全 文 ：林业科学研究 ２０１６，２９（２）：２３４ ２３７
ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ
文章编号：１００１１４９８（２０１６）０２０２３４０４
大花蕙兰转齿兰环斑病毒外壳蛋白基因及检测
彭 博１，魏 莉２，杨 凯３，李潞滨１
（１．中国林业科学研究院林业研究所，林木遗传育种国家重点实验室，北京 １０００９１；
２．邯郸市环境监测中心站，河北 邯郸 ０５６００２；３．北京农学院农业应用新技术北京市重点实验室，北京 １０２２０６）
收稿日期：２０１５０２０２
基金项目：中国特色花卉种业关键技术研究（２０１２ＢＡＤ０１Ｂ０７）
作者简介：彭 博（１９８８—），女，河北石家庄人，在读硕士研究生．主要研究方向：园林植物与观赏园艺．Ｅｍａｉｌ：ｐｅｎｇｂｏ０６２１＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者：李潞滨，博士生导师，研究员．主要研究方向：园林植物与观赏园艺．Ｅｍａｉｌ：ｌｉｌｕｂｉｎ＠１２６．ｃｏｍ；杨凯，博士，副教授．主要研
究方向：植物分子生物学．Ｅｍａｉｌ：ｙａｎｇｋａｉ８９７８＠１２６．ｃｏｍ
摘要：［目的］通过植物转基因技术获得抗病毒大花蕙兰种质资源，优化转化体系和鉴定方法。［方法］本研究克隆
了齿兰环斑病毒外壳蛋白基因，并构建了该基因的ｐＢＩ１２１表达载体，用根癌农杆菌介导法转化大花蕙兰，尝试以巢
式ＰＣＲ方法检测转基因再生植株。［结果］优化了大花蕙兰遗传转化体系，建立了利用巢式 ＰＣＲ技术检测转基因
大花蕙兰植株的方法，获得了３２株转基因株（系）。［结论］优化了以类原球茎为外植体的农杆菌介导转化大花蕙
兰的方法，确定以５％ １０％类原球茎存活时的抗生素（卡那霉素）浓度为筛选浓度；获得了转 ＯＲＳＶＣＰ基因大花
蕙兰植株；对大花蕙兰转基因植株检测时，巢式ＰＣＲ较普通ＰＣＲ更灵敏、准确。
关键词：大花蕙兰；齿兰环斑病毒；外壳蛋白基因；转基因；巢式ＰＣＲ
中图分类号：Ｓ４３２ 文献标识码：Ａ
ＧｅｎｅｔｉｃＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅＣｙｍｂｉｄｉｕｍｈｙｂｒｉｄｕｍＭｏｄｉｆｉｅｄｂｙ
ＣｏａｔＰｒｏｔｅｉｎＧｅｎｅｏｆＯＲＳＶ
ＰＥＮＧＢｏ１，ＷＥＩＬｉ２，ＹＡＮＧＫａｉ３，ＬＩＬｕｂｉｎ１
（１．ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＴｒｅｅＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇ，ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９１，Ｃｈｉｎａ；
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ＮｅｗＴｅｃｈｎｉｑｕｅ，ＢｅｉｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０２２０６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］Ｔｏｏｐｔｉｍｉｚｅｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｏｂｔａｉｎｉｎｇｔｈｅｇｅｒｍｐｌａｓｍ
ｒｅｓｏｕｒｃｅｓｏｆａｎｔｉｖｉｒｕｓＣｙｍｂｉｄｉｕｍｈｙｂｒｉｄｕｍｂｙｐｌａｎｔｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．［Ｍｅｔｈｏｄ］Ｔｈｅｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅ（ＣＰ）
ｏｆＯＲＳＶｗａｓｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍｔｈｅｃＤＮＡｏｆｉｎｆｅｃｔｅｄＣ．ｈｙｂｒｉｄｕｍ．Ａｆｔｅｒｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｔｈｅｇｅｎｅｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｉｎｔｏ
ｐＢＩ１２１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｔｏｔｈｅｐｒｏｔｏｃｏｒｍｌｉｋｅｂｏｄｉｅｓ（ＰＬＢｓ）ｏｆＣ．ｈｙｂｒｉｄｕｍｂｙＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕ
ｍｅｆａｃｉｅｎｓｍｅｄｉａｔｅｄｍｅｔｈｏｄ．［Ｒｅｓｕｌｔ］Ｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗａｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄａｎｄｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈ
ｏｄｏｆｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙｎｅｓｔｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＮｅｓｔＰＣＲ）．Ｔｈｅｒｅｗｅｒｅ３２ｔｒａｎｓｇｅｎ
ｉｃｐｌａｎｔｓｏｆＣ．ｈｙｂｒｉｄｕｍｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＮｅｓｔＰＣＲ．［Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ］ＴｈｅＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａ
ｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｏｆＣ．ｈｙｂｒｉｄｕｍｗａｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄｕｓｉｎｇＰＬＢｓａｓｅｘｐｌａｎｔｓ．Ｔｈｅａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｃｏｎｃｅｎｔｒａ
ｔｉｏｎｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄａｓ５％ ｔｏ１０％ ＰＬＢｓｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅ．ＵｓｉｎｇｔｈｅＮｅｓｔＰＣＲｔｏｄｅｔｅｃｔｅｄｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｗａｓ
ｍｏｒｅｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄａｃｃｕｒａｔｅｔｈａｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌＰＣＲ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍｈｙｂｒｉｄｕｍ；Ｏｄｏｎｔｏｇｌｏｓｕｍｒｉｎｇｓｐｏｔｖｉｒｕｓ；ｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅ；ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ；ＮｅｓｔＰＣＲ
大花蕙兰（Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍｈｙｂｒｉｄｕｍ）是以兰科兰属
植物为亲本，通过杂交育种培育形成的品种群，为五
大盆栽兰花［１］和重要的切花种类之一［２］。世界兰花
花卉的栽培和生产受病毒危害相当严重，其中，齿兰
第２期 彭 博，等：大花蕙兰转齿兰环斑病毒外壳蛋白基因及检测
环斑病毒（Ｏｄｏｎｔｏｇｌｏｓｕｍｒｉｎｇｓｐｏｔｖｉｒｕｓ，ＯＲＳＶ）是分
布最广、危害最严重的病毒之一［３－４］，可导致植株生
长不良，花期缩短，开花质量和数量下降［５］，严重影
响花卉的观赏价值，制约了产业的发展。目前，国内
外尚无抗该病毒的兰花资源和有效防治药剂。生产
上采用的主要手段是茎尖脱毒技术，但存在脱毒率
低、易重新感染等缺点。由于兰花抗病毒种质资源
的匾乏，育种周期漫长，导致兰花抗病毒育种一直处
于停滞状态，基因工程技术的应用为其开辟了一条
新的道路。
近年来，随着植物分子病理学的发展，根据病毒
的交叉保护机制，在烟草（ＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＬｉｎｎ．）
等多种植物中将病毒外壳蛋白基因转入植物基因组
并使其成功获得病毒抗性［６－８］。兰科植物的抗病毒
研究也有报道，但大花蕙兰的相关研究则较少。转
基因技术不仅可用于兰花抗病毒种质创新，为杂交
育种提供种质资源；还可用于兰花品种改良，使改良
品种更具有市场竞争力，提高其商业价值，是培育兰
花抗病毒品种的有效方法和技术。本研究在克隆
ＯＲＳＶ病毒外壳蛋白（ｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＰ）基因的基础
上，采用农杆菌介导方式转化大花蕙兰，获得大花蕙
兰转ＯＲＳＶ病毒外壳蛋白基因植株，为兰花转基因
抗病育种提供重要的技术参考，并创制了新的兰花
抗病毒种质资源。
１ 材料与方法
１．１ 材料
大花蕙兰品种（Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍｓｐ．）类原球茎由中
国林业科学研究院林业所花卉中心提供。
类原球茎增殖和分化采用附加不同浓度植物激
素的ＭＳ改良培养基。
于中国林业科学研究院实验温室采集感染齿兰
环斑病毒（ＯＲＳＶ）的大花蕙兰幼叶，于 －８０℃保存
备用。
农杆菌菌株ＬＢＡ４４０４由本实验室提供。
１．２ 方法
１．２．１ ＯＲＳＶ病毒外壳蛋白基因的克隆 采用Ｔｒ
ｉｚｏｌ法提取总ＲＮＡ［９］；按Ｐｒｏｍｅｇａ试剂盒说明书合成
ｃＤＮＡ的第一链。根据 ＧｅｎＢａｎｋ齿兰环斑病毒外壳
蛋白基因序列（ＤＱ９１５４４０．１）和 ｐＢＩ１２１载体序列
（ＡＦ４８５７８３．１）设计引物，正、反向引物中分别引入载
体构建酶切位点ＢａｍＨＩ和ＳｍａＩ，引物序列见表１。
以上述合成的 ｃＤＮＡ第一链为模板，ＰＣＲ扩增
ＯＲＳＶＣＰ基因，反应体系：模板ＤＮＡ５０ｎｇ，１０×ＰＣＲ
Ｂｕｆｅｒ２．５μＬ，ＰｒｉｍｅｒＦ（１０μｍｏｌ·Ｌ－１）０．５μＬ，
ＰｒｉｍｅｒＲ（１０μｍｏｌ·Ｌ－１）０．５μＬ，ｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ·
Ｌ－１）１．５μＬ，ｒＴａｑ酶 ０．２μＬ，ｄｄＨ２Ｏ补足至２５μＬ。
扩增程序：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，（Ｔｍ４）℃３０
ｓ，７２℃ ４５ｓ，３０个循环；７２℃延伸 １０ｍｉｎ。根据
ＴａｋａＲａ公司ｐＭＤ１８Ｔ试剂盒说明克隆ＰＣＲ产物，挑
取单菌落用分步酶切连接的方法构建ｐＢＩ１２１ＯＲＳＶＣＰ
表达 载 体。经 测 序 检 验 正 确 后，转 化 农 杆
菌ＬＢＡ４４０４。
１．２．２ 农杆菌介导的大花蕙兰遗传转化
１．２．２．１ 选择培养基抗生素筛选浓度的确定 以继
代培养３０ｄ的大花蕙兰类原球茎为材料，在超净台
中，按其生长方式用镊子分离，接种于卡那霉素浓度
分别为０．０、１２．５、２５．０、３７．５、５０．０ｍｇ·Ｌ－１的选择培
养基中，每个浓度接种 ６０个类原球茎。于（２５±
１）℃，光强１２００ １５００ｌｘ，光周期１４ｈ·ｄ－１条件
下，筛选培养９０ｄ，统计类原球茎的存活率，确定卡那
霉素筛选浓度。
１．２．２．２ 大花蕙兰的转化 挑取含有植物表达载体
ｐＢＩ１２１ＯＲＳＶＣＰ的农杆菌 ＬＢＡ４４０４单菌落，接种于
ＹＥＢ液体培养基中，２８℃２２０ｒ·ｍｉｎ－１振荡培养至对
数期；离心收集菌体，然后用１／２ＭＳ液体培养基重悬
菌体，使菌液的ＯＤ６００＝０．１５，以备侵染使用。用农杆
菌ＬＢＡ４４０４侵染继代培养３０ｄ的大花蕙兰类原球
茎。将生长状态良好的类原球茎在农杆菌菌液中浸
泡２５ｍｉｎ，用无菌滤纸吸干类原球茎上的菌液，转入
共培养培养基，２６℃暗培养５ｄ后转接到选择培养基
中培养［９］；９０ｄ后，将再生的类原球茎单独转接到分
化培养基中培养成株。于温室中开盖炼苗３ ５ｄ后
移植，温室中高温为２５ ２８℃，低温为１５ １８℃。
１．２．３ 转基因植株的鉴定
１．２．３．１ 普通ＰＣＲ 正、反向引物分别设计在载体
的ＣａＭＶ３５Ｓ启动子和 ＯＲＳＶＣＰ基因内部，引物序
列见表１。普通 ＰＣＲ扩增体系、程序如１．２．１，扩增
产物电泳检测并测序。
１．２．３．２ 巢式ＰＣＲ 在ＣａＭＶ３５Ｓ启动子和目的基
因区域分别设计一组内、外２条特异性的引物，引物
序列见表１。以外侧引物（３５Ｓ２１３Ｆ／ＯＲＳＶ３３２Ｒ）进行
第１步巢式ＰＣＲ扩增，取１μＬ扩增产物作为模板，
以内侧引物（３５Ｓ３３０Ｆ／ＯＲＳＶ１９３Ｒ）进行第２步 ＰＣＲ
扩增，反应体系、程序参照１．２．１所述方法，扩增产
物电泳检测并测序。
５３２
林 业 科 学 研 究 第２９卷
表１ 引物序列
ＰＣＲ方法 引物编号 引物序列 退火温度／℃
ＣＰ基因克隆ＰＣＲ
ＯＲＳＶ１ＦＢａｍＨＩ ５’ＣＴＧＧＣＴＣＣＡＴＧＴＣＴＴＡＣＡＣＴＡＴＴＡＣＡＧＡＣ３’ ５６
ＯＲＳＶ４７７ＲＳｍａＩ ５’ＣＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＧＧＡＡＧＡＧＧＴＣＣＡＡＧＴＡＡ３’ ５６
普通ＰＣＲ
３５Ｓ６９７Ｆ ５’ＡＧＡＣＧＴＴＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＴＴ３’ ６０
ＯＲＳＶ４５７Ｒ ５’ＡＧＴＣＣＡＧＡＣＡＴＣＧＴＣＴＣＡＡＡＴ３’ ６０
３５Ｓ２１３Ｆ ５’ＣＣＡＧＴＡＴＧＧＡＣＧＡＴＴＣＡＡＧＧ３’ ６０
巢式ＰＣＲ
３５Ｓ３３０Ｆ ５’ＧＡＣＣＴＡＡＣＡＧＡＡＣＴＣＧＣＣＧＴ３’ ６２
ＯＲＳＶ１９３Ｒ ５’ＣＡＧＧＧＡＡＣＣＴＡＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧ３’ ６４
ＯＲＳＶ３３２Ｒ ５’ＣＡＴＣＴＡＡＴＧＴＴＴＣＣＧＴＡＧＴＴＧＴ３’ ６０
注：表中Ｆ表示正向引物，Ｒ表示反向引物；脚标数字为引物在基因中的碱基位置；下划线处为酶切位点。
１．２．３．３ ２种 ＰＣＲ方法的灵敏度检测 将初始浓
度为５０ｎｇ·μＬ－１的 ｐＢＩ１２１ＯＲＳＶＣＰ质粒依１０倍比
稀释，得到１．０×１０－１ １．０×１０－１２共１２个稀释梯
度，取１μＬ各稀释梯度的质粒为模板进行检测，扩
增、检测方法如上述。
１．２．３．４ 转基因植株基因组ＤＮＡ提取 采集温室
栽培３ａ的转基因大花蕙兰嫩叶，用ＣＴＡＢ法提取基
因组ＤＮＡ［１０］，－２０℃保存备用。
１．２．３．５ 转基因大花蕙兰 ＰＣＲ产物的测序 以转
基因大花蕙兰基因组 ＤＮＡ为模板，用普通 ＰＣＲ和
巢式ＰＣＲ进行扩增检验，ＰＣＲ产物经电泳检测后，
由北京宝锐通生物科技公司进行测序分析。
２ 结果与分析
２．１ ＯＲＳＶ病毒外壳蛋白基因的克隆及工程菌的
获得
以染毒大花蕙兰叶片反转录ｃＤＮＡ为模版进行
ＰＣＲ扩增，获得的扩增产物经纯化、克隆后测序。测
序结果表明：片段长 ４７７ｂｐ，经 Ｂｌａｓｔ比对分析，与
ＧｅｎＢａｎｋ中的齿兰环斑病毒外壳蛋白基因序列
（ＤＱ９１５４４０．１）的相似性为９９％，可确定扩增产物为
目的基因。
目的基因经酶切、连接得到重组植物表达载体
ｐＢＩ１２１ＯＲＳＶＣＰ，经测序验证后，转化农杆菌 ＬＢＡ４４０４
获得转基因工程菌。
２．２ 农杆菌介导转化大花蕙兰
２．２．１ 选择培养基抗生素筛选浓度的确定 经统
计，接种于卡那霉素浓度为０．０、１２．５、２５．０、３７．５、５０．０
ｍｇ·Ｌ－１的类原球茎存活率分别为１００．０％、８５．３％、
７．６％、０．０％、０．０％。将存活率为５％ １０％的卡那
霉素浓度确定为筛选浓度（２５．０ｍｇ·Ｌ－１）。
２．２．２ ＯＲＳＶＣＰ基因的农杆菌介导转化 用农杆
菌介导法转化大花蕙兰类原球茎，经暗培养后转入含
有２５．０ｍｇ·Ｌ－１卡那霉素和２５０ｍｇ·Ｌ－１Ｃｅｆ的选择
培养基。经过９０ｄ筛选培养，将每一再生类原球茎单
独转入分化培养基，培养成苗。共转化类原球茎７８０
个，出苗１７４株（系），植株转化率为２２．３％。
２．３ 检验方法灵敏度的检测
将ｐＢＩ１２１ＯＲＳＶＣＰ质粒模板按１．０×１０
－１ １．０
×１０－１２的稀释梯度进行稀释，用普通 ＰＣＲ和巢式
ＰＣＲ检验。发现普通ＰＣＲ最低可检测出１．０×１０－５
稀释梯度的质粒模板，扩增产物电泳检测条带亮度
随模板稀释度的降低而降低，质粒模板的普通 ＰＣＲ
最低检出限为５．０×１０－４ｎｇ·μＬ－１。巢式 ＰＣＲ检
测时，稀释梯度为１．０×１０－９的质粒模板未扩增出条
带，巢式 ＰＣＲ最低检出限为５．０×１０－７ｎｇ·μＬ－１，
如图１所示。
Ａ：质粒ｐＢＩ１２１ＯＲＳＶＣＰ的ＰＣＲ灵敏性检测；Ｂ：质粒 ｐＢＩ１２１ＯＲＳＶ
ＣＰ的巢式ＰＣＲ灵敏性检测。图 Ａ中 Ｍ：１００ｂｐＬａｄｄｅｒ；１ ６
为质粒ｐＢＩ１２１ＯＲＳＶＣＰ的稀释梯度，依次为１．０×１０－１ １．０×
１０－６；图Ｂ中Ｍ：ＤＬ２０００；１ ８为质粒 ｐＢＩ１２１ＯＲＳＶＣＰ的稀释
梯度，依次为１．０×１０－２ １．０×１０－９
图１ 普通ＰＣＲ与巢式ＰＣＲ的灵敏性比较
２．４ 转基因植株的检测
转基因大花蕙兰植株瓶苗经壮苗后移植至温室，
３ａ后对存活的１５４株转基因大花蕙兰株（系）进行检
测，普通ＰＣＲ的扩增片段经测序检验序列正确，序列
长度为５９４ｂｐ，共检测出阳性的转基因株（系）１５株，
阳性检出率为９．７４％；ＮｅｓｔＰＣＲ的扩增片段经测序
检验序列正确，序列长度为６９８ｂｐ，共检测出３２株阳
性转基因株（系），其中包括所有普通ＰＣＲ检测为阳
性的株（系），阳性检出率为２０．７８％（图２）。
６３２
第２期 彭 博，等：大花蕙兰转齿兰环斑病毒外壳蛋白基因及检测
Ａ：转ＯＲＳＶＣＰ基因大花蕙兰植株普通 ＰＣＲ鉴定；Ｂ：转 ＯＲＳＶ
ＣＰ基因大花蕙兰植株巢式 ＰＣＲ鉴定。Ａ、Ｂ：１～２０为转 ＯＲＳＶ
ＣＰ基因大花蕙兰植株样品；Ｍ：１００ｂｐＬａｄｄｅｒ
图２ 转基因大花蕙兰的普通ＰＣＲ与巢式ＰＣＲ鉴定
３ 讨论
在兰科植物中，利用病毒外壳蛋白基因介导的抗
病毒研究已有报道。２００４年，台湾Ｌｉａｏ等［１１］和Ｃｈａｎ
等［１２］将ＣｙｍＭＶＣＰ基因转入蝴蝶兰中得到抗病性的
蝴蝶兰植株，并初步证明其抗病性是由 ｓｉＲＮＡ介导
的；而在大花蕙兰中进行的病毒外壳蛋白基因介导的
抗病毒研究少有报道。本研究在克隆ＯＲＳＶＣＰ基因
的基础上，利用农杆菌介导转化大花蕙兰。据本课题
组相关研究发现，转基因兰花中以类原球茎为外植
体，以半致死量抗生素浓度筛选获得再生植株，由于
类原球茎自身结构和分化特征导致嵌合体过多，阳性
的转基因幼苗（瓶苗）在养育２ ３ａ后再检验时多为
阴性（另文发表），致使转基因兰花工作在养育转基因
幼苗和再检测上投入的精力很大，使转基因兰花种质
创新周期延长、效率降低。为解决这一问题，本课题
组在２０１０年开始选用全致死量抗生素浓度为选择培
养浓度，虽然一定程度上减少了嵌合体的数量，但得
到的抗性材料较少。经过摸索，目前选用类原球茎存
活率为５％ １０％时的抗生素筛选浓度（２５．０ｍｇ·
Ｌ－１），得到了合适的共培养时间与分化培养基；３ａ后
获得的转基因大花蕙兰植株株（系）中约有２０％为阳
性转基因株（系）。
由于转病毒ＣＰ基因植株和被该病毒侵染的植
株体内都存在病毒 ＣＰ基因，均可用基于 ＰＣＲ技术
的方法检验病毒外壳蛋白基因，所以检测转基因植
株时必需确定目的基因是人为转入而非病毒侵染所
致。本研究设计检测引物时将 ＰＣＲ正向引物设计
在载体ＣａＭＶ３５Ｓ启动子区域内，并将反向引物设计
在目的基因区域内，排除了病毒侵染致使植物体内
存在病毒ＣＰ基因而产生的假阳性，确保了检测得到
的阳性植株为转 ＣＰ基因植株。此外，对普通 ＰＣＲ
和巢式ＰＣＲ灵敏度进行了比较，巢式ＰＣＲ灵敏度比
普通ＰＣＲ高１０００倍。巢式 ＰＣＲ通过２套引物对
有限的ＤＮＡ模板进行２轮ＰＣＲ扩增，能够很大程度
地提高对靶ＤＮＡ的特异性和灵敏度，降低了扩增出
错误片段的比例［１３－１５］，减少假阳性的出现，其灵敏
度和特异性均高于普通ＰＣＲ。
４ 结论
本研究优化了以类原球茎为外植体的农杆菌介
导转化大花蕙兰的方法，确定以５％ １０％类原球
茎存活时的抗生素（卡那霉素）浓度为筛选浓度；获
得了转ＯＲＳＶＣＰ基因大花蕙兰植株；对大花蕙兰转
基因植株检测时，巢式 ＰＣＲ比普通 ＰＣＲ更灵敏、准
确。本研究为大花蕙兰转基因的研究提供了必要的
技术准备和尝试，为今后的工作奠定了基础。
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ｇｅｎｅ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８６，２３２：７３８－７４３．
［７］ＲｕｂｉｎｏＬ，ＣａｐｒｉｏｔｉＧ．ＲｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏＣｙｍｂｉｄｉｕｍｒｉｎｇｓｐｏｔｔｏｍｂｕｓｖｉｒｕｓ
ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＮｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａｐｌａｎｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｔｈｅ
ｖｉｒｕｓｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１９９３，２１（４）：
６６５－６７２．
［８］ＦｅｒｅｉｒａＳＡ，ＰｉｔｚＫＹ，ＭａｎｓｈａｒｄｔＲ，ｅｔａｌ．Ｖｉｒｕｓｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎｔｒａｎｓ
ｇｅｎｉｃＰａｐａｙａｐｒｏｖｉｄｅｓｐｒａｃｔｉｃａｌｃｏｎｔｒｏｌｏｆＰａｐａｙａｒｉｎｇｓｐｏｔｖｉｒｕｓｉｎ
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（责任编辑：詹春梅）
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