全 文 ：书中国荷斯坦奶牛铁蛋白基因３′端克隆及序列分析
罗佳捷１，彭瑛３，罗锐１，张彬１，李丽立２，吴力专１，占今舜１，邢月腾１
（１．湖南农业大学动物科学技术学院，湖南 长沙４１０１２８；２．中国科学院亚热带农业生态研究所 动物生态营养与健康养殖联合实验室
农业生态工程重点实验室，湖南 长沙４１０１２５；３．湖南广播电视大学农医部，湖南 长沙４１０００４）
摘要：本研究旨在克隆和分析中国荷斯坦奶牛的铁蛋白（ＦＴＨ）基因，为该基因的功能研究和有效利用提供理论依
据。运用ｃＤＮＡ末端快速扩增（ＲＡＣＥ）技术从公犊肝脏组织中扩增出ＦＴＨ基因的３′端ｃＤＮＡ序列，并利用生物
信息学方法对该基因的氨基酸序列进行分析。结果表明，ＦＴＨ基因３′端ｃＤＮＡ全长为４８９ｂｐ，编码８１个氨基酸；
经生物信息学分析表明，该基因编码的蛋白无 Ｎ端信号肽及跨膜区，相对分子质量为９．１２５３ｋＤ，理论等电点为
５．１９，脂肪系数为８５．５６，总亲水性为－０．３４２，其一级结构中存在４个功能结构域；二级结构元件以α螺旋和β旋
转为主；同源序列分析表明，中国荷斯坦奶牛与原牛ＦＴＨ氨基酸的相似性最高（９９％）；系统进化树显示，在该基因
座位上中国荷斯坦奶牛与所测物种的亲缘关系均较远。本研究有助于揭示ＦＴＨ家族基因的进化历史，为对其进
行深入的功能分析和利用研究提供参考。
关键词：中国荷斯坦奶牛；铁蛋白；ｃＤＮＡ末端快速扩增；克隆；序列分析
中图分类号：Ｓ８２３．９＋１　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１３）０５００９６０８
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１３０５１１　　
　　近年来，随着人们生活水平的不断提高，对于高品质动物蛋白食品的需求也与日递增，因此，如何生产出更多
高质量的肉、蛋、奶食品已成为众多科技工作者、动物养殖及食品加工企业急需解决的重大问题。动物产品中的
牛羊肉一直因其高蛋白含量和低脂肪含量的特性而广受人们的青睐，牛羊奶也一直是人们补充动物蛋白的重要
来源，学者们从动物营养学的角度对如何改善牛羊的生产性能及免疫功能进行了大量的研究，以求提高牛羊肉、
奶的产量及质量，并取得了可喜的进展［１９］。伴随着分子生物学技术对动物营养学领域的不断渗透，部分研究正
趋向于从探索如何提高或降低动物机体内某些基因和蛋白的表达水平入手来提高其生产性能及健康状况，以期
从生理调控的角度来阐述动物高产及维持动物健康的机理，同时为饲料营养调控提供理论依据［１０１２］。
铁元素与动物造血、携氧及产能等过程联系得十分紧密，同时在免疫和防御感染方面也发挥着很大作用。动
物体内有９０％以上的铁元素与蛋白质结合在一起。铁蛋白（ｆｅｒｒｉｔｉｎ，ＦＴＨ）是机体细胞内一种重要的铁贮存蛋
白，具有独立特殊的圆形结构，主要分为球形蛋白质外壳和铁核心两部分［１３，１４］。ＦＴＨ是一种高保守性的多亚基
蛋白，主要由巨噬细胞等多种细胞分泌生成，其功能有：１）能够适时调节机体内铁含量的高低［１５，１６］；２）在抵抗氧
化损害和调节细胞增殖等过程中起着重要的作用［１７］；３）与机体的免疫反应有一定的联系［１８２２］。近年来，Ｃｏｈｅｎ
等［２３］和ＤｅＤｏｍｅｎｉｅｏ等［２４］分别报道了关于ＦＴＨ分泌机制的最新研究进展，为ＦＴＨ的细胞来源提供了一定的
理论依据。目前，对ＦＴＨ蛋白的研究多存在于植物和人体方面，而对动物ＦＴＨ蛋白的研究主要集中在基因的
分离和克隆上，如易新元等［２５］和 ＭｉｎＳｕｎ等［２６］分别克隆了日本血吸虫和腹蛙输卵管中的ＦＴＨ蛋白，而对其在
动物营养生理学方面的研究还十分欠缺。鉴于ＦＴＨ在动物生长和发育过程中的巨大作用，本研究旨在克隆和
分析中国荷斯坦奶牛ＦＴＨ基因的３′端ｃＤＮＡ及氨基酸序列，以期为该基因的功能研究和有效利用提供坚实的
理论依据。
９６－１０３
２０１３年１０月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第２２卷　第５期
Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．５
收稿日期：２０１２１１０８；改回日期：２０１３０１０８
基金项目：国家自然科学基金项目（３１０７２０５３；３０６７１５１６），教育部高等学校博士学科点专项科研基金（博导类）项目（２０１０４３２０１１０００１），湖南省自
然科学基金重点项目（１１ＪＪ２０１４）和湖南省博士生科技创新项目（ＣＸ２０１０Ｂ２８４）资助。
作者简介：罗佳捷（１９８４），男，湖南湘潭人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｋａｋａａｄｒｉａｎｏ＠１２６．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｚｈｂ８２３６＠１２６．ｃｏｍ，ｌｉｌｉ＠ｉｓａ．ａｃ．ｃｎ
１　材料与方法
１．１　样品及主要试剂、菌株
本试验从２０１１年９月开始，至２０１２年３月结束。中国荷斯坦公犊牛（１ｄ）购自湖南省畜牧兽医研究所奶牛
场。将公犊牛颈静脉放血致死，用７５％浓度的酒精进行全身清洗后立刻解剖并采集肝脏组织（迅速分装），于液
氮中速冻后放入－８０℃冰箱保存备用。
ＴＲＮｚｏＬ总ＲＮＡ提取试剂（１００ｍＬ）和ＰＣＲ产物纯化试剂盒购自天根生化科技有限公司；３′ＦｕｌＲＡＣＥ
ＣｏｒｅＳｅｔＶｅｒ．２．０（２０ＲＴＲｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｄ３１４）、ＴａＫａＲａＬＡＴａｑ?（ＤＲＲ０２ＡＭ）和ＰＭＤ?１９ＴＶｅｃｔｏｒ（Ｄ１０２Ａ）购
自宝生物工程（大连）有限公司；大肠杆菌ＤＨ５α由本实验室（湖南农业大学动物科学技术学院分子实验室）保存。
１．２　引物的设计与合成
根据美国国立生物技术信息中心（ＮＣＢＩ）ＧｅｎＢａｎｋ数据库中公布的原牛ＦＴＨ基因序列，采用Ｐｒｉｍｅｒ５．０软
件设计特异性引物（表１）。引物由华大基因武汉分公司合成。
表１　犉犜犎基因３′全长克隆引物
犜犪犫犾犲１　犘狉犻犿犲狉狊犳狅狉３′犲狀犱犳狌犾犾犲狀犵狋犺犮犾狅狀犲狅犳犉犜犎犵犲狀犲
引物Ｐｒｉｍｅｒ 序列Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′→３′）
３′ＲＡＣＥ接头引物３′ＲＡＣＥＡｄａｐｔｏｒ 含有由ＴａＫａＲａ独特设计的ｄＴ区域及ＡｄａｐｔｏｒＰｒｉｍｅｒ部分。ＩｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅｄＴ
ｄｏｍａｉｎａｎｄＡｄａｐｔｏｒＰｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎｅｄｂｙＴａＫａＲａ．
３′ＲＡＣＥ外接引物３′ＲＡＣＥＯｕｔｅｒＰｒｉｍｅｒ ＴＡＣＣＧＴＣＧＴＴＣＣＡＣＴＡＧＴＧＡＴＴＴ
３′端特异性引物３３′ＧＳＰ３ ＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＧＡＧＧＣＧ
１．３　总ＲＮＡ的提取
公犊肝脏组织总ＲＮＡ的提取按照ＲＮＡ提取试剂盒说明书进行，并用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检
测ＲＮＡ的浓度及纯度。
１．４　３′ＲＡＣＥ扩增
将ＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ，反应体系为１０μＬ：ＲＮＡ５μＬ，３′ＲＡＣＥＡｄａｐｔｏｒ（５μｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，５×莫罗尼鼠
白血病病毒（ｍｏｌｏｎｅｙｍｕｒｉｎｅｌｅｕｋｅｍｉａｖｉｒｕｓ，ＭＭＬＶ）Ｂｕｆｆｅｒ２μＬ，ｄＮＴＰ混合物（ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ）（１０ｍｍｏｌ／
Ｌｅａｃｈ）１μＬ，ＭＭＬＶ反转录酶（ＲＮａｓｅＨ）（２００Ｕ／μＬ）０．２５μＬ，核糖核酸酶抑制剂（ＲＮａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）（４０Ｕ／
μＬ）０．２５μＬ和去酶蒸馏水（ＲＮａｓｅｆｒｅｅｄＨ２Ｏ）０．５μＬ，反应条件为：４２℃６０ｍｉｎ，７０℃１５ｍｉｎ。将生成的ｃＤ
ＮＡ进行套式ＰＣＲ反应，反应体系为５０μＬ：反转录反应液２μＬ，１×ｃＤＮＡ 稀释缓冲液 （ｄｉｌｕｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ）ＩＩ８
μＬ，３′ＧＳＰ３（１０μｍｏｌ／Ｌ）２μＬ，３′ＲＡＣＥＯｕｔｅｒＰｒｉｍｅｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ）２μＬ，１０×ＬＡＰＣＲｂｕｆｆｅｒＩＩ（Ｍｇ
２＋ｆｒｅｅ）４
μＬ，ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）３μＬ，ＴａＫａＲａＬＡＴａｑ?（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ和ｄＨ２Ｏ２８．７５μＬ，反应条件为：９４℃预变
性３ｍｉｎ，９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃３０ｓ，２５个循环，７２℃延伸１０ｍｉｎ，４℃保存。取５μＬ产物用１％ 的琼脂糖凝
胶电泳进行检测。
１．５　ＰＣＲ产物克隆与重组质粒鉴定
产物的回收与纯化按照聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）产物纯化试剂盒的说明进行，将
纯化的ＰＣＲ产物与一种高效克隆ＰＣＲ产物的专用载体（ＰＭＤ１９ＴＶｅｃｔｏｒ）１６℃过夜连接，并转化入感受态大肠
杆菌 ＤＨ５α，涂布于含５溴４氯３吲哚βＤ半乳糖苷（５Ｂｒｏｍｏ４ｃｈｌｏｒｏ３ｉｎｄｏｌｙｌβＤｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ，Ｘ
Ｇａｌ）／异丙基βＤ硫代吡喃半乳糖苷（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌβＤｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ，ＩＰＴＧ）／氨苄青霉素（ａｍｐｉｃｉｌｉｎ，Ａｍｐ）的琼
脂平板３７℃恒温培养过夜。挑单个阳性克隆菌落接种于含有 Ａｍｐ的琼脂液体培养基，３７℃２２０ｒ／ｍｉｎ振荡培
养８ｈ，以菌液为模板进行ＰＣＲ检测，挑阳性克隆菌液送华大基因进行测序。
１．６　序列分析
测序所得的ｃＤＮＡ片段先通过软件ＤＮＡＳｔａｒ与表达序列标签（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇｓ，ＥＳＴ）拼接，获得
７９第２２卷第５期 草业学报２０１３年
完整ｃＤＮＡ全长，并推导其开放阅读框序列；用ＮＣＢＩ中的ｂｌａｓｔ程序搜索与其相关的同源基因序列，并用ＤＮＡ
ＭＡＮ软件完成序列同源性比对。
１．７　生物信息学分析
分别用在线软件分析蛋白质的氨基酸组成、理化性质（ｗｗｗ．ｅｓｙｐｒｅｄ．ｃｏｍ）及其一级结构（ｈｔｔｐ：／／ｓｍａｒｔ．
ｅｍｂｌｈｅｉｄｅＬｂｅｒｇ．ｄｅ／）、二级结构（ｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉｂｉｎ／ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝／ＮＰＳＡ／ｎｐｓａ＿
ｓｏｐｍａ．ｈｔｍｌ）和三级结构（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｕｎｄｐ．ａｃ．ｂｅ／ｓｃｉｅｎｃｅｓ／ｂｉｏｌｏｇｉｅ／ｕｒｂｍ／ｂｉｏｉｎｆｏ／ｅｓｙｐｒｅｄ／）；在ＳＷＩＳＳ
ＭＯＤＥＬ服务器上对ＦＴＨ的氨基酸序列进行分析；ＦＴＨ的信号肽用ＳＯＳＵＩ和Ｓｉｇｎａｌｐ４．０软件来测定；ＦＴＨ
的跨膜结构则用ＴＭｐｒｅｄ和ＴＭＨＭＭ２．０软件共同预测；ＦＴＨ蛋白的亲疏水性用ＥｘＰＡＳｙ中ＰｒｏｔＳｃａｌｅ程序
得到的疏水性图谱来计算；此外，用系统发育分析软件 ＭＥＧＡ４和ＣｌｕｓｔａｌＸ２来构建邻接树，以分析基因在不同
物种中的亲缘关系。
２　结果与分析
图１　犉犜犎基因的３′犚犃犆犈－犘犆犚产物
犉犻犵．１　３′犚犃犆犈－犘犆犚狆狉狅犱狌犮狋狊狅犳犉犜犎犵犲狀犲
　　　Ｍ：１００ｂｐＤＮＡ 标记物；Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３：ＦＴＨ 基因的３′ＲＡＣＥ－ＰＣＲ
产物。Ｍ：１００ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ；Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３：３′ＲＡＣＥ－ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ
ｏｆＦＴＨｇｅｎｅ．
２．１　ＦＴＨ基因片段的测序分析
３′ＲＡＣＥ的ＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳检测
的结果表明，其大小在５００ｂｐ左右，克隆出的 Ｍ１、Ｍ２
和 Ｍ３条带单一，说明引物的特异性高。该条带经测
序证实为目的条带（图１）。
ＲＡＣＥ－ＰＣＲ 扩增获得的ＦＴＨ 基因经测序表
明：３′ＲＡＣＥ－ＰＣＲ产物的有效序列大小为４８９ｂｐ。
运用ＤＮＡＳｔａｒ软件与ＥＳＴ拼接后，可知克隆所得的
ＦＴＨ３′端的开放阅读框为２４６ｂｐ（６６～３１１），非编码
区２４３ｂｐ。核苷酸序列的３′端非编码区还含有１个
“ＡＡＴＡＡＡ”的ｍＲＮＡ加尾信号（图２）。
２．２　ＦＴＨ的氨基酸序列及理化性质分析
对ＦＴＨ 的氨基酸序列及理化性质分析表明，该
蛋白由８１个氨基酸组成；分子式为Ｃ３９５Ｈ６２５Ｎ１０９Ｏ１２７Ｓ６；
相对分子量为９．１２５３ｋＤａ；理论ＰＩ值为５．１９；不稳
定系数为６４．９８，大于４０则表明该蛋白是不稳定的；脂肪系数为８５．５６；总平均亲水性为－０．３４２。
２．３　ＦＴＨ氨基酸序列同源性分析
ＦＴＨ氨基酸序列经ＮＣＢＩ中ＰｒｏｔｅｉｎＢｌａｓｔ比对，同源性比较结果表明，荷斯坦奶牛与其他５个物种的ＦＴＨ
氨基酸序列存在较高的同源性，其中相似性最高的是原牛，相似性高达９９％，然后依次是智人、类人猿、犬类和鼠
类，相似性分别为８８％，８８％，８６％和８４％（表２）。
２．４　系统进化树的构建与分析
用ＣＬＵＳＴＡＬＸ和 ＭＥＧＡ４软件构建ＦＴＨ基因的系统进化树，表明中国荷斯坦奶牛与多种哺乳动物的亲
缘关系均较远（图３）。
２．５　ＦＴＨ蛋白的三级结构预测
运用蛋白质三级结构在线预测软件对ＦＴＨ蛋白的氨基酸序列进行同源三级结构建模，目标蛋白与参考蛋
白的序列比对同源性为９９％，模型评估Ｅ值为０，模型中可见典型的α螺旋和β折叠结构（图４）。
２．６　ＦＴＨ蛋白的结构功能域分析
ＦＴＨ蛋白质的结构功能域主要包括４个部分：１）铁蛋白（ｆｅｒｒｉｔｉｎ），１～５９；２）锌指半胱氨酸组氨酸（ＺｎＦ
Ｃ２Ｈ２），１～２１；３）锌指相关联区域（ｚｆＡＤ），２～５２；４）甲状旁腺素（ＰＴＨ）；８～４９（表３）。
２．７　ＦＴＨ蛋白的信号肽预测
ＳＯＳＵＩ和Ｓｉｇｎａｌｐ４．０两个软件对ＦＴＨ信号肽的预测结果基本一致，Ｓｉｇｎａｌｐ４．０的预测结果表明该蛋白
无信号肽（图５）。
８９ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．５
图２　犉犜犎基因的３′端犮犇犖犃序列和推导的氨基酸序列
犉犻犵．２　犜犺犲狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳犳狌犾犾犲狀犵狋犺犮犇犖犃犪狀犱犪犿犻狀狅犪犮犻犱狅犳犉犜犎犵犲狀犲
　起始密码子和终止密码子分别用方框标记，终止信号用“”标出，ｍＲＮＡ加尾信号用双除线标出。ＡＴＧａｎｄＴＧＡａｒｅｌａｂｅｌｅｄｂｙｓｑｕａｒｅｆｒａｍｅ，
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓｉｇｎａｌａｎｄｍＲＮＡｔａｉｌｉｎｇｓｉｇｎａｌａｒｅｌａｂｅｌｅｄｂｙ“”ａｎｄｄｏｕｂｌｅｅｘｃｅｐｔｌｉｎｅｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
　
表２　中国荷斯坦奶牛与其他物种犉犜犎氨基酸序列的同源性
犜犪犫犾犲２　犜犺犲犻犱犲狀狋犻狋狔狅犳犉犜犎犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狊犫犲狋狑犲犲狀犆犺犻狀犲狊犲犎狅犾狊狋犲犻狀犮犪狋狋犾犲犪狀犱狅狋犺犲狉狊狆犲犮犻犲狊
种类Ｓｐｅｃｉｅｓ 蛋白质Ｐｒｏｔｅｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ接受号ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃＮｏ． 同源性Ｉｄｅｎｔｉｔｙ（％）
原牛犅狅狊狋犪狌狉狌狊 ＦＴＨ１ ＮＭ＿１７４０６２．３ ９９
智人 犎狅犿狅狊犪狆犻犲狀狊 ＦＴＨ１ ＮＭ＿００２０３２．２ ８８
类人猿犘狅狀犵狅犪犫犲犔犻犻 ＦＴＨ１ ＮＭ＿００１１３２６３６．１ ８８
犬类犆犪狀犻狊犔狌狆狌狊犳犪犿犻犔犻犪狉犻狊 ＦＴＨ１ ＮＭ＿００１００３０８０．１ ８６
鼠类犚犪狋狋狌狊狀狅狉狏犲犵犻犮狌狊 ＦＴＨ１ ＮＭ＿０１２８４８．１ ８４
图３　犉犜犎基因的系统进化树
犉犻犵．３　犜犺犲犿狅犾犲犮狌犾犪狉犲狏狅犾狌狋犻狅狀狋狉犲犲狊狅犳犉犜犎犵犲狀犲
　
表３　犉犜犎蛋白的结构域
犜犪犫犾犲３　犜犺犲犱狅犿犪犻狀狅犳犉犜犎狆狉狅狋犲犻狀
名称Ｎａｍｅ 起点Ｂｅｇｉｎ 终点Ｅｎｄ Ｅ值Ｅｖａｌｕｅ
铁蛋白Ｆｅｒｒｉｔｉｎ（ＦＴＨ） １ ５９ １．６０×１０－１５
锌指半胱氨酸组氨酸Ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｃｙｓｔｅｉｎｅｈｉｓｔｉｄｉｎｅ（ＺｎＦＣ２Ｈ２） １ ２１ １．４２×１０３
锌指相关联区域Ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒａｓｓｏｃｉａｔｅｄｄｏｍａｉｎ（ｚｆＡＤ） ２ ５２ １．４０×１０５
甲状旁腺素Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄｈｏｒｍｏｎｅ（ＰＴＨ） ８ ４９ ２．１５ｅ×１０３
９９第２２卷第５期 草业学报２０１３年
２．８　ＦＴＨ蛋白的跨膜结构预测
图４　犈狊狔狆狉犲犱预测的犉犜犎蛋白三级结构
犉犻犵．４　犜犺犲狋犲狉狋犻犪狉狔狊狋狉狌犮狋狌狉犲狅犳犉犜犎狆狉狅狋犲犻狀狆狉犲犱犻犮狋犲犱犫狔犲狊狔狆狉犲犱
　
图６显示了ＴＭｐｒｅｄ和ＴＭＨＭＭ２．０软件
共同预测的ＦＴＨ蛋白跨膜结构，结果表明ＦＴＨ
蛋白无跨膜区域，ＴＭＨＭＭ 软件进一步可以推
断该蛋白为非跨膜蛋白（图７）。
２．９　ＦＴＨ蛋白的疏水性分析
用ＥｘＰＡＳｙ中ＰｒｏｔＳｃａｌｅ程序得到的疏水性
图谱来计算ＦＴＨ蛋白的亲疏水性，正、负值分别
表明疏水和亲水，图８显示了ＦＴＨ 蛋白各氨基
酸残基的亲疏水性，得到的总平均疏水性为
－０．３４２，说明ＦＴＨ蛋白属于疏水性蛋白。
图５　犉犜犎蛋白的信号肽预测结果
犉犻犵．５　犘狉犲犱犻犮狋犻狅狀狊狅犳狊犻犵狀犪犾狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳犉犜犎狆狉狅狋犲犻狀
　
图６　犉犜犎蛋白的跨膜结构预测结果（犪）
犉犻犵．６　犘狉犲犱犻犮狋犻狅狀狊狅犳狋狉犪狀狊犿犲犿犫狉犪狀犲犱狅犿犪犻狀狊狅犳犉犜犎狆狉狅狋犲犻狀（犪）
　
图７　犉犜犎蛋白的跨膜结构预测结果（犫）
犉犻犵．７　犘狉犲犱犻犮狋犻狅狀狊狅犳狋狉犪狀狊犿犲犿犫狉犪狀犲犱狅犿犪犻狀狊狅犳犉犜犎狆狉狅狋犲犻狀（犫）
　
图８　犉犜犎蛋白的疏水性预测结果
犉犻犵．８　犘狉犲犱犻犮狋犻狅狀狊狅犳犺狔犱狉狅狆犺狅犫犻犮犻狋狔狅犳犉犜犎狆狉狅狋犲犻狀
　
３　讨论
铁元素在机体造血、携氧及产能等过程中发挥着重要的作用，而结合和运输铁元素及调节铁元素的含量则是
ＦＴＨ的主要作用。本研究运用 ＲＡＣＥ－ＰＣＲ技术获得了中国荷斯坦奶牛ＦＴＨ基因ｃＤＮＡ的３′端序列，并用
生物信息学方法对其氨基酸序列进行了分析，得到了一系列关于中国荷斯坦奶牛ＦＴＨ 基因及蛋白的信息。
ＦＴＨ氨基酸同源性的分析比较表明，中国荷斯坦奶牛与多种动物具有较高的同源性，且存在高度保守的序列位
００１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．５
点，这说明ＦＴＨ基因在物种发展过程中没有发生大的变异，具有一定的高保守性。结构的高度保守性又反映了
其功能的保守性，从而为研究中国荷斯坦奶牛ＦＴＨ蛋白的功能奠定了一定的基础。本研究表明，ＦＴＨ蛋白的
一级结构中存在４个功能结构域，二级结构元件以α螺旋和β旋转为主，α螺旋结构最为稳固，不易变形，其主要
功能是作为蛋白质的基本骨架［２７］，ＦＴＨ蛋白中数量庞大的α螺旋保证了该蛋白结构的稳定性，是其正常发挥各
种生物学功能的重要前提。
如何改善奶牛的免疫功能，维持奶牛的健康高产一直是南方奶牛养殖业所面临的重大难题，本课题组近年来
对于功能活性蛋白在缓解奶牛应激状态、提高奶牛抗氧化能力以及维护奶牛健康等方面的作用及机理进行了一
些研究，并取得了一定的成果［２８３２］。ＦＴＨ蛋白作为一种功能活性蛋白，在提高机体的抗氧化能力［１７］及改善机体
的免疫功能方面［１８２２］具有一定的作用。目前，对ＦＴＨ基因和蛋白的研究主要集中在人体方面，如卢秀霞［３３］、刘
洋等［３４，３５］、陈艳萍等［３６］和郭跃文等［３７］的研究表明，人体血清ＦＴＨ的含量为检测肾性贫血、儿童系统性红斑狼
疮、幼年特发性关节炎全身型、新生儿缺血缺氧性脑病及宫颈癌的良好指标，此外，还存在大量关于血清ＦＴＨ水
平与糖尿病的关系方面的报道。在动物体方面，白霞等［３８］和袁鑫［３９］分别对微小牛蜱和血吸虫中ＦＴＨ基因的克
隆和表达进行了研究；张勇等［４０］对家蝇幼虫血淋巴蛋白组的性质进行了研究，发现ＦＴＨ是一种热稳定性良好的
功能蛋白；此外，康波等［４１］的研究表明，籽鹅卵巢组织中ＦＴＨ及其８个新ＥＳＴｓ的表达量可能参与籽鹅卵巢功
能的调节并影响籽鹅的产蛋性能。到目前为止，对于ＦＴＨ蛋白在奶牛体内分布、生理和病理方面具有的功能及
作用机理的研究还未见报道，但综合考虑到其在机体造血、携氧、产能、抗氧化及免疫等过程中所发挥的重要作
用，ＦＴＨ无疑在奶牛机体代谢过程中发挥着重要的调节作用，因此，本研究对中国荷斯坦奶牛ＦＴＨ３′端ｃＤＮＡ
的序列进行了克隆和分析，并对其所编码蛋白的结构特征、分类进行了初步研究，这为进一步研究ＦＴＨ在中国
荷斯坦奶牛内的表达定位、调控、功能及作用机理等方面奠定了良好的基础。
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３′犲狀犱犮犾狅狀犻狀犵犪狀犱狊犲狇狌犲狀犮犲犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狋犺犲犉犜犎犵犲狀犲犳狉狅犿犆犺犻狀犲狊犲犎狅犾狊狋犲犻狀犮犪狋狋犾犲
ＬＵＯＪｉａｊｉｅ１，ＰＥＮＧＹｉｎｇ３，ＬＵＯＲｕｉ１，ＺＨＡＮＧＢｉｎ１，ＬＩＬｉｌｉ２，
ＷＵＬｉｚｈｕａｎ１，ＺＨＡＮＪｉｎｓｈｕｎ１，ＸＩＮＧＹｕｅｔｅｎｇ１
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＨｕｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０１２８，Ｃｈｉｎａ；
２．ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｎｄＨｕｍａｎＨｅａｌｔｈａｎｄＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｇｒｏｅｃｏｌｏｇｙ，
ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＳｕｂｔｒｏｐｉｃａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ｔｈｅＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈａｎｇｓｈａ
４１０１２５，Ｃｈｉｎａ；３．ＦａｃｕｌｔｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｕｎａｎ
ＲａｄｉｏａｎｄＴＶＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０００４，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｈｅ３′ｅｎｄｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅＦＴＨ （ｆｅｒｒｉｔｉｎ）ｇｅｎｅｆｒｏｍＣｈｉｎｅｓｅＨｏｌ
ｓｔｅｉｎｃａｔｔｌｅｗａｓｃｌｏｎｅｄａｎｄａｎａｌｙｚｅｄｔｏｐｒｏｖｉｄｅａｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｆｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｔｕｄｉｅｓａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｉｖｅｕｔｉｌｉｚａ
ｔｉｏｎ．Ｔｈｅ３′ｅｎｄｃＤＮＡｗａｓｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍｌｉｖｅｒｔｉｓｓｕｅｓｂｙｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ（ＲＡＣＥ），ａｎｄｔｈｅ
ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｔｈｅ３′ｅｎｄｃＤＮＡｏｆｔｈｅＦＴＨｇｅｎｅｗａｓ
４８９ｂｐａｎｄｉｔｅｎｃｏｄｅｄａｐｅｐｔｉｄｅｏｆ８１ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．Ｉｔｓｒｅｌａｔｉｖｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｗａｓ９．１２５３ｋＤ，ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ
ｐｏｉｎｔｗａｓ５．１９，ｆａｔｉｎｄｅｘｗａｓ８５．５６，ｇｒａｎｄａｖｅｒａｇｅｏｆｈｙｄｒｏｐａｔｈｙｗａｓ－０．３４２．Ｎｔｅｒｍｉｎａｌｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅｓ
ａｎｄｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎｓｗｅｒｅｎｏｔｉｎｃｌｕｄｅｄｉｎｔｈｉｓｐｒｏｔｅｉｎ．ＴｈｅｐｒｉｍａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅＦＴＨｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎ
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ｏｂｔａｉｎｅｄｔｈｒｏｕｇｈｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅＦＴＨｏｆＣｈｉｎｅｓｅＨｏｌｓｔｅｉｎｃａｔｔｌｅｈａｄａｈｉｇｈｓｉｍｉｌａｒｉ
ｔｙｔｏｔｈａｔｏｆ犅狅狊狋犪狌狉狌狊（９９％），ａｎｄｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｔｒｅｅｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＦＴＨｏｆＣｈｉｎｅｓｅＨｏｌｓｔｅｉｎ
ｃａｔｔｌｅｈａｄｖｅｒｙｌｏｗｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｗｉｔｈｏｔｈｅｒｓｐｅｃｉｅｓｓｔｕｄｉｅｄｉｎｔｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｔｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｐｒｏｖｉｄｅｄ
ｃｌｕｅｓｆｏｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｓｔｕｄｉｅｓｏｆｔｈｅＦＴＨｇｅｎｅｆａｍｉｌｙ，ａｓｗｅｌａｓｓｅｒｖｉｎｇａｓｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａ
ｎａｌｙｓｉｓａｎｄｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ＣｈｉｎｅｓｅＨｏｌｓｔｅｉｎｃａｔｔｌｅ；ＦＴＨ；ＲＡＣＥ；ｃｌｏｎｅ；ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ
３０１第２２卷第５期 草业学报２０１３年