，Ｚｈｅｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｇｉｂｂｅｒｅｌｉｎ２ｏｘｉｄａｓｅｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｋｅｙｅｎｚｙｍｅｓｉｎＧＡｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ａｎｄＧＡ２ｏｘｇｅｎｅｓａｒｅ
ｏｆｔｅｎｕｓｅｄｔｏｄｗａｒｆｐｌａｎｔｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｂｒｅｅｄｉｎｇ．Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｔｈｅｇｉｂｂｅｒｅｌｉｎ２ｏｘｉｄａｓｅｇｅｎｅｗａｓｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍｔｈｅ
ｓｔｅｍｓｏｆＣａｍｅｌｉａｌｉｐｏｅｎｓｉｓｕｓｉｎｇＲＴＰＣＲａｎｄＲＡＣＥｍｅｔｈｏｄｓ．ＴｈｅｆｕｌｌｅｎｇｔｈｏｆｔｈｅＧＡ２ｏｘｇｅｎｅ，ｎａｍｅｄ
ＣｌＧＡ２ｏｘ１，ｉｓ１３７１ｂｐ（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＫＪ５０２２９０），ｗｈｉｃｈｃｏｎｔａｉｎｓａ１００２ｂｐｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｅｎｃｏ
ｄｉｎｇ３３３ａｍｉｎｏａｃｉｄｒｅｓｉｄｕｅｓ，ｃｏｎｔａｉｎｓａ５’ＵＴＲｗｉｔｈ５９ｂｐａｎｄ３’ＵＴＲ３１０ｂｐ．Ｔｈｅｐｕｔａｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｗｅｉｇｈｔｉｓ３７．３１ｋＤａｎｄｉｔｓｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｐｏｉｎｔｉｓ５．９２．ＴｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎｃｌｕｄｅｓＧＡ２ｏｘｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙｄｏｍａｉｎ
ａｎｄｔｈｅｆａｍｉｌｙｓｉｇｎａｔｕｒｅａｍｉｎｏａｃｉｄｒｅｓｉｄｕｅｓ．Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｈｏｗｓｔｈａｔｉｔｓｈａｒｅｓ８０％ ｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｉｄｅｎｔｉ
ｔｉｅｓｗｉｔｈＧＡ２ｏｘｆｒｏｍｏｔｈｅｒｐｌａｎｔｓｉｎＧｅｎＢａｎｋ．Ｔｈｅｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｏｎｔｈｅｂａｓｉｓｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅ
ｑｕｅｎｃｅｓｏｆＧＡ２ｏｘｓｕｇｇｅｓｔｓｔｈａｔｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎＣ．ｌｉｐｏｅｎｓｉｓａｎｄＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍｉｓｔｈｅｍｏｓｔｉｎｔｉｍａｔｅ．
ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＣｌＧＡ２ｏｘ１ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｉｎｒｏｏｔ，ｙｏｕｎｇｓｔｅｍ，ｔｗｏｙｅａｒｏｌｄｓｔｅｍ，ｙｏｕｎｇｌｅａｆ，
ｍａｔｕｒｅｌｅａｆａｎｄｓｅｅｄｏｆＣ．ｌｉｐｏｅｎｓｉｓｗｅｒｅｄｉｆｅｒｅｎｔ．ＴｈｅＣｌＧＡ２ｏｘ１ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓｗｅｒｅｔｈｅｍｏｓｔａｂｕｎｄａｎｔｉｎｔｗｏｙｅａｒ
ｏｌｄｓｔｅｍ，ｆｏｌｏｗｅｄｂｙｎｅｗｓｔｅｍａｎｄｒｏｏｔ，ａｎｄｔｈｅｌｏｗｅｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓｗｅｒｅｆｏｕｎｄｉｎｔｈｅｙｏｕｎｇｌｅａｆ．Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｍａｙ
林 业 科 学 研 究 第２９卷
ｐｒｏｖｉｄｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＣｌＧＡ２ｏｘ１ａｎｄｉｔｓｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｎ
ｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃａｍｅｌｉａｌｉｐｏｅｎｓｉｓ；ＧＡ２ｏｘｉｄａｓｅ；ｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ；ｃｌｏｎｉｎｇ
赤霉素（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｉｎ，ＧＡｓ）是一种重要的植物内
源激素，具有生物活性的 ＧＡｓ作用于高等植物的整
个生命周期，如种子萌发、茎的伸长、花器官的分化
和发育、果实和种子的生长等［１－３］。随着研究的深
入，各种突变体材料的获得和利用，赤霉素的合成代
谢途径已经被基本阐明，与其代谢相关的大多数基
因已经在模式植物中克隆获得［４－５］。
ＧＡ２氧化酶（ＧＡ２ｏｘ）是由多基因编码的双加氧
酶，它通过催化具有生物活性的ＧＡ１和 ＧＡ４转变成
无生物活性的ＧＡ８和ＧＡ３４，使植物体内具有生物活
性的ＧＡｓ降低，从而诱导植物节间缩短、矮化，以及
延迟开花和影响种子萌发［６－８］。因此ＧＡ２ｏｘ家族基
因常被用于植物矮化基因工程育种和降低植物内源
ＧＡｓ水平的生理效应研究中［９－１１］。目前，已经有多
种植物的ＧＡ２ｏｘ基因被成功克隆并取得了一些研究
进展，如水稻（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．）［１２］、拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐ
ｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ（Ｌ．）Ｈｅｙｎｈ．）［１３－１５］、小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓ
ｔｉｖｕｍ Ｌ．）［１６］、夏堇 （ＴｏｒｅｎｉａｆｏｕｒｎｉｅｒｉＬｉｎｄｅｎ．ｅｘ
Ｆｏｕｒｎ．）［１７］、南瓜 （Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｍｏｓｃｈａｔａ（Ｄｕｃｈ．ｅｘ
Ｌａｍ．）Ｄｕｃｈ．ｅｘＰｏｉｒｅｔ）［１８］和苹果（Ｍａｌｕｓｐｕｍｉｌａ
Ｍｉｌ．）［１９］等，而有关山茶（Ｃａｍｅｌｉａｓｐｐ．）ＧＡ２ｏｘ基
因的研究还未见报道。
山茶属（ＣａｍｅｌｉａＬ．）植物不仅具有重要的经济
利用价值，如茶饮、油料、药用等，而且大多数种类具
有观赏价值。荔波连蕊茶属山茶科（Ｔｈｅａｃｅａｅ）山茶
属，灌木至小乔木［２０］。本研究以荔波连蕊茶（Ｃ．ｌｉ
ｐｏｎｅｓｉｓＣｈａｎｇｅｔＸｕ）的嫩枝为材料，采用 ＲＴＰＣＲ和
ＲＡＣＥ技术克隆出 ＧＡ２氧化酶基因全长（命名为
ＣｌＧＡ２ｏｘ１），利用生物信息学方法对其序列进行分
析，并对该基因在植株中的不同器官及器官发育不
同阶段的表达特异性进行了初步研究，为研究该基
因在观赏植物的矮化基因工程应用奠定基础。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
荔波连蕊茶种植于中国林业科学研究院亚热带
林业研究所山茶花种质资源圃。采集当年抽生的嫩
枝，液氮速冻后，置于－８０℃冰箱保存备用。
１．２ 总ＲＮＡ的提取
采用北京天恩泽生物技术有限公司柱式 ＲＮＡ
提取试剂盒提取嫩枝的总 ＲＮＡ，用 ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
公司ＮａｎｏＤｒｏｐＮＤ２０００核酸测定仪测定 ＲＮＡ浓度
和纯度，用１．０％的变性琼脂糖凝胶电泳检测 ＲＮＡ
质量，将ＲＮＡ保存于－８０℃备用。
１．３ ＣｌＧＡ２ｏｘ１基因ｃＤＮＡ全长的克隆
根据ＧｅｎＢａｎｋ上已公布的近缘物种ＧＡ２ｏｘ基因
序列信息，通过比对分析，查找 ＧＡ２ｏｘ基因保守区，
用Ｐｒｉｍｅｒ５．０软件设计正、反向引物 Ｐ１：ＧＣＴＴＣＴ
ＴＣＡＡＧＧＴＧＡＴＣＡＡＣＣＡ， Ｐ２： ＣＣＴＣＡＣＡＣＴＣＴＴＡ
ＡＡＣＣＴＣＣＣＡ，扩增获得该基因片段并测序。根据这
段序列信息，设计 ３’ＲＡＣＥ特异引物 ＧＳＰ１：
ＧＧＣＧＡＴＧＣＣＧＧＴＴＧＧＧＴＣＧＡＡＴＡＴＣ，５’ＲＡＣＥ特异
引 物 ＧＳＰ２： ＴＣＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＣＧＧＣＡＣＧＧＡＧＧＧ
ＴＡＧ。以嫩枝的ＲＮＡ为材料，按照 Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司的
ＳＭＡＲＴＲＡＣＥ试剂盒说明书进行３’ＲＡＣＥＰＣＲ和
５’ＲＡＣＥＰＣＲ反应，扩增出目的基因３’端序列和
５’端序列。
从１．０％的琼脂糖凝胶中切胶回收扩增的特异
性片段，具体步骤参照 Ａｘｙｇｅｎ公司的 ＤＮＡ回收试
剂盒。将回收产物连接至 ｐＧＥＭＴＥａｓｙ载体，再转
化大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５感受态细胞，挑取阳性克隆
进行菌落ＰＣＲ反应检测，将阳性克隆摇菌送上海华
大基因公司基因测序。为保证测序的准确性，每次
挑取２个独立克隆进行双向测序。将测序结果与已
经得到ＧＡ２ｏｘ基因片段序列进行电子拼接，最终获
得山茶ＧＡ２ｏｘ基因的ｃＤＮＡ全长序列。
１．４ ＣｌＧＡ２ｏｘ１基因的蛋白结构特征
利用ＮＣＢＩ提供的Ｂｌａｓｔ程序进行同源搜索和预
测保守结构域，ＯＲＦＦｉｎｄｅｒ查找 Ａｃｔｉｎ基因 ｃＤＮＡ开
放阅读框。用 ＰｒｏｔＰａｒａｍ软件（ｈｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．
ｏｒｇ／ｃｇｉｂｉｎ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ）计算ＧＡ２ｏｘ氨基酸
的相对分子量、理论等电点和稳定性［２１］；利用 ＮＣＢＩ
提供的 Ｒｐｓｂｌａｓｔ程序（ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．
ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｗｒｐｓｂ．ｃｇｉ）进行保守域分析；用
ＳｉｇｎａｌＰ（ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ）
预测蛋白质序列中信号肽的剪切位点［２２］；利用ＨＮＮ
软件 （ｈｔｐ：／／ｎｐｓａｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉｂｉｎ／ｓｅｃｐｒｅｄ＿
ｈｎｎ．ｐｌ）进行二级结构分析［２３］。
１．５ ＣｌＧＡ２ｏｘ１蛋白的氨基酸序列同源性分析
使用ＭＥＧ４软件对荔波连蕊茶和其它物种的
２４
第１期 肖 政，等：荔波连蕊茶ＧＡ２ｏｘ１基因的克隆及表达分析
ＧＡ２ｏｘ氨基酸序列进行同源比对并构建进化树［２４］。
１．６ ＧＡ２ｏｘ１基因在荔波连蕊茶中的荧光定量表达
分析
分别采集荔波连蕊茶的新稍顶端茎段、新稍顶
端的第１ ２片嫩叶、成熟叶片、２年生茎段、根和种
子，用北京天恩泽生物技术有限公司柱式 ＲＮＡ提取
试剂盒提取总 ＲＮＡ。取１μｇ总 ＲＮＡ，用 Ｔａｋａｒａ公
司的荧光定量反转录试剂盒获得 ｃＤＮＡ。根据获得
的ＧＡ２ｏｘ基因序列，按照荧光定量引物要求，设计一
对引物 ＡＰ１：ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＣＧＣＴＡ和
ＡＰ２：ＧＡＣＧＴＣＧＡＣＴＧＡＧＧＣＴＧＣＡＡＴＴＴＴＣＴＣ。扩增
内参基因ＣｌＡｃｔｉｎ的引物为：ＡＧＧＴＧＴＧＧＴＴＡＴＧＡＡＴ
ＧＧＡＡＧＧ和 ＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＧＣＣＡＴＣＣＴＡＣ［２５］。反应
在ＡＢＩ７３００实时荧光定量 ＰＣＲ仪（美国 ＡＢＩ公司）
上进行，采用 ＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠ染料法，按照 ＳＹＢＲ
ＧｒｅｅｎＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴＰＣＲＫｉｔ试剂盒（日本 Ｔａｋａｒａ
公司）进行实时荧光定量ＰＣＲ反应。ＰＣＲ反应条件
为：９５℃ ３０ｓ，进行 ４０个循环，每个循环采用两步
法：９５℃ ５ｓ，６０℃ ３１ｓ。反应中每个样本设３个平
行重复。试验数据通过ＡＢＩ７３００实时荧光定量系统
进行采集和分析，采用２－△△ＣＴ法分析目标基因的相
对表达量。
２ 结果与分析
２．１ 荔波连蕊茶茎段总ＲＮＡ提取
将提取的荔波连蕊嫩枝总 ＲＮＡ进行电泳检测，
电泳显示２８ＳｒＲＮＡ和１８ＳｒＲＮＡ条带清晰，浓度比
约为２∶１（图１），说明提取的ＲＮＡ完整性较好，能够
满足后续试验的要求。
Ｍ：ＤＮＡ分子量标准；１：样品
图１ 荔波连蕊茶茎段总ＲＮＡ提取
２．２ ＣｌＧＡ２ｏｘ１基因ｃＤＮＡ全长克隆
采用同源克隆方法，从荔波连蕊茶中得到一个
长为６２１ｂｐ目的ｃＤＮＡ片段（图２）。根据此片段设
计ＲＡＣＥ特异引物ＧＳＰ１和ＧＳＰ２，得到３’端序列和
５’端序列。将测序得到的中间片段、５’端序列和
３’端序列进行电子拼接，得到全长为 １３７１ｂｐ的
ｃＤＮＡ。
Ｍ：ＤＮＡ分子量标准；Ａ：ＣｌＧＡ２ｏｘ１基因特异片段；
Ｂ：３’端扩增序列；Ｃ：５’端扩增序列；Ｄ：ＣｌＧＡ２ｏｘ１基因全长
图２ ＣｌＧＡ２ｏｘ１基因扩增电泳图
用ＯＲＦ软件对该序列进行分析，５’端（５’
ＵＴＲ）有５９ｂｐ的非编码区，３’端（３’ＵＴＲ）有３１０
ｂｐ的非编码区，序列末端含有ｐｏｌｙ（Ａ）结构，开放阅
读框长１００２ｂｐ，编码３３３个氨基酸（图３）。在起始
密码子ＡＴＧ上游３位核苷酸为Ａ，＋４位为Ｇ，这一
典型的ＫｏｚａＫ结构对于蛋白质合成的４０Ｓ起始复合
物正确识别启动密码子具有重要的作用；在终止密
码子后可见２６ｂｐ的ＰｏｌｙＡ尾。该基因已经在 Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ登录，登录号为ＫＪ５０２２９０。
２．３ ＣｌＧＡ２ｏｘ１蛋白结构分析
ＣｌＧＡ２ｏｘ１基因通过 Ｐｒｏｔｐａｒａｍ软件预测蛋白分
子量为３７．３１ｋＤ，理论等电点（ＰＩ）为５．９２，酸性氨
基酸残基总数（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）为３８，碱性氨基酸残基总
数（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）为３５，分子式为 Ｃ１６９６Ｈ２６２８Ｎ４３０Ｏ４５９Ｓ１１，
不稳定系数为３０．５７，蛋白属于稳定蛋白。
Ｐｒｏｓｉｔｅ分析ＧＡ２ｏｘ蛋白的功能位点，发现该基因
含有依赖于２酮戊二酸和Ｆｅ２＋的双加氧酶超家族保
守结构域的 ４个氨基酸残基，其中 ２个组氨酸
（Ｈｉｓ２０６、Ｈｉｓ２６３）和１个天冬氨酸（Ａｓｐ２０８）与Ｆｅ２＋结
合，１个精氨酸（Ａｒｇ２７３）与２酮戊二酸结合（图３）。
利用ＮＣＢＩＣｏｎｓｅｒｖｅｄＤｏｍａｉｎＳｅａｒｃｈ进行保守域
分析，发现ＣｌＧＡ２ｏｘ１基因编码的蛋白属于ＧＡ２ｏｘ超
家族（图４）。ＳｉｇｎａｌＰ４．１软件分析ＣｌＧＡ２ｏｘ１的氨基
酸序列，没有发现信号肽及其剪切位点，表明
ＣｌＧＡ２ｏｘ１蛋白是非分泌型蛋白。
３４
林 业 科 学 研 究 第２９卷
数字代表核苷酸的个数；下划线分别表示起始密码子和终止密码子；方框为保守的氨基酸残基
图３ ＣｌＧＡ２ｏｘ１基因全长序列及预测的氨基酸序列
横轴数字代表氨基酸位置
图４ ＣｌＧＡ２ｏｘ１基因的保守功能结构域分析
二级结构预测结果表明，ＣｌＧＡ２ｏｘ１蛋白主要以
无规则卷曲为主，占 ４４．１４％；其次为 α螺旋，占
３４２３％；延伸链占２１．６２％，无 β转角分布（图５）。
蛋白质的功能很大程度上取决于其空间结构，其中
α螺旋主要对蛋白质骨架起到稳定作用，而无规则
卷曲结构决定了蛋白质的功能，特别是酶的功能部
位常常位于这种区域中。ＣｌＧＡ２ｏｘ１蛋白的无规则
卷曲结构占了４４．１４％，表明该基因在荔波连蕊茶
生长发育中具有重要功能。
$
轴数字代表氨基酸位置；蓝色表示α螺旋；红色表示无规则卷曲
图５ ＣｌＧＡ２ｏｘ１基因的二级结构分析
４４
第１期 肖 政，等：荔波连蕊茶ＧＡ２ｏｘ１基因的克隆及表达分析
２．４ ＣｌＧＡ２ｏｘ１基因编码的氨基酸序列同源性及系
统进化分析
利用 ＮＣＢＩ网站上的在线 Ｂｌａｓｔ分析 ＣｌＧＡ２ｏｘ１
序列，结果表明，该基因与其它植物的 ＧＡ２氧化酶
基因高度同源，核苷酸相似性在７０％以上，其中与
烟草（ＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＬ．）ＧＡ２ｏｘ的相似性达到
８０％，与毛白杨（ＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａＴｏｒｅｔＧｒａｙ）
ＧＡ２ｏｘ的相似性达到７８％，与葡萄（ＶｉｔｉｓｖｉｎｉｆｅｒａＬ．）
ＧＡ２ｏｘ的相似性达到７８％。
将 ＣｌＧＡ２ｏｘ１基因编码的氨基酸序列与 ＮＣＢＩ
数据库的 ＧＡ２ｏｘ蛋白氨基酸序列进行比对分析。
不同物种的 ＧＡ２ｏｘ蛋白氨基酸序列存在高度的相
似性，选取相似性较高的１０种植物的 ＧＡ２ｏｘ蛋白
氨基酸序列与ＣｌＧＡ２ｏｘ１蛋白氨基酸序列进行比较
分析，采用相邻连接法绘制进化树。由图６可见，
ＣｌＧＡ２ｏｘ１蛋白与烟草、葡萄、毛白杨和苹果的
ＧＡ２ｏｘ蛋白的遗传距离较近，其中荔波连蕊茶
ＧＡ２ｏｘ１和烟草 ＧＡ２ｏｘ１、毛白杨 ＧＡ２ｏｘ１、拟南芥
ＧＡ２ｏｘ１－３等聚合为一个亚家族；拟南芥 ＧＡ２ｏｘ４、
ＧＡ２ｏｘ６和水稻 ＧＡ２ｏｘ１聚合第 ２亚家族；拟南芥
ＧＡ２ｏｘ７和 ＧＡ２ｏｘ８为第３亚家族。通过以上生物
信息学分析，初步确定实验获得荔波连蕊茶 ＧＡ２ｏｘ
氧化酶的全长基因。
物种学名：豌豆（ＰｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍＬ．），水稻（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．），黄瓜（ＣｕｃｕｍｉｓｓａｔｉｖｕｓＬ．）；
括号中代码为该物种ＧＡ２ｏｘ蛋白氨基酸序列的ＧｅｎＢａｎｋ登录号
图６ 不同物种的ＧＡ２ｏｘ蛋白氨基酸序列的系统进化树
２．５ ＣｌＧＡ２ｏｘ１基因在荔波连蕊茶不同器官和发育
不同时期的表达特性分析
采用荧光定量 ＰＣＲ的方法检测 ＣｌＧＡ２ｏｘ１基因
在荔波连蕊茶不同器官及发育的不同阶段的表达
量，结果见图７。ＣｌＧＡ２ｏｘ１基因在植株的各器官中
均有表达，在２年生茎段中的表达量最高，在嫩枝和
根中也有较高的表达，而在新抽生的嫩叶中最低。
据此推断，ＣｌＧＡ２ｏｘ１与荔波连蕊茶茎的生长发育密
切相关。
３ 结论与讨论
本研究利用ＲＴＰＣＲ和 ＲＡＣＥ技术首次从山茶
总ＲＮＡ中分离出 ＧＡ２氧化酶基因，该基因具有
ＧＡ２ｏｘ基因家族共同的结构特点，含有保守的２０Ｇ
ＦｅⅡ＿Ｏｘｙ蛋白结构域，及与Ｆｅ２＋结合的２个Ｈ残基
和 １个 Ｄ残基，与 ２酮戊二酸结合的 １个 Ｒ残
基［２６］。通过与ＮＣＢＩ已登录的其它植物ＧＡ２ｏｘ基因
编码蛋白序列比对，其氨基酸序列的相似性达到
５４
林 业 科 学 研 究 第２９卷
图７ ＣｌＧＡ２ｏｘ１基因在植株不同器官及发育不同时期的表达量
８０％。生物信息学分析表明试验得到的 ＣｌＧＡ２ｏｘ１
基因属于ＧＡ２ｏｘ基因家族。
通过构建系统进化树发现，荔波连蕊茶
ＣｌＧＡ２ｏｘ１基因与烟草、葡萄和杨树的同源性最高，
达到 ８０％以上；其次是苹果和豌豆，同源性达到
７０％；与水稻的同源性最低，只有４４％。研究表明
拟南芥ＧＡ２ｏｘ基因可分为３类：Ⅰ类包括ＡｔＧＡ２ｏｘ１、
ＡｔＧＡ２ｏｘ２和 ＡｔＧＡ２ｏｘ３，主要催化 Ｃ１９ＧＡｓ（ＧＡ１和
ＧＡ４）失活；Ⅱ类包括 ＡｔＧＡ２ｏｘ４和 ＡｔＧＡ２ｏｘ６，主要催
化Ｃ１９ＧＡｓ的前体（ＧＡ２０和 ＧＡ９）失活；Ⅲ类包括 Ａｔ
ＧＡ２ｏｘ７和 ＡｔＧＡ２ｏｘ８，主要催化 Ｃ２０ＧＡｓ（ＧＡ１２和
ＧＡ５３）２β羟基化
［２７］。通过构建系统树发现，荔波连
蕊茶ＣｌＧＡ２ｏｘ１属于Ⅰ类，催化具有生物活性的 ＧＡ４
和ＧＡ１降解失活。
ＧＡ２氧化酶是由多基因编码的双加氧酶，以２
酮戊二酸为底物，催化 ＧＡｓ失去活性。在矮牵牛
（ＰｅｔｕｎｉａｈｙｂｒｉｄａＶｉｌｍ．）、油菜（ＢｒａｓｉｃａｎａｐｕｓＬ．）和
水稻等植物中异源表达ＧＡ２ｏｘ会降低植物体内活性
ＧＡｓ水平，诱导植株矮化［９，２８－２９］。赤霉素合成代谢
早期途径在高等植物中基本相同，而在 ＧＡ１２以后的
代谢途径中，不同 ＧＡ２ｏｘ在不同物种和不同组织中
的表达量有较大差异。目前已经从拟南芥中分离出
８个ＧＡ２ｏｘ基因，这８个基因的表达模式有所不同，
其中ＡｔＧＡ２ｏｘ１基因在根茎和花中优势表达，在种子
中没有表达；ＡｔＧＡ２ｏｘ２基因在茎、花和荚果等成熟组
织中特异表达［１４，３０］。屠煦童等［３１］从矮化品种‘南
通小方柿’（ＤｉｏｓｐｙｒｏｓｋａｋｉＬｉｎｎ．ｃｖ．Ｎａｎｔｏｎｇｘｉａｏｆａｎｇ
ｓｈｉ）中分离出ＤｋＧＡ２ｏｘ１和ＤｋＧＡ２ｏｘ２，发现２个基因
在开花期的表达量达到最高，而且在矮化品种‘南通
小方柿’中的表达量均高于乔化品种‘大方柿’，推
测ＤｋＧＡ２ｏｘ１和 ＤｋＧＡ２ｏｘ２基因的高量表达与‘小方
柿’的矮化性状密切相关。王成祥等［３２］发现花生
（ＡｒａｃｈｉｓｈｙｐｏｇａｅａＬ．）ＧＡ２ｏｘ基因在花生幼年期的各
组织中表达量较低，而在成年期的叶片和根中表达
量较高。在本研究中荔波连蕊茶 ＣｌＧＡ２ｏｘ１基因在
植株的各器官中均有表达，在老叶和根中的表达量
也较高，在嫩叶中的表达量最低，但在嫩枝和２年生
茎段中的表达量达到最高，表明不同物种 ＧＡ２ｏｘ基
因虽然高度同源，但在功能上存在差异性。本研究
分离的ＣｌＧＡ２ｏｘ１基因可能主要参与调控山茶花茎
的生长与发育，是实现调控茎伸长生长的一个关键
靶基因。
目前，ＧＡ２０ｏｘ是研究赤霉素合成代谢最多的一
种酶，而在木本植物上关于 ＧＡ２ｏｘ基因的研究报道
还很少。本研究首次从山茶中分离获得 ＣｌＧＡ２ｏｘ１
基因，并对其序列进行了生物信息学分析；同时采用
实时荧光定量 ＰＣＲ技术检测荔波连蕊茶 ＣｌＧＡ２ｏｘ１
基因在不同组织不同时期 ｍＲＮＡ水平上的表达差
异，这为进一步明确该基因的功能特征及揭示其参
与调控植物生长的分子机制奠定基础，为最终利用
转基因技术实现山茶花矮化育种提供理论依据。
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第１期 肖 政，等：荔波连蕊茶ＧＡ２ｏｘ１基因的克隆及表达分析
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（责任编辑：金立新）
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