全 文 ：书小花碱茅犎犓犜２；１基因全长犮犇犖犃的
克隆与生物信息学分析
李剑，张金林，王锁民，郭强
（兰州大学草地农业科技学院 草地农业生态系统国家重点实验室，甘肃 兰州７３００２０）
摘要：Ｎａ＋是盐渍化土壤中主要的毒害离子，对植物生长发育和农业生产构成严重威胁。高亲和性 Ｋ＋转运蛋白
ＨＫＴ２；１在控制高等植物Ｎａ＋吸收，增强Ｋ＋的选择性，进而提高耐盐性方面发挥着重要作用。本研究以拒盐型牧
草小花碱茅为材料，采用ＲＴ－ＰＣＲ和ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ）方法克隆到 犎犓犜２；１基因，并命
名为犘狌狋犎犓犜２；１。该基因全长１９１９ｂｐ，包含１个长１６３８ｂｐ的开放阅读框（ＯＲＦ），编码５４６个氨基酸，推测分
子量为６０．５ｋＤａ，等电点ＰＩ为９．０７。与其他植物 ＨＫＴ２；１氨基酸序列同源性多在６６％以上，核苷酸序列同源性
都在７５％以上。ＰｕｔＨＫＴ２；１可能跨膜１１次，二级结构分析表明，ＰｕｔＨＫＴ２；１蛋白含有４７．９９％α螺旋、５．１３％
β转角、３１．８７％无规则卷曲和１５．０１％延伸链。犘狌狋犎犓犜２；１基因全长ｃＤＮＡ的克隆及其生物信息学分析为进一
步揭示小花碱茅拒盐的分子机制奠定了基础。
关键词：小花碱茅；犘狌狋犎犓犜２；１基因；克隆；生物信息学分析；耐盐性
中图分类号：Ｑ９４３．２；Ｓ５４３＋．９０３　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１３）０２０１４０１０
　　世界上存在大约１０亿ｈｍ２ 的盐碱地［１］，其中我国盐碱地约占全球总面积的１０％［２，３］；且灌溉导致的盐碱化
还会进一步扩大；因灌溉耕地产出的粮食占粮食总产量的１／３，其土壤盐碱化对世界粮食安全构成严重威胁［４６］。
Ｎａ＋是盐渍化土壤中主要的毒害离子，高浓度的Ｎａ＋势必对植物产生严重的渗透胁迫［６８］。此外，植物体内绝大
多数的生理生化代谢过程都是在细胞质中进行的，毒性Ｎａ＋一旦进入其中，将对细胞分裂、生长、光合作用和发
育等生命代谢活动构成严重威胁，从而引起植物生长受抑，甚至导致死亡［６，９］。土壤中高浓度的Ｎａ＋还阻碍了植
物对Ｋ＋的吸收，造成植物体内Ｋ＋匮缺［６，１０］。研究发现，通过高亲和性Ｋ＋转运蛋白（ｈｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙＫ＋ｔｒａｎｓｐｏｒｔ
ｅｒｓ，ＨＫＴｓ）限制Ｎａ＋的吸收，促进Ｎａ＋的回收，提高Ｋ＋的选择能力，从而维持植株体内Ｋ＋、Ｎａ＋稳态平衡，特
别是叶片中低的Ｎａ＋浓度和Ｎａ＋／Ｋ＋是高等植物抵御盐逆境的关键，这在拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）、小麦
（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）和水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）等植物上已得到证实［６，１１１４］。ＨＫＴ类转运蛋白是存在于植物、酵母、
细菌和真菌中的一个超级蛋白家族［６，１５］，自小麦ＴａＨＫＴ２；１被克隆之后［１６］，相继在拟南芥、水稻和大麦（犎狅狉
犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲）等植物也发现了犎犓犜基因［６，１７２０］。根据异源表达结果，将 ＨＫＴ类蛋白分为２种类型：第一种以
拟南芥ＡｔＨＫＴ１；１为代表，包括水稻ＯｓＨＫＴ１；４和ＯｓＨＫＴ１；５等，作为１种Ｎａ＋选择性的转运体，主要转运
Ｎａ＋ ［１１，２１］；第二种以小麦ＴａＨＫＴ２；１为代表，包括水稻 ＯｓＨＫＴ２；１／２和大麦 ＨｖＨＫＴ２；１等，它们为 Ｋ＋Ｎａ＋
共转运体，其ｍＲＮＡ表达量在水稻中往往受Ｋ＋饥饿的刺激而增加，在高亲和性Ｋ＋吸收和低亲和性Ｎａ＋吸收
的控制方面发挥作用［６，２２２５］。
碱茅属（犘狌犮犮犻狀犲犾犾犻犪）植物是生长于盐渍化沼泽地上的一类耐盐牧草，是抗盐能力极强的禾本科拒盐型盐生
植物（ｈａｌｏｐｈｙｔｅ）［１，２６］。研究表明，小花碱茅（犘狌犮犮犻狀犲犾犾犻犪狋犲狀狌犻犳犾狅狉犪）的拒Ｎａ＋能力极强，可以在高Ｎａ＋环境下生
存，且其体内维持很低的Ｎａ＋浓度［２７，２８］，进一步证实，小花碱茅根部对Ｋ＋／Ｎａ＋选择性吸收能力很强，约是小麦
的２倍［２９］，根系控制Ｎａ＋内流和强的Ｋ＋／Ｎａ＋选择性是小花碱茅耐盐的关键［３０］。据此，推理小花碱茅 ＨＫＴ２；１
１４０－１４９
２０１３年４月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第２２卷　第２期
Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．２
收稿日期：２０１１０６０７；改回日期：２０１１１１０３
基金项目：国家自然科学基金项目（３１２２２０５３，３１１７２２５６），教育部“新世纪优秀人才支持计划”（ＮＣＥＴ１１０２１７），兰州大学中央高校基本科研业
务费专项资金（ｌｚｕｊｂｋｙ２０１３ｋ０８）和兰州市科技发展计划项目（２０１０１３９）资助。
作者简介：李剑（１９８５），男，河南济源人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｊｉａｎ２００９＠ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｊｌｚｈａｎｇ＠ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
蛋白在控制其根系Ｎａ＋内流和增强Ｋ＋／Ｎａ＋选择性中发挥着重要作用。本研究从小花碱茅根中克隆犎犓犜２；１
基因全长ｃＤＮＡ，将为进一步揭示小花碱茅拒盐的分子机制奠定基础。
１　材料与方法
１．１　材料与处理
小花碱茅种子２０１０年采自甘肃张掖市临泽县白寨村。挑选颗粒饱满的小花碱茅种子暗培养７ｄ，发芽后转
移至光照培养室，浇灌 Ｈｏａｇｌａｎｄ营养液，每２ｄ更换１次，培养４周后，对幼苗进行盐处理（２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ）
２４ｈ，取１００ｍｇ幼根经无菌水冲洗后，置于干净滤纸上吸干水分，放入１．５ｍＬ离心管中，经液氮速冻后转移至
－７０℃冰箱中保存或直接用于总ＲＮＡ提取。培养室昼夜温度为２８／２２℃，光照周期１６ｈ／ｄ，光照强度约为６００
μｍｏｌ／ｍ
２·ｓ，空气相对湿度为６０％～８０％。Ｈｏａｇｌａｎｄ营养液组分：１ｍｍｏｌ／ＬＫＮＯ３，１ｍｍｏｌ／ＬＮＨ４Ｈ２ＰＯ４，
０．５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，０．５ｍｍｏｌ／ＬＣａ（ＮＯ３）２·４Ｈ２Ｏ，９２μｍｏｌ／ＬＨ３ＢＯ３，１８μｍｏｌ／ＬＭｎＣｌ２·４Ｈ２Ｏ，
１．６μｍｏｌ／ＬＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，０．６μｍｏｌ／ＬＣｕＳＯ４·５Ｈ２Ｏ，０．７μｍｏｌ／Ｌ（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４·４Ｈ２Ｏ，５９μｍｏｌ／Ｌ柠檬
酸铁。
１．２　主要试剂
ＲＡＣＥ试剂盒，总ＲＮＡ提取试剂盒，ｃＤＮＡ第一链合成试剂盒，ＬＡＴａｑＰＣＲ扩增试剂盒，ＵＮＩＱ１０ＰＣＲ
产物回收试剂盒，ｐＭＤ１９ＴＳｉｍｐｌｅ载体，ＤＮＡｌａｄｄｅｒ，大肠杆菌感受态细胞，犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻．ＤＨ５ａ菌株由本
实验室保存，其他生化试剂均为进口或国产分析纯。
１．３　研究方法
１．３．１　总ＲＮＡ提取与ｃＤＮＡ第一链合成　总ＲＮＡ的提取依照总ＲＮＡ提取试剂盒说明书进行。反转录过程
依据ｃＤＮＡ第一链合成试剂盒说明书进行，反应体系为：５００ｎｇ总ＲＮＡ；２μＬＲｅａｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒＭｉｘ；补水至１０
μＬ。３７℃温浴１５ｍｉｎ；８５℃温浴５ｓ结束反应。
１．３．２　ＨＫＴ２；１核心片段扩增　通过对大麦、水稻、小麦、高粱（犛狅狉犵犺狌犿犫犻犮狅犾狅狉）和芦苇（犘犺狉犪犵犿犻狋犲狊犪狌狊狋狉犪
犾犻狊）５种植物 ＨＫＴ２；１氨基酸序列进行同源比对，利用ＤＮＡＭＡＮ和ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０设计一对简并引物Ｐ１
和Ｐ２，推测核心片段长度为７００ｂｐ。Ｐ１：５′ＴＧＣＣＧＡＣＲＡＡＹＧＡＧＡＡＣＡＴＧＧ３′；Ｐ２：５′ＣＴＣＧＡＡＣＡＲＣＴＧ
ＴＡＲＣＣＡＧＴＧＧ３′，其中Ｒ＝Ａ／Ｇ，Ｙ＝Ｃ／Ｔ。ＰＣＲ反应体系：ＬＡＴａｑ，０．５μＬ；１０×ＬＡＰＣＲＢｕｆｆｅｒＩＩ（Ｍｇ
２＋
Ｐｌｕｓ），５μＬ；ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ，８μＬ；Ｐ１，１μＬ；Ｐ２，１μＬ；模板ｃＤＮＡ，４μＬ；补水至总体积５０μＬ。ＰＣＲ反应条件：
９４℃２ｍｉｎ；９４℃３０ｓ、５６℃４５ｓ、７２℃５０ｓ，３０个循环；最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。
１．３．３　ＨＫＴ２；１３′端ＲＡＣＥ扩增　根据测序所得到的ＨＫＴ２；１核心片段序列，设计３′端特异性引物Ｐ３和Ｐ４。
Ｐ３（外侧）：５′ＣＡＴＣＴＴＴＧＴＧＡＴＡＧＴＴＧＣＣＴＧＣＡＴＣ３′；Ｐ４（内侧）：５′ＡＴＧＧＣＡＡＣＧＣＡＧＧＧＣＴＡＴＣＣＡＣＴ
３′。ＲＡＣＥ试剂盒自带引物：ＧｅｎｅＲａｃｅｒＴＭ３′Ｐｒｉｍｅｒ：５′ＧＣＴＧＴＣＡＡＣＧＡＴＡＣＧＣＴＡＣＧＴＡＡＣＧ３′；ＧｅｎｅＲａｃ
ｅｒＴＭ３′ＮｅｓｔｅｄＰｒｉｍｅｒ：５′ＣＧＣＴＡＣＧＴＡＡＣＧＧＣＡＴＧＡＣＡＧＴＧ３′。依据ＲＡＣＥ试剂盒说明书得到３′ｃＤＮＡ，
首先扩增３′端外侧，然后以外侧ＰＣＲ产物为模板，利用巢式ＰＣＲ方法扩增３′端内侧。外侧ＰＣＲ反应条件：９４℃
２ｍｉｎ；９４℃３０ｓ、５９℃３５ｓ、７２℃５０ｓ，３０个循环；７２℃１０ｍｉｎ。巢式ＰＣＲ反应条件：９４℃２ｍｉｎ；９４℃３０ｓ、６０℃
３０ｓ、７２℃４０ｓ，３０个循环；７２℃１０ｍｉｎ。
１．３．４　ＨＫＴ２；１５′端ＲＡＣＥ扩增　根据测序所得到的ＨＫＴ２；１核心片段序列，设计５′端特异性引物Ｐ５和Ｐ６。
Ｐ５（外侧）：５′ＡＣＣＧＡＧＴＴＧＡＴＧＡＴＣＴＴＧＧＡＡＧＣ３′；Ｐ６（内侧）：５′ＧＡＡＣＡＡＴＧＴＧＴＴＧＣＣＴＧＣＧＡＧＡＡＣ
ＣＴ３′。ＲＡＣＥ试剂盒自带引物：ＧｅｎｅＲａｃｅｒＴＭ５′Ｐｒｉｍｅｒ：５′ＣＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＡ３′；ＧｅｎｅＲａｃ
ｅｒＴＭ５′ＮｅｓｔｅｄＰｒｉｍｅｒ：５′ＧＧＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＡ３′。依据 ＲＡＣＥ试剂盒说明书得到５′
ｃＤＮＡ，首先扩增５′端外侧，然后以外侧ＰＣＲ产物为模板，利用巢式ＰＣＲ方法扩增５′端内侧。外侧ＰＣＲ反应条
件：９４℃２ｍｉｎ；９４℃３０ｓ、６０℃５０ｓ、７２℃７５ｓ，３０个循环；７２℃１０ｍｉｎ。巢式ＰＣＲ反应条件：９４℃２ｍｉｎ；９４℃
３０ｓ、５８℃５０ｓ、７２℃６０ｓ，３０个循环；７２℃１０ｍｉｎ。
１．３．５　亚克隆与测序　将ＨＫＴ２；１核心片段、３′端和５′端ＰＣＲ回收产物连接到ｐＭＤ１９ＴＳｉｍｐｌｅ载体上，重组
子转化大肠杆菌感受态细胞进行亚克隆，之后将菌液均匀涂布于ＬＢ固体培养基上进行蓝白斑筛选，次日挑选白
１４１第２２卷第２期 草业学报２０１３年
色单菌落，再次扩繁后经ＰＣＲ检测，挑选阳性克隆送上海生工测序。
１．３．６　ＨＫＴ２；１序列生物信息学分析　核苷酸序列与氨基酸序列ＢＬＡＳＴ在 ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．
ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）网站上进行；序列的翻译通过ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０完成；ＤＮＡＭＡＮ主要用于氨基酸多重比
对；ＯＲＦ鉴定采用在线软件ＯＲＦＦｉｎｄｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｇｏｒｆ．ｈｔｍｌ）；ＨＫＴ２；１蛋白跨膜
区预测采用在线软件ＴＭｐｒｅｄＳｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＴＭＰＲＥＤ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）；ＨＫＴ２；１
蛋白等电点和分子量预测采用在线软件ＣｏｍｐｕｔｅＰＩ／Ｍｗｔｏｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ａｕ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌ）；
ＨＫＴ２；１蛋白二级结构预测采用在线软件ＳＯＰＭＡ（ｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉｂｉｎ／ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ
＝／ＮＰＳＡ／ｎｐｓａ＿ｓｏｐｍａ．ｈｔｍｌ）；ＨＫＴ２；１蛋白三级结构预测采用在线软件 ＣＰＨｍｏｄｅｌｓ３．０Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＣＰＨｍｏｄｅｌｓ／）和蛋白质三级结构预测软件ＲａｓＭｏｌ。
２　结果与分析
２．１　总ＲＮＡ的提取与检测
图１　犘狌狋犎犓犜２；１基因核心片段的克隆
犉犻犵．１　犜犺犲狆犪狉狋犳狉犪犵犿犲狀狋狅犳犘狌狋犎犓犜２；１
　　　Ｍ为ＤＮＡｌａｄｄｅｒ；１为ＰＣＲ产物。下同。Ｍ：ＤＮＡｌａｄｄｅｒ；１：ＰＣＲ
ｐｒｏｄｕｃｔ．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
图２　犘狌狋犎犓犜２；１基因３′端片段的克隆
犉犻犵．２　３′犲狀犱犳狉犪犵犿犲狀狋狅犳犘狌狋犎犓犜２；１
取５μＬＲＮＡ溶液，加入１μＬ５×甲醛变性胶上
样缓冲液和１μＬＥＢ（溴化乙锭，８００μｇ／ｍＬ），甲醛变
性胶电泳结果显示：５Ｓ、１８Ｓ和２８Ｓ三条带清晰可
见，２８Ｓ条带亮度约为１８Ｓ的２倍，没有弥散，所提取
的ＲＮＡ完整性良好；ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００核酸蛋白检测仪
表明所提取ＲＮＡ纯度高，无ＤＮＡ和蛋白质污染，可
以用于下游基因克隆实验。
２．２　犎犓犜２；１全长ｃＤＮＡ克隆
以ｃＤＮＡ为模板，用简并引物Ｐ１和Ｐ２扩增出１
条６９７ｂｐ的条带，与预测长度基本一致（图１）。目的
条带上方稍微有些弥散，可能引物存在错配现象，但将
目的条带回收后，非特异性条带消失，不影响后续实
验。根据ＲＡＣＥ试剂盒说明书得到３′ｃＤＮＡ，先以
Ｐ３与ＧｅｎｅＲａｃｅｒＴＭ３′Ｐｒｉｍｅｒ进行外侧ＰＣＲ扩增，然
后以外侧ＰＣＲ产物为模板，用Ｐ４与ＧｅｎｅＲａｃｅｒＴＭ３′
ＮｅｓｔｅｄＰｒｉｍｅｒ进行巢式ＰＣＲ扩增，得到１段长４６６
ｂｐ的片段，经测序证明为犎犓犜２；１基因３′端片段（图
２）。根据 ＲＡＣＥ试剂盒说明书得到５′ｃＤＮＡ，先以
Ｐ５与ＧｅｎｅＲａｃｅｒＴＭ５′Ｐｒｉｍｅｒ进行外侧ＰＣＲ扩增，然
后以外侧ＰＣＲ产物为模板，用Ｐ６与ＧｅｎｅＲａｃｅｒＴＭ５′
ＮｅｓｔｅｄＰｒｉｍｅｒ进行巢式ＰＣＲ扩增，得到１段长８８８
ｂｐ的片段，经测序证明为犎犓犜２；１基因５′端片段（图
３）。将克隆到的核心片段、３′端和５′端进行拼接后得
到小花碱茅犎犓犜２；１基因的全长ｃＤＮＡ序列。
２．３　序列生物信息学分析
２．３．１　小花碱茅犎犓犜２；１基因全长ｃＤＮＡ的特征　犘狌狋犎犓犜２；１全长１９１９ｂｐ，ＯＲＦ长１６４１ｂｐ，编码５４６个
氨基酸。３′非翻译区（３′ＵＴＲ）长２６０ｂｐ，５′非翻译区（５′ＵＴＲ）长１８ｂｐ（图４）。推测分子量为６０．５ｋＤａ，等电点
ＰＩ为９．０７。
２．３．２　小花碱茅与其他植物ＨＫＴ２；１氨基酸序列的多重比对　将小花碱茅ＰｕｔＨＫＴ２；１与其他植物 ＨＫＴ２；１
的氨基酸序列进行多重比较发现（图５，图６）：ＰｕｔＨＫＴ２；１与小麦ＴａＨＫＴ２；１的同源性最高为８５％，其次是大
麦ＨｖＨＫＴ２；１，同源性为８３％，接下来依次是芦苇ＰａＨＫＴ２；１ｅ、ＰａＨＫＴ２；１ｎ和ＰａＨＫＴ２；１ｕ，同源性都为
２４１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．２
６９％，水稻ＯｓＨＫＴ２；１同源性为６６％，与高粱ＳｂＨＫＴ
图３　犎犓犜２；１基因５′端片段的克隆
犉犻犵．３　５′犲狀犱犳狉犪犵犿犲狀狋狅犳犘狌狋犎犓犜２；１
２；１同源性最低为４６％，ＰｕｔＨＫＴ２；１与其他植物
ＨＫＴ２；１的核苷酸同源性都在７５％以上。
２．３．３　小花碱茅ＨＫＴ２；１跨膜区预测　跨膜区预测
分析表明：ＰｕｔＨＫＴ２；１蛋白可能含有１１个跨膜螺旋
片段（图４和图７），分别位于第１～１７、６２～８０、９４～
１１０、１２０～１４２、２０５～２２４、２３９～２５９、２７４～３０１、３３３～
３５２、３８９～４０９、４３６～４５４、４６３～４８６氨基酸残基间，跨
膜片段长度最大为２８个氨基酸残基，最小为１７个氨
基酸残基。植物 ＨＫＴ类蛋白含有４个 ＭＰＭ（ｍｅｍ
ｂｒａｎｅｐｏｒｅｍｅｍｂｒａｎｅ）基序，及８个跨膜结构域和中
图４　犘狌狋犎犓犜２；１基因核苷酸序列及其推测的氨基酸序列
犉犻犵．４　犖狌犮犾犲狅狋犻犱犲狊犲狇狌犲狀犮犲犪狀犱犱犲犱狌犮犲犱犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犘狌狋犎犓犜２；１
阴影序列代表跨膜片段；星号代表终止子。Ｓｈａｄｏｗｓｅｑｕｅｎｃｅｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｓｅｇｍｅｎｔｓ；Ａｓｔｅｒｉｓｋｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｈｅｓｔｏｐｃｏｄｏｎ．
３４１第２２卷第２期 草业学报２０１３年
图５　犘狌狋犎犓犜２；１与其他植物犎犓犜２；１氨基酸序列的多重比较
犉犻犵．５　犃犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲犪犾犻犵狀犿犲狀狋狅犳犘狌狋犎犓犜２；１狑犻狋犺狅狋犺犲狉狆犾犪狀狋狊犎犓犜２；１
　划线序列为４个Ｐ环；箭头所指为Ｐ环中保守的氨基酸残基；Ｐｕｔ：小花碱茅；Ｈｖ：大麦；Ｔａ：小麦；Ｐａ：芦苇；Ｏｓ：水稻；Ｓｂ：高粱。Ｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｌｉｎｅｄ
ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｆｏｕｒＰｌｏｏｐ；Ｔｈｅａｒｒｏｗｓｐｏｉｎｔｃｏｎｓｅｒｖｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄ；Ｐｕｔ：犘．狋犲狀狌犻犳犾狅狉犪；Ｈｖ：犎．狏狌犾犵犪狉犲；Ｔａ：犜．犪犲狊狋犻狏狌犿；Ｐａ：犘．犪狌狊狋狉犪犾犻狊；Ｏｓ：犗．狊犪
狋犻狏犪；Ｓｂ：犛．犫犻犮狅犾狅狉．
４４１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．２
间４个Ｐ环（Ｐｌｏｏｐ）［１１，３１，３２］。Ｋａｔｏ等［３２］对拟南芥Ａｔ
　图６　犘狌狋犎犓犜２；１与其他植物犎犓犜２；１氨基酸序列同源性分析
犉犻犵．６　犃犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲犺狅犿狅犾狅犵狔犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳
犘狌狋犎犓犜２；１狑犻狋犺狅狋犺犲狉狆犾犪狀狋狊犎犓犜２；１
ＨＫＴ１；１研究表明，采用软件分析其跨膜１１次，但实
验证明有３个片段并不跨膜，证明ＡｔＨＫＴ１；１跨膜８
次。多重比对发现，小花碱茅ＰｕｔＨＫＴ２；１与其他植
物ＨＫＴ２；１一样，具有４个保守Ｐ环序列（图５）：ＰＡ
ＹＩＤＭＬＦＬＳＴＳＡＬＴＶＳＧＬＳ（９１１０８）；ＰＢＩＶＬＦＳＭ
ＳＩＴＶＡＳＣＡＮＡＧＬＶ （２４２２６０）；ＰＣＴＶＮＡＬＦＭＶ
ＶＮＡＲＨＳＧＥＮ（３６８３８４）；ＰＤＴＬＮＭＩＦＥＶＩＳＡＹＧ
ＮＡＧＬＳ（４６８４８５）。
２．３．４　ＰｕｔＨＫＴ２；１蛋白质二级与三级结构预测　
蛋白二级结构预测表明：ＰｕｔＨＫＴ２；１ 蛋白含有
４７．９９％α螺旋、５．１３％β转角、３１．８７％无规则卷曲
和１５．０１％延伸链（图８）。此多肽链在二级结构的基
础上，进一步缠绕和折叠，形成其三级结构（图９）。
图７　小花碱茅犘狌狋犎犓犜２；１跨膜区预测
犉犻犵．７　犎狔犱狉狅狆犪狋犺狔狆犾狅狋犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狋犺犲狆狉犲犱犻犮狋犲犱狆狅犾狔狆犲狆狋犻犱犲狅犳犘狌狋犎犓犜２；１
　横坐标数字表示氨基酸残基，纵坐标数字表示亲水和疏水位点。图中数字表示ＰｕｔＨＫＴ２；１跨膜片段个数。Ａｍｉｎｏａｃｉｄｒｅｓｉｄｕｅｓａｒｅｎｕｍｂｅｒｅｄｏｎ
ｔｈｅｈｏｒｉｚｏｎｔａｌａｘｅｓ．Ｔｈｅｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃａｎｄｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｐｏｓｉｔｉｏｎｓａｒｅｐｌｏｔｔｅｄａｂｏｖｅａｎｄｂｅｌｏｗｔｈｅｏｒｄｉｎａｔｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｓｉｎｔｈｅｆｉｇｕｒｅｉｎｄｉ
ｃａｔｅｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｏｆｔｈｅｐｒｅｄｉｃｔｅｄｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｓｅｇｍｅｎｔｓｏｆＰｕｔＨＫＴ２；１．
３　讨论与结论
植物ＨＫＴ蛋白分子量多在６０ｋＤａ左右，氨基酸数目５００个左右，有的是单拷贝，或是一个小的基因家族，
通常受Ｋ＋饥饿或盐胁迫诱导，能在根、茎、叶和花中表达［６，３３］，关于 ＨＫＴ亚细胞定位主要以拟南芥研究较多，
ＡｔＨＫＴ１；１主要在木质部周围薄壁细胞中表达［３４］，韧皮部细胞中也有少量表达［２１］。关于 ＨＫＴ蛋白生理功能
报道较少，主要在异源表达系统中探索其对Ｋ＋、Ｎａ＋的不同转运特性，但异源表达结果与真正生理功能可能存
在巨大差异，如Ｈａｒｏ等［３５］认为大麦ＨｖＨＫＴ２；１在异源表达系统中可以转运Ｋ＋的特性在整株水平上不可能发
生。突变体对于研究ＨＫＴ蛋白在整株水平上的功能有重要意义，但是目前分离到的突变体仍然很少。
第二类ＨＫＴ蛋白中对小麦ＴａＨＫＴ２；１和水稻ＯｓＨＫＴ２；１研究较多，通常被认为是Ｋ＋－Ｎａ＋共转运体。
在异源表达系统中，小麦ＴａＨＫＴ２；１能够使 Ｋ＋吸收缺陷酵母在低 Ｋ＋条件下正常生长，对 Ｋ＋的选择性强于
Ｎａ＋，被认为是 Ｈ＋－Ｋ＋同向转运体［１６］，之后证明ＴａＨＫＴ２；１的转运特性依赖外部离子环境，实际上为Ｋ＋－
５４１第２２卷第２期 草业学报２０１３年
图８　犘狌狋犎犓犜２；１蛋白二级结构预测
犉犻犵．８　犘狉犲犱犻犮狋犻狅狀狅犳狋犺犲狊犲犮狅狀犱犪狉狔狊狋狉狌犮狋狌狉犲狅犳犘狌狋犎犓犜２；１
　螺旋（ｈ）、折叠（ｓ）、转角（ｔ）和卷曲（ｃ）分别由蓝色、红色、绿色和粉色表示Ｔｈｅｈｅｌｉｘ（ｈ），ｓｈｅｅｔ（ｓ），ｔｕｒｎ（ｔ）ａｎｄｃｏｉｌ（ｃ）ｗｅｒｅｉｎｄｉｃａｔｅｄｗｉｔｈｂｌｕｅ，
ｒｅｄ，ｇｒｅｅｎａｎｄｐｉｎｋｖｅｒｔｉｃａｌｌｉｎｅｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ
图９　犘狌狋犎犓犜２；１蛋白三级结构预测
犉犻犵．９　犘狉犲犱犻犮狋犻狅狀狅犳狋犺犲狋犲狉狋犻犪狉狔狊狋狉狌犮狋狌狉犲狅犳犘狌狋犎犓犜２；１
蓝色表示Ｃ端，红色表示Ｎ端ＴｈｅＣｔｅｒｍｉｎａｌｉｓｂｌｕｅ，ｔｈｅＮｔｅｒｍｉｎａｌｉｓｒｅｄ．
６４１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．２
Ｎａ＋转运体［３６］。Ｌａｕｒｉｅ等［３７］将反义的犜犪犎犓犜２；１转入小麦中，!源 ＨＫＴ强烈下调，转基因植株根部Ｎａ＋浓
度降低，耐盐性增强，因此认为小麦ＴａＨＫＴ２；１在整株水平上的功能是介导Ｎａ＋吸收。第二类 ＨＫＴ蛋白的４
个Ｐ环中都有１个甘氨酸位点，构成ＧＧＧＧ类型，而ＯｓＨＫＴ２；１第一个Ｐ环的甘氨酸被丝氨酸代替，构成Ｓ
ＧＧＧ类型，与第一类ＨＫＴ蛋白一致［１４］；在卵母细胞和酵母中，ＯｓＨＫＴ２；１对Ｎａ＋有强选择性［１８，３８］，但也介导
Ｋ＋转运［３９，４０］，研究发现，在无Ｋ＋条件下，ＯｓＨＫＴ２；１能够介导水稻根部对有益Ｎａ＋的吸收，部分代替Ｋ＋行使
生理功能［２３］。氨基酸多重比对发现，小花碱茅ＰｕｔＨＫＴ２；１属于ＧＧＧＧ类型（图５），且与小麦氨基酸同源性
最高，推测其在异源表达系统中应为Ｋ＋－Ｎａ＋共转运体。研究表明，ＨＫＴ蛋白由ＫｃｓＡ类Ｋ＋通道亚基经复制
加倍及融合进化而来，包含８个跨膜片段和中间４个Ｐ环结构［１１，３１，３２］，在Ｐ环或离Ｐ环很近的区域存在与Ｋ＋、
Ｎａ＋选择性吸收相关的多个位点［３２］，若在第一个Ｐ环过滤器位置为甘氨酸残基的 ＨＫＴ蛋白通常为Ｋ＋－Ｎａ＋
共转运体，而为丝氨酸残基的通常为Ｎａ＋单一转运体［４１］。分析表明，根据目前公认的 ＨＫＴ蛋白８次跨膜结构
模型，ＰｕｔＨＫＴ２；１的１１个跨膜片段有３个并不跨膜，且Ｐ环保守序列与有些跨膜片段重复，第四个Ｐ环后并没
有跨膜片段，这说明软件预测的跨膜片段只能作为参考，真正结构要后续实验证明。通过对其二级结构和三级结
构做进一步分析，有助于跨膜片段的精确定位。
下一步实验将在全长ｃＤＮＡ基础上，探究犘狌狋犎犓犜２；１的表达模式；通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交技术确定
犘狌狋犎犓犜２；１的拷贝数；采用ＧＵＳ染色技术确定犘狌狋犎犓犜２；１的亚细胞定位，对于研究其在小花碱茅中生理功
能有重要意义；构建植物表达载体，导入模式植物中，探索其在活体细胞中的生理功能，为进一步揭示小花碱茅的
耐盐机制奠定分子基础。到目前为止，单子叶植物中只在水稻里分离到了突变体犗狊犎犓犜２；１，如果能分离到小
花碱茅犘狌狋犎犓犜２；１突变体，将会成为研究其生理功能的重要工具。
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ｏｏｃｙｔｅｓａｎｄＮａ＋ ｕｐｔａｋｅｉｎ犛犪犮犮犺犪狉狅犿狔犮犲狊犮犲狉犲狏犻狊犻犪犲［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０００，１２２（４）：１２４９１２６０．
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ｔｈｅ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪Ｎａ＋／Ｋ＋ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇＡｔＨＫＴ１ｐｒｏｔｅｉｎ，ａｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙｏｆＫ＋ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ［Ｊ］．Ｐｒｏ
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８４１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．２
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［４１］　ＭｓｅｒＰ，ＨｏｓｏｏＹ，ＧｏｓｈｉｍａＳ，犲狋犪犾．Ｇｌｙｃｉｎｅｒｅｓｉｄｕｅｓｉｎｐｏｔａｓｓｉｕｍｃｈａｎｎｅｌｌｉｋｅｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙｆｉｌｔｅｒｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｐｏｔａｓｓｉｕｍｓｅ
ｌｅｃｔｉｖｉｔｙｉｎｆｏｕｒｌｏｏｐｐｅｒｓｕｂｕｎｉｔＨＫＴｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓｆｒｏｍｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓＵＳＡ，
２００２，９９（９）：６４２８６４３３．
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９４１第２２卷第２期 草业学报２０１３年