全 文 ：林业科学研究 ２０１４，２７（３）：３７４ ３８０
ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ
文章编号：１００１１４９８（２０１４）０３０３７４０７
荔波连蕊茶肌动蛋白基因全长 ｃＤＮＡ的
克隆及其表达分析
肖 政，李纪元，范正琪，殷恒福
（中国林业科学研究院亚热带林业研究所，浙江 富阳 ３１１４００）
收稿日期：２０１３０７１７
基金项目：国家“十二五”科技支撑计划课题（２０１２ＢＡ０１Ｂ０７０３）；国家国际科技合作项目（２０１１ＤＦＡ３０４９０）；浙江省花卉新品种选育重大
科技专项（２０１２Ｃ１２９０９－６）；浙江省省院合作林业科技项目（２０１２ＳＹ０２）
作者简介：肖 政（１９８４—），男，福建三明人，在读博士生，主要从事花卉分子育种研究
通讯作者：研究员，博士生导师．Ｅｍａｉｌ：ｊｉｙｕａｎ＿ｌｉ＠１２６．ｃｏｍ
摘要：根据植物肌动蛋白（Ａｃｔｉｎ）基因编码区的保守序列设计引物，以山茶属植物荔波连蕊茶幼嫩茎段为材料，提取
总ＲＮＡ，进行ＲＴＰＣＲ。采用ＲＡＣＥ技术扩增获得１６３１ｂｐ的Ａｃｔｉｎ基因全长ｃＤＮＡ序列，命名为ＣｌＡｃｔｉｎ１（ＧｅｎＢａｎｋ
登录号ＫＦ３６６９１２）。序列分析表明，ＣｌＡｃｔｉｎ１开放阅读框（ＯＲＦ）为１１３４ｂｐ，编码３７７个氨基酸，５’非编码区９０ｂｐ，
３’非编码区４０７ｂｐ。预测的ＣｌＡｃｔｉｎ１蛋白分子量为４１．６９ｋＤ，理论等电点为５．３１，具有 Ａｃｔｉｎ超基因家族的保守结
构域和肌动蛋白家族特有的特征信号序列。ＣｌＡｃｔｉｎ１与ＧｅｎＢａｎｋ中收录的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性
在８２％以上，氨基酸序列的相似性在９７％以上。与其它植物肌动蛋白比较并构建系统进化树，结果显示山茶肌动
蛋白与茶树和杨树的肌动蛋白的亲缘关系最为密切。实时荧光定量ＰＣＲ结果显示，该基因在荔波边蕊茶不同组织
器官及不同发育时期的表达量稳定，表明ＣｌＡｃｔｉｎ１基因可作为内参基因。
关键词：荔波连蕊茶；肌动蛋白基因；序列分析；克隆
中图分类号：Ｓ７１８．４６ 文献标识码：Ａ
ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＦｕｌＬｅｎｇｔｈｃＤＮＡｏｆＡｃｔｉｎ
ＧｅｎｅｆｒｏｍＣａｍｅｌｉａｌｉｐｏｅｎｓｉｓ
ＸＩＡＯＺｈｅｎｇ，ＬＩＪｉｙｕａｎ，ＦＡＮＺｈｅｎｇｑｉ，ＹＩＮＨｅｎｇｆｕ
（ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＳｕｂｔｒｏｐｉｃａｌＦｏｒｅｓｔｒｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，Ｆｕｙａｎｇ ３１１４００，Ｚｈｅｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｔｈｅａｃｔｉｎｇｅｎｅｗａｓｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍｔｈｅｓｔｅｍｓｏｆＣａｍｅｌｉａｌｉｐｏｅｎｓｉｓｕｓｉｎｇＲＴＰＣＲａｎｄＲＡＣＥ
ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｔｈｅｆｕｌｌｅｎｇｔｈｏｆｔｈｅａｃｔｉｎｇｅｎｅ，ｎａｍｅｄＣｌＡｃｔｉｎ１，ｗａｓ１６３１ｂｐ（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＫＦ３６６９１２），
ｗｈｉｃｈｃｏｎｔａｉｎｓａ１１３４ｂｐｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）ｅｎｃｏｄｉｎｇ３７７ａｍｉｎｏａｃｉｄｒｅｓｉｄｕｅｓ，ｃｏｎｔａｉｎｓａ５′ＵＴＲｗｉｔｈ
９０ｂｐａｎｄ３′ＵＴＲｗｉｔｈ４０７ｂｐ．Ｔｈｅｐｕｔａｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｉｓ４１．６９ｋＤａｎｄｉｔｓｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ
ｐｏｉｎｔｉｓ５．３１．Ｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎｃｌｕｄｅｓａｃｔｉｎｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙｄｏｍａｉｎａｎｄｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃａｃｔｉｎｆａｍｉｌｙｓｉｇｎａｔｕｒｅｓｅ
ｑｕｅｎｃｅｓ．Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｈｏｗｓｔｈａｔｉｔｓｈａｒｅｓｏｖｅｒ８２％ ｏｆｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓａｎｄｏｖｅｒ９７％ ｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄ
ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓｗｉｔｈａｃｔｉｎｓｆｒｏｍｏｔｈｅｒｐｌａｎｔｓｉｎＧｅｎＢａｎｋ．Ｔｈｅｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｏｎｔｈｅｂａｓｉｓｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅ
ｑｕｅｎｃｅｓｓｕｇｇｅｓｔｓｔｈａｔｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｏｆａｃｔｉｎｓｆｒｏｍＣ．ｌｉｐｏｅｎｓｉｓｉｓｍｏｓｔｉｎｔｉｍａｔｅｗｉｔｈｔｈａｔｆｒｏｍＣ．ｓｉｎｅｎｓｉｓａｎｄＰｏｐ
ｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｆｒｏｍｔｈｅａｎａｌｙｓｉｓｏｎｔｉｓｓｕｅｓｐｅｃｉｆｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓａｃｔｉｎｇｅｎｅｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｉｎｔｈｅｒｏｏｔ，ｓｔｅｍ，ｌｅａｆａｎｄｓｅｅｄｏｆＣ．ｌｉｐｏｅｎｓｉｓｉｓｉｄｅｎｔｉｃａｌ．Ｉｔｃａｎｂｅｓｅｒｖｅｄａｓｉｎｎｅｒｃｏｎｔｒｏｌｔｏｄｅｔｅｒ
ｍｉｎｅｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｍｏｕｎｔｏｆｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓｆｒｏｍＣａｍｅｌｉａｐｌａｎｔｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃａｍｅｌｉａｌｉｐｏｅｎｓｉｓ；ａｃｔｉｎｇｅｎｅ；ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ；ｃｌｏｎｉｎｇ
第３期 肖 政等：荔波连蕊茶肌动蛋白基因全长ｃＤＮＡ的克隆及其表达分析
植物肌动蛋白（Ａｃｔｉｎ）是真核生物细胞中普遍
存在的一种重要蛋白质，构成细胞骨架中的微丝系
统，参与细胞分裂、细胞运动、细胞空间形状维持、物
质运输等生命活动［１］。肌动蛋白在分子水平上还参
与其它重要的生理过程，如基因转录控制、信号转
导、ｍＲＮＡ加工和运输等［２］。由于肌动蛋白基因表
达水平受环境影响较小且在各生长阶段均持续表
达，被视为真核细胞生理过程中的看家基因，在对
基因的表达研究中被广泛用作分子内标［３］。
自从 １９６３年阎隆飞第一次从烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ
ｔａｂａｃｕｍＬ．）和南瓜（ＣｕｃｕｒｂｉｔａｍｏｓｃｈａｔａＤｕｃｈ．ｅｘ
Ｐｏｉｒｅｔ）的叶柄维管束中提取到肌动蛋白开始［４］，目
前已经有多种植物的肌动蛋白基因被发现，如毛果
杨（ＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａＴｏｒ＆Ｇｒａｙ）、拟南芥（Ａｒａｂｉ
ｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＨｅｙｎｈ）、水稻（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．）［５］、棉
花（ＧｏｓｙｐｉｕｍｈｉｒｓｕｔｕｍＬ．）［６］、白桦（Ｂｅｔｕｌａｐｌａｔｙｐｈｙｌ
ｌａＳｕｋ．）［７］、苎麻（ＢｏｅｈｍｅｒｉａｎｉｖｅａＧａｕｄ）［８］、甘草
（ＧｌｙｃｙｒｈｉｚａｕｒａｌｅｎｓｉｓＦｉｓｃｈ）［９］、结缕草（Ｚｏｙｓｉａｊａｐｏｎ
ｉｃａＳｔｅｕｄ）［１０］、桑树 （ＭｏｒｕｓａｌｂａＬ．）［１１］和角倍
（ＳｃｈｌｅｃｈｔｅｎｄａｌｉａｃｈｉｎｅｎｓｉｓＢｅｌ．）［１２］等。以植物肌动
蛋白为主形成的动态微丝骨架系统已成为植物细胞
生物学研究领域的热点之一［１３］。
山茶属（ＣａｍｅｌｉａＬ．）植物不仅具有重要的经济
利用价值，如茶饮、榨油、药用等，而且大多数种类具
有观赏价值［１４］。荔波连蕊茶（Ｃ．ｌｉｐｏｎｅｓｉｓＣｈａｎｇｅｔ
Ｘｕ）属山茶科（Ｔｈｅａｃｅａｅ）山茶属，为我国特有植物，
灌木至小乔木［１４］，树型美，花密、具芳香，是一种优
良景观树种，广泛应用于园林绿化。目前在山茶中
关于Ａｃｔｉｎ基因的研究还少见报道。本研究以荔波
连蕊茶的幼嫩茎段为材料，采用 ＲＴＰＣＲ和 ＲＡＣＥ
技术克隆出肌动蛋白的 ｃＤＮＡ基因全长（命名为
ＣｌＡｃｔｉｎ１），利用生物信息学方法对其序列进行分析，
并对该基因在植株不同组织器官及器官不同发育阶
段的表达特异性进行了初步研究，为下一步山茶肌
动蛋白基因的功能研究奠定基础。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
荔波连蕊茶种植于中国林业科学研究院亚热带
林业研究所山茶花种质苗圃。取当年抽生的幼嫩茎
段，液氮速冻后，置于－８０℃冰箱保存备用。
１．２ 总ＲＮＡ的提取
采用北京天恩泽基因科技有限公司柱式 ＲＮＡ
提取试剂盒提取总 ＲＮＡ，用 Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司
（美国）的 ＮａｎｏＤｒｏｐＮＤ２０００超微量核酸蛋白测定
仪测定ＲＮＡ浓度和纯度，用１．０％的变性琼脂糖凝
胶电泳检测ＲＮＡ质量，将 ＲＮＡ保存于 －８０℃冰箱
备用。
１．３ Ａｃｔｉｎ基因ｃＤＮＡ全长的克隆
根据ＧｅｎＢａｎｋ上已公布的 Ａｃｔｉｎ基因的 ｍＲＮＡ
序列信息，通过比对分析，查找Ａｃｔｉｎ基因保守区，用
Ｐｒｉｍｅｒ５．０软件设计正、反向引物 Ｐ１：ＣＡＣＧＧＴＡＴＴ
ＧＴＣＡＧＣＡＡＣＴＧＧＧＡＴＧＡＣ，Ｐ２： ＧＣＧＡＴＡＣＣＧＧＧ
ＧＡＡＣＡＴＡＧＴＴＧＡＡＣＣ，扩增获得该基因片段并测
序。根据这段序列信息，设计 ３’ＲＡＣＥ特异引物
ＧＳＰ１：ＴＧＴＧＣＴＧＧＡＴＴＣＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＴＧＡ，５’
ＲＡＣＥ 特 异 引 物 ＧＳＰ２： ＧＧＡＡＣＡＧＧＡＣＴ
ＴＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＧＡＡＴＣ。以新稍茎段的 ＲＮＡ为材
料，按照Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司（美国）的ＳＭＡＲＴＲＡＣＥ试剂
盒说明书进行 ３’ＲＡＣＥＰＣＲ和 ５’ＲＡＣＥＰＣＲ反
应，扩增出目的基因３’和５’端序列。ＰＣＲ产物用浓
度１．０％的琼脂糖凝胶电泳分析，利用 Ａｘｙｇｅｎ公司
（美国）的ＤＮＡ回收试剂盒回收纯化目的条带，连接
至ｐＧＥＭＴＥａｓｙ载体 ４℃过夜，转化大肠杆菌 Ｅ．
ＣｏｌｉＤＨ５感受态细胞，挑选阳性克隆送上海华大基
因测序。为保证测序的准确性，每次挑取２个独立
克隆进行双向测序。将测序结果与初步得到 Ａｃｔｉｎ
片段序列进行电子拼接，最终获得山茶 Ａｃｔｉｎ基因的
ｃＤＮＡ全长序列。
１．４ Ａｃｔｉｎ基因序列分析
利用ＮＣＢＩ提供的Ｂｌａｓｔ程序进行同源搜索和预
测保守结构域，ＯＲＦＦｉｎｄｅｒ查找 Ａｃｔｉｎ基因 ｃＤＮＡ开
放阅读框。用 ＰｒｏｔＰａｒａｍ软件（ｈｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．
ｏｒｇ／ｃｇｉｂｉｎ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ）计算蛋白质的相对
分子量，理论等电点和稳定性［１５］。用 ＳｉｇｎａｌＰ（ｈｔ
ｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ）进行信号
肽预测［１６］；利用 ＨＮＮ软件（ｈｔｐ：／／ｎｐｓａｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．
ｆｒ／ｃｇｉｂｉｎ／ｓｅｃｐｒｅｄ＿ｈｎｎ．ｐｌ）进行二级结构分析［１７］，
用ＭＥＧ４软件构建进化树［１８］。
１．５ Ａｃｔｉｎ基因在植株中的荧光定量表达分析
分别采集荔波连蕊茶的新稍顶端茎段、新稍顶
端第１、２片嫩叶及成熟叶片、２年生茎段、根和种
子，用北京天恩泽基因科技有限公司柱式 ＲＮＡ提取
试剂盒提取总ＲＮＡ。取１μｇ总ＲＮＡ，用ＴａＫａＲａ公
司（日本）的荧光定量反转录试剂盒获得 ｃＤＮＡ。根
据获得的 Ａｃｔｉｎ基因序列，按照荧光定量引物要求，
５７３
林 业 科 学 研 究 第２７卷
设计一对引物 ＡＰ１：ＣＣＧＴＴＧＣＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＴＧ和
ＡＰ２：ＣＡＣＡＡＴＧＴＴＧＣＣＡＴＡＧＡＧＧＴＣＣ。反 应 在
ＡＢＩ７３００实时荧光定量 ＰＣＲ仪上进行，采用 ＳＹＢＲ
ＧｒｅｅｎⅠ染料法，按照 ＴａＫａＲａ公司的 ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴＰＣＲ试剂盒说明进行实时荧光定量
ＰＣＲ反应。ＰＣＲ反应条件为：９５℃预变性３０ｓ，接着
进行４０个循环，每个循环采用两步法：９５℃变性
５ｓ，６０℃延伸３１ｓ。每个样本设３个平行重复试验。
试验数据用 ＡＢＩ７３００实时荧光定量 ＰＣＲ系统软件
和Ｅｘｃｅｌ２００３软件进行分析。
２ 结果与分析
２．１ 荔波连蕊茶茎段总ＲＮＡ提取
将提取的荔波连蕊茶茎段总 ＲＮＡ进行电泳检
测，电泳显示２８ＳｒＲＮＡ和１８ＳｒＲＮＡ条带清晰，浓度
比约为２：１（图１），说明提取的ＲＮＡ完整性较好，能
够满足后续试验的要求。
图１ 荔波连蕊茶茎段总ＲＮＡ提取
２．２ Ａｃｔｉｎ基因ｃＤＮＡ全长的克隆
采用同源克隆方法，从荔波连蕊茶中得到一个
长为７１３ｂｐ目的ｃＤＮＡ片段（图２）。根据此片段设
计ＲＡＣＥ特异引物ＧＳＰ１和ＧＳＰ２，ＰＣＲ扩增得到３’
端序列和５’端序列。将测序得到的中间片段、５’端
序列和３’端序列进行电子拼接，得到全长为１６３１
ｂｐ的ｃＤＮＡ。
用ＯＲＦ软件对该序列进行分析，５′端（５′ＵＴＲ）
有９０ｂｐ的非编码区，３′端（３′ＵＴＲ）有４０７ｂｐ的非
编码区，序列末端含有ｐｏｌｙ（Ａ）结构，开放阅读框长
１１３４ｂｐ，编码３７７个氨基酸（图３）。在起始密码子
ＡＴＧ上游３位核苷酸为 Ａ，＋４位为 Ｇ，这一典型的
ＫｏｚａＫ结构对于蛋白质合成的４０Ｓ起始复合物正确
Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ２０００；１：Ａｃｔｉｎ基因特异片段；３：３’端扩增
序列；５：５’端扩增序列
图２ 荔波连蕊茶Ａｃｔｉｎ基因扩增电泳图
识别启动密码子具有重要的作用；在终止密码子后
可见２１ｂｐ的ＰｏｌｙＡ尾。ＣｌＡｃｔｉｎ１基因已在ＧｅｎＢａｎｋ
登录，登录号为ＫＦ３６６９１２。
２．３ Ａｃｔｉｎ蛋白结构分析
ＣｌＡｃｔｉｎ１基因通过ＰｒｏｔＰａｒａｍ软件预测蛋白分子
量为４１．６９ｋＤ，理论等电点（ＰＩ）为５．３１，酸性氨基
酸残基总数（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）为５０，碱性氨基酸残基总数
（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）为３８，分子式为 Ｃ１８５２Ｈ２９２０Ｎ４９２Ｏ５５９Ｓ２１，不
稳定系数为３６．８６，表明该蛋白为稳定蛋白。Ｐｒｏｓｉｔｅ
软件分析显示，该序列具有肌动蛋白的特征信号序
列ＹＶＧＤＥＡＱｓ．ＫＲＧ（５５ ６５）、ＷＩＳＫｇＥＹＤＥ（３５８
３６６），及肌动蛋白和肌动蛋白类似蛋白的特征序列
ＬＬＴＥＡＰＬＮＰＫＡＮＲ（１０６ １１８）（图３）。利用 ＮＣＢＩ
ＣｏｎｓｅｒｖｅｄＤｏｍａｉｎＳｅａｒｃｈ进行保守域分析，发现
ＣｌＡｃｔｉｎ１基因编码的蛋白属于Ａｃｔｉｎ超家族。
二级结构预测结果表明，ＣｌＡｃｔｉｎ１蛋白主要以
无规则卷曲为主，占 ４６．４２％；其次为 α螺旋，占
３２．１０％；延伸链占 ２１．４９％，无 β转角分布。Ｓｉｇ
ｎａｌＰ４．１软件分析荔波连蕊茶 ＣｌＡｃｔｉｎ１蛋白的信号
肽序列，发现荔波连蕊茶 ＣｌＡｃｔｉｎ１蛋白没有信号肽
及其剪切位点，是非分泌型蛋白。蛋白质的功能很
大程度上取决于其空间结构，其中 α螺旋主要对蛋
白质骨架起到稳定作用，而无规则卷曲结构决定了
蛋白质的功能，特别是酶的功能部位常位于这种区
域中。ＣｌＡｃｔｉｎ１蛋白的无规则卷曲结构占了
４６．４２％，表明该基因在荔波连蕊茶生长发育中具有
重要功能。
２．４ Ａｃｔｉｎ基因编码的氨基酸序列同源性及系统进
化分析
利用 ＮＣＢＩ网站的在线 Ｂｌａｓｔ分析 ＣｌＡｃｔｉｎ１序
列，结果表明，该基因与其它植物的肌动蛋白基因高
６７３
第３期 肖 政等：荔波连蕊茶肌动蛋白基因全长ｃＤＮＡ的克隆及其表达分析
注：数字代表核苷酸的个数；下划线依次分别表示起始密码子和终止密码子。
图３ ＣｌＡｃｔｉｎ１基因全长序列及预测的氨基酸序列
度同源，核苷酸相似性在８２％以上，其中与茶树（Ｃ．
ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｌ．）Ｏ．Ｋｕｎｔｚｅ）肌动蛋白的相似性达到
９８％，与葡萄（ＶｉｔｉｓｖｉｎｉｆｅｒａＬ．）肌动蛋白的相似性达
到９１％，与毛果杨Ａｃｔｉｎ１的相似性达到８８％。
将 ＣｌＡｃｔｉｎ１基因编码的氨基酸序列与 ＮＣＢＩ数
据库的 Ａｃｔｉｎ蛋白氨基酸序列进行比对分析。不
同植物的 Ａｃｔｉｎ蛋白氨基酸序列相似性很高（图
４），达到９７％以上。选取相似性较高的１２种植物
的Ａｃｔｉｎ蛋白氨基酸序列与ＣｌＡｃｔｉｎ１蛋白氨基酸序
列进行比较分析，用相邻连接法绘制进化树。由图
５可见，ＣｌＡｃｔｉｎ１蛋白与茶树、毛果杨、黄瓜（Ｃｕｃｕ
ｍｉｓｓａｔｉｖｕｓＬ．）和葡萄的 Ａｃｔｉｎ蛋白聚为一类，其中
与茶树的亲缘关系最近。通过以上生物信息学分
析，初步确定实验获得荔波连蕊茶的全长肌动蛋白
基因。
２．５ Ａｃｔｉｎ基因在植株不同组织器官及不同发育时
期的表达特性分析
采用实时荧光定量 ＰＣＲ的方法对荔波连蕊茶
不同组织器官及不同发育时期 ＣｌＡｃｔｉｎ１基因的表达
进行了检测。从图６可以看出，ＣｌＡｃｔｉｎ１基因在植株
的各器官中均有表达，由于表达量与ＣＴ值成反比例
关系，其在种子中的表达量最高，在成熟叶片中表达
量最低，在根、幼嫩茎段、２年生茎段和嫩叶中表达
量基本一致。据此推断，ＣｌＡｃｔｉｎ１为组成型表达的肌
动蛋白基因。
３ 讨论
本研究从荔波连蕊茶获得的 ＣｌＡｃｔｉｎ１基因具有
７７３
林 业 科 学 研 究 第２７卷
注：数字代表氨基酸的个数。
图４ ＣｌＡｃｔｉｎ１蛋白与其它植物Ａｃｔｉｎ蛋白氨基酸序列多重比较
肌动蛋白家族特有的特征序列，通过与 ＮＣＢＩ已登
录的其它植物Ａｃｔｉｎ序列比对，核苷酸的同源性达到
８２％以上，蛋白氨基酸序列的相似性达到 ９７％以
上。生物信息学分析表明试验得到的 ＣｌＡｃｔｉｎ１基因
是肌动蛋白基因。
植物肌动蛋白具有高度保守性，一般由 ３７５
３７７个氨基酸残基组成［１９］，Ｈｉｇｈｔｏｗｅｒ等认为植物肌
动蛋白起源于同一个祖先［２０］。将 ＣｌＡｃｔｉｎ１与１２种
植物的肌动蛋白进行序列比对，结果显示荔波连蕊
茶与这些植物的肌动蛋白核苷酸和氨基酸序列高度
同源，只存在少数差异，说明植物的肌动蛋白基因具
有高度的保守性。植物肌动蛋白的核苷酸替换率约
为每亿年１％［２１］。肌动蛋白的高度保守性与其在植
物中的重要功能是密切相关的。肌动蛋白构成细胞
骨架中的微丝系统，参与细胞的有丝分裂、减数分
裂、染色体运动、细胞器运动、胞质流动、顶体运动等
生命活动，在生长、发育、授精等过程中起着重要
作用［１９］。
由于肌动蛋白基因在进化上的保守性，常被用
于物种进化分析，鉴别不同物种间的亲缘关系［２２］。
荔波连蕊茶肌动蛋白与其它１２种植物肌动蛋白构
建的系统进化树显示，荔波连蕊茶与茶树亲缘关系
８７３
第３期 肖 政等：荔波连蕊茶肌动蛋白基因全长ｃＤＮＡ的克隆及其表达分析
注：蜀黍（Ｓｏｒｇｈｕｍｂｉｃｏｌｏｒ（Ｌ．）Ｍｏｅｎｃｈ）；玉米（ＺｅａｍａｙｓＬ．）；草莓（ＦｒａｇａｒｉａｖｅｓｃａＬ．）；番茄（Ｓｏｌａｎｕｍｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ
Ｌ．）；黄豆（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒ．）。括号中代码为该物种Ａｃｔｉｎ蛋白氨基酸序列的ＧｅｎＢａｎｋ登录号。
图５ ＣｌＡｃｔｉｎ１蛋白与其它植物Ａｃｔｉｎ蛋白氨基酸序列的进化树分析
图６ ＣｌＡｃｔｉｎ１基因在植株不同器官及不同
发育时期的表达量
最近，其次与毛果杨、黄瓜和葡萄的亲缘关系较近。
其中单子叶植物玉米和蜀黍聚为一类，其它双子叶
植物聚为另一类，说明肌动蛋白基因的分化可能早
于单子叶和双子叶植物的分化，是由一个共同祖先
进化而来。根据肌动蛋白序列构建系统进化树，虽
然由于目前所获得的植物肌动蛋白序列数量的限
制，还无法对物种作出较全面的分类，但是可以为物
种的系统分类提供新的参考。
高等植物肌动蛋白基因同动物肌动蛋白基因一
样，属于多基因家族，其基因是多拷贝的［２３］，如拟南
芥肌动蛋白基因在２０个以上，杨树（Ｐｏｐｕｌｕｓｓｐｐ．）
肌动蛋白基因至少２２个，水稻肌动蛋白基因也不少
于１８个［５］。高等植物的肌动蛋白基因至少编码两
类古老的不同类型的肌动蛋白，即营养型和生殖
型［２４］。营养型基因在所有的营养器官和细胞类型
中组成型表达，而生殖型基因主要在成熟花粉、生长
的花粉管或者胚珠中表达［２５］。实时荧光定量 ＰＣＲ
实验结果表明，ＣｌＡｃｔｉｎ１基因在荔波连蕊茶不同组织
器官及器官不同发育时期均有表达，表达量相对稳
定，属于营养型肌动蛋白基因。获得荔波连蕊茶肌
动蛋白基因全长序列，不仅为下一步山茶肌动蛋白
基因的功能研究奠定基础，也为研究山茶其它基因
的表达调控提供了参考。
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