全 文 ：书犌狊犆犚犆犓基因转化农菁１号苜蓿及其耐盐性分析
刘莹，才华，刘晶，柏锡，纪巍，朱延明
（东北农业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨１５００３０）
摘要：犌狊犆犚犆犓基因是参与胁迫早期应答的钙／钙调素调控的受体类蛋白激酶基因，研究发现犌狊犆犚犆犓正向调控拟
南芥对ＮａＣｌ和ＡＢＡ胁迫的耐性，将耐盐蛋白激酶基因犌狊犆犚犆犓转化苜蓿，对于增强苜蓿的耐盐性具有重要的现
实意义。本研究采用农杆菌介导法将其转入农菁１号苜蓿，获得大量抗性植株。经 ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ检测证明
犌狊犆犚犆犓基因已整合到农菁１号苜蓿基因组中并在转基因植株中转录表达。对获得的２个转基因株系进行耐盐
性分析，在３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ条件下进行胁迫处理，测定处理０，３，６，９，１２，１５ｄ后的质膜透性、丙二醛（ＭＤＡ）和叶
绿素（Ｃｈｌ）含量，以及胁迫１５ｄ时的ＳＯＤ活性；并统计４００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理１５ｄ时各株系的死亡率。结果显
示，３００ｍｍｏｌ／Ｌ高盐胁迫１５ｄ后转基因苜蓿仍能正常生长，而野生型苜蓿则遭受盐害严重；转基因苜蓿的相对电
导率极显著低于野生型，ＭＤＡ 含量也显著低于野生型，而 Ｃｈｌ含量和ＳＯＤ活性都显著高于野生型；在４００
ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理下，２个转基因株系的死亡率分别为１３．３３％和１０．００％，明显低于野生型植株（６３．３３％）。表明
犌狊犆犚犆犓基因的导入提高了转基因苜蓿的耐盐性。
关键词：犌狊犆犚犆犓基因；农菁１号苜蓿；遗传转化；耐盐性
中图分类号：Ｓ８１６；Ｓ５５１＋．７；Ｑ９４３．２　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１３）０２０１５００８
　　土壤盐碱化和次生盐碱化问题在世界范围内广泛存在，全球盐碱地面积约９．５４亿ｈｍ２［１］。我国约有盐碱地
５．２７亿亩，其中具有农业利用潜力的盐碱荒地、盐碱障碍耕地面积近２亿亩，利用潜力巨大。而培育耐盐碱的作
物品种是推动以上地区农业生产发展的有效措施［２，３］。由于植物的耐胁迫性状大多属于数量性状，所以通过常
规育种方法改良植物的耐胁迫性状耗时费力，难以得到耐盐碱的作物品种。而随着分子生物学与基因工程技术
的不断发展，利用转基因技术向目标作物导入与抗逆相关的目的基因，已成为改良作物耐逆性、培育抗逆新品种
的重要途径之一。特别是导入在信号转导网络中起调控作用的抗逆基因，如蛋白激酶、转录因子基因，可达到综
合改良作物抗逆性的效果［４］。
紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）素有“牧草之王”的美誉，是世界上利用最早、栽培最广泛的优质豆科牧草，抗逆
性强，具有耐寒、抗旱、耐盐碱的特性［５１０］，是改良和利用盐碱地的重要植物之一。但苜蓿只适宜在轻度盐碱地种
植，在中、重度盐渍化土地上种植则受到很大限制［１１］，并且其高耐盐碱种质资源匮乏，鉴于此，为了提高苜蓿的耐
盐性，利用其近缘种质资源，通过基因工程手段将野生资源的耐盐基因导入栽培品种中，是解决这一问题的有效
途径［２，１０］。野生大豆（犌犾狔犮犻狀犲狊狅犼犪）具有丰富的耐逆基因资源［１２，１３］，本实验室前期构建了东北野生大豆低温、干
旱、高盐胁迫反应的基因表达谱，从中筛选出胁迫早期应答蛋白激酶基因犌狊犆犚犆犓，并证明犌狊犆犚犆犓 为钙／钙调
素调控的受体类蛋白激酶（ｒｅｃｅｐｔｏｒｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓ，ＲＬＫｓ）基因［１３］。ＲＬＫｓ是植物所特有的蛋白激酶［１４］，它
们能感受外部信号并通过蛋白磷酸化传递这些信号［１５］。一些ＲＬＫｓ也是ＣａＭ 结合蛋白激酶（ＣＢＫ），ＣＢＫ是
Ｃａ２＋／ＣａＭ介导的ＣａＭ信号转导系统中的重要组成因子［１６］，多种ＣＢＫ参与了植物对胁迫的反应［１３］。对于此类
ＲＬＫｓ，Ｙａｎｇ等［１５］从拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）中分离得到了钙调素结合受体类胞质激酶ＣＲＣＫ１（ｃａｌｍｏｄｕ
ｌｉｎｂｉｎｄｉｎｇｒｅｃｅｐｔｏｒｌｉｋｅｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｋｉｎａｓｅ），经盐渍、低温、ＡＢＡ和 Ｈ２Ｏ２ 处理后表达上升。Ｙａｎｇ等［１５］还从苜
蓿中分离到了ＣＲＣＫ（一种钙调素结合受体类胞质激酶）。Ｃｈａｒｐｅｎｔｅａｕ等［１７］报道了一种拟南芥ＣａＭ 结合受体
１５０－１５７
２０１３年４月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第２２卷　第２期
Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．２
收稿日期：２０１２０３０９；改回日期：２０１２０３３０
基金项目：黑龙江省高校科技创新团队建设计划（２０１１ＴＤ００５），国家自然科学基金（３１１７１５７８）和转基因生物新品种培育重大专项
（２００８ＺＸ０８００４００２）资助。
作者简介：刘莹（１９８３），女，满族，吉林辉南人，硕士。Ｅｍａｉｌ：ｔｗｉｎｓｙｉｎｇ２００９＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｙｍｚｈｕ２００１＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
类激酶ＡｔＣａＭＲＬＫ。２０１０年Ｙａｎｇ等［１８］又报道了ＣＲＬＫ１，指出这种Ｃａ２＋／ＣａＭ调节的受体类激酶在植物耐寒
中具有决定性的作用。ＤｅＦａｌｃｏ［１９］报道了一种从栽培大豆中分离的ＣａＭ 结合受体类激酶 ＧｍＣａＭＫ１。因此
犌狊犆犚犆犓 基因很可能参与了植物对胁迫的反应。本实验室前期研究表明犌狊犆犚犆犓 基因在拟南芥中的超量表达
可提高转基因植株对ＮａＣｌ和ＡＢＡ胁迫的抗性［１３］。
农菁１号苜蓿（犕．狊犪狋犻狏犪ｃｖ．ＮｏｎｇｊｉｎｇＮｏ．１）是适合东北地区种植的优质、抗寒、抗病、生物产量高的紫花
苜蓿新品种［２０］，为了获得耐盐性更强的转基因苜蓿，本研究采用农杆菌介导法将强组成型启动子Ｅ１２ＣａＭＶ３５Ｓ
调控的犌狊犆犚犆犓 基因转化到农菁１号苜蓿基因组内，并以受体亲本农菁１号为对照，对转犌狊犆犚犆犓 基因苜蓿进
行了耐盐性分析。
１　材料与方法
图１　植物表达载体狆犅犈犗犆犚犆犓质粒结构示意图
犉犻犵．１　犕犪狆狅犳狆犾犪狀狋犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狏犲犮狋狅狉狆犅犈犗犆犚犆犓
１．１　材料
根 癌 农 杆 菌 ＥＨＡ１０５ 和 植 物 表 达 载 体
ｐＢＥＯＣＲＣＫ由东北农业大学植物生物工程研究室保
存。转化受体为农菁１号苜蓿，种子由黑龙江省农业
科学院草业所提供。
１．２　农杆菌的转化
植物表达载体ｐＢＥＯＣＲＣＫ由本实验室构建，其
上含有犅犪狉植物选择标记基因和Ｅ１２ＣａＭＶ３５ｓ强启
动子调控的犌狊犆犚犆犓 基因，结构示意图见图１。采用
液氮冻融法将 ｐＢＥＯＣＲＣＫ 质粒导入根癌农杆菌
ＥＨＡ１０５感受态细胞，涂布在含有５０ｍｇ／Ｌ 利福平
（Ｒｉｆ）、５０ｍｇ／Ｌ链霉素（Ｓｔｒ）和１００ｍｇ／Ｌ卡那霉素
（Ｋａｎ）的固体ＹＥＢ培养基上培养。挑取单菌落进行
ＰＣＲ检测，确定质粒导入农杆菌中，获得可用于植物
遗传转化研究的工程农杆菌ＥＨＡ１０５（ｐＢＥＯＣＲＣＫ）。
农杆菌感受态的制备：
１）挑取农杆菌ＥＨＡ１０５单菌落接种于５ｍＬ含有５０ｍｇ／ＬＲｉｆ、５０ｍｇ／ＬＳｔｒ的ＹＥＢ液体培养基中，２８℃，
２００～２５０ｒ／ｍｉｎ振荡培养４８ｈ，至ＯＤ６００为０．６左右。
２）取上述菌液，按１∶１０比例接种于５０ｍＬ含有相应抗生素的ＹＥＢ液体培养基中，２８℃，２００～２５０ｒ／ｍｉｎ，
振荡培养５～６ｈ，至ＯＤ６００为０．６左右。
３）将菌液分装至１．５ｍＬ离心管中，冰浴３０ｍｉｎ。
４）５０００ｒ／ｍｉｎ，离心５ｍｉｍ。
５）弃上清，用１００μＬ０．０２ｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２ 溶液重悬菌体。
６）冻存于－８０℃冰箱中，备用。
冻融法转化根癌农杆菌：
１）取０．５～１．０μｇ（３～４μＬ）的重组质粒ＤＮＡ，加入到根癌农杆菌感受态细胞中，轻轻混合，冰浴５ｍｉｎ，迅
速投入液氮中冷冻５ｍｉｎ。
２）３７℃水浴融化，加入８００μＬＹＥＢ液体培养基，２８℃，１００ｒ／ｍｉｎ，振荡培养４ｈ。
３）４０００ｒ／ｍｉｎ，离心５ｍｉｎ，倒去大部分上清液，余１００μＬ左右，悬浮菌体。
４）涂布在含有５０ｍｇ／ＬＲｉｆ、５０ｍｇ／ＬＳｔｒ、１００ｍｇ／ＬＫａｎ的固体ＹＥＢ培养基上，２８℃培养４８～９６ｈ。
１．３　苜蓿的转化及再生植株的获得
采用农杆菌介导的子叶节法［２１］。将农菁１号苜蓿７～９日龄无菌苗子叶接种在含１．０ｍｇ／Ｌ６ＢＡ的ＭＳ固
体培养基上预培养２～３ｄ。农杆菌培养至对数生长期（ＯＤ６００约为０．５～０．６）侵染苜蓿子叶节，在添加１．０ｍｇ／Ｌ
１５１第２２卷第２期 草业学报２０１３年
６ＢＡ和１００μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮的 ＭＳ固体培养基上共培养３～４ｄ，然后转入含１．０ｍｇ／Ｌ６ＢＡ、０．５ｍｇ／Ｌ固
沙草（Ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ）和１００ｍｇ／Ｌ阿莫西林（Ａｍｏ）的 ＭＳ固体筛选培养基上培养。待不定芽长至２～３ｃｍ 时，转
移到含５０ｍｇ／ＬＡｍｏ的１／２ＭＳ培养基上生根。２周左右生出不定根，经驯化２～３ｄ后移栽。
１．４　转基因苜蓿的鉴定
１．４．１　ＰＣＲ检测　苜蓿叶片基因组ＤＮＡ的提取采用犈犪狊狔犘狌狉犲ＰｌａｎｔＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｔｒａｎｓ）。
以筛选标记犅犪狉基因的引物进行ＰＣＲ检测。犅犪狉基因引物Ｐ１：５′ＴＧＣＡＣＣＡＴＣＧＴＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＴＣＧ３′，
Ｐ２：５′ＣＣＡＧＣＴＧＣＣＡＧＡＡＡＣＣＣＡＣＧＴＣＡＴＧ３′。反应体系２５μＬ：１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ２．５μＬ，ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ
（各２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２μＬ，ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）３μＬ，Ｐ１（１０μｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，Ｐ２（１０μｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，模板ＤＮＡ１μＬ，
Ｔａｑ酶０．２μＬ。ＰＣＲ反应条件：９４℃预变性１０ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，６３℃退火３０ｓ，７２℃延伸３５ｓ，３０个循环后，
７２℃延伸１０ｍｉｎ。２．０％琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像系统观察并拍照，目的条带约为４５０ｂｐ。
１．４．２　ＲＴ－ＰＣＲ检测　苜蓿总ＲＮＡ的提取使用ＲＮＡｐｒｅｐｐｕｒｅＰｌａｎｔＫｉｔ（ＴＩＡＮＧＥＮ）。ｃＤＮＡ的合成采用
Ｍ－ＭＬＶ逆转录酶（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。以苜蓿犌犘犇犎（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．ＥＦ５２６０９５）作为内参基因用于调平，其
特异引物为５′ＧＴＧＧＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧＧＴＴＧＴＴＡＴ３′，５′ＣＴＧＧＧＡＡＴＧＡＴＧＴＴＧＡＡＧＧＡＡＧ３′。犌狊犆犚犆犓
基因引物为Ｓ：５′ＧＣＡＣＣＡＧＧＧＡＧＡＣＡＡＣＣＡＣＧ３′，ＡＳ：５′ＣＡＴＡＴＧＴＣＴＴＡＴＧＣＣＴＡＴＴＣＴＴＣＣＴＡＣＣ３′。
ＲＴ－ＰＣＲ反应体系２５μＬ：１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ２．５μＬ，ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２μＬ，ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）
１μＬ，Ｓ（１０μｍｏｌ／Ｌ）０．５μＬ，ＡＳ（１０μｍｏｌ／Ｌ）０．５μＬ，ｃＤＮＡ１μＬ，Ｔａｑ酶０．２μＬ。反应条件：９４℃预变性１０
ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，６０℃退火３０ｓ，７２℃延伸４０ｓ，３２个循环后，７２℃延伸１０ｍｉｎ，４℃终止反应。
１．５　转基因苜蓿的扩繁和ＮａＣｌ胁迫处理
实验于２０１１年７月中旬—９月底在东北农业大学香坊农场２８号温室内进行，设置３次重复。
选取生长状态良好的转基因和非转基因（野生型）农菁１号苜蓿的枝条，分剪成带２～３个腋芽的茎段，浸泡
于生根粉溶液中２ｈ左右，插入底部打孔的盛有普通土∶草炭土∶蛭石（１∶１∶１）的塑料大盆内１．５ｃｍ左右，定
期喷灌。１０ｄ左右长出不定根，扦插３周后挑选根系发达、长势健壮的扦插苗移出，洗净根部，移栽于装有混合基
质（珍珠岩∶蛭石＝１∶１）的口径９．５ｃｍ、高７．０ｃｍ的营养钵中，每钵１株苗，每２４株单株置于一大托盘，每盘
浇３Ｌ１／２Ｈｏｇｌａｎｄ营养液，每２ｄ补加０．５Ｌ营养液。缓苗１个月后，挑选长势健壮一致的植株进行胁迫。将
转基因和野生型材料各分成３组，每组１０株单株，设３次重复，用含０，３００，４００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的１／２Ｈｏｇｌａｎｄ
营养液持续胁迫培养，每盘浇３Ｌ，每２ｄ补加０．５Ｌ。其中选定３００ｍｍｏｌ／Ｌ作为胁迫浓度，４００ｍｍｏｌ／Ｌ为致死
浓度。于胁迫前（０ｄ）和胁迫３，６，９，１２，１５ｄ取相同部位功能叶片测定质膜透性、丙二醛（ＭＤＡ）和叶绿素（Ｃｈｌ）
含量，以及胁迫１５ｄ时的ＳＯＤ活性，对于１次重复每个指标随机测定３个单株，取３次重复的平均值。并统计
４００ｍｍｏｌ／Ｌ处理１５ｄ时各株系的存活率。
１．６　生理生化指标的测定
采用电导仪法［２２］测定质膜透性，硫代巴比妥酸法［２２］测定 ＭＤＡ含量，８０％丙酮研磨提取比色法［２２］测定Ｃｈｌ
含量，氮蓝四唑（ＮＢＴ）光化还原法［２２］测定ＳＯＤ活性。
２　结果与分析
２．１　再生植株的获得及鉴定
用农杆菌ＥＨＡ１０５（ｐＢＥＯＣＲＣＫ）转化农菁１号苜蓿共获得１１０株抗性植株。
２．１．１　ＰＣＲ检测　因犌狊犆犚犆犓 与苜蓿犆犚犆犓 相似程度较高，其氨基酸的一致性达７４％，所以用犅犪狉基因引物
进行扩增。以质粒ＤＮＡ为阳性对照，以水和非转化植株为阴性对照，对１１０株抗性植株进行ＰＣＲ检测（图２所
示为部分结果），有４６％呈阳性，扩增出约４５０ｂｐ的目的条带。初步表明基因犌狊犆犚犆犓 已经整合到农菁１号苜
蓿基因组中。
２．１．２　ＲＴ－ＰＣＲ检测　对部分ＰＣＲ阳性植株进行ＲＴ－ＰＣＲ分析，以野生型农菁１号苜蓿为对照，以苜蓿
ＧＰＤＨ 为内参，检测基因犌狊犆犚犆犓 的表达情况（图３所示为部分结果），可以看出基因犌狊犆犚犆犓 在转基因植株中
得到了超量表达。
２５１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．２
图２　转犌狊犆犚犆犓抗性植株的犘犆犚鉴定
犉犻犵．２　犘犆犚犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狉犲狊犻狊狋犪狀狋狆犾犪狀狋狊狋犺犪狋狋狉犪狀狊犳狅狉犿犲犱狑犻狋犺犌狊犆犚犆犓
　Ｍ：ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；＋：质粒ＤＮＡＰｌａｓｍｉｄＤＮＡ；－：水对照Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ（ｄｄＨ２Ｏ）；ＣＫ：非转基因农菁１号苜蓿阴性对照Ｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｎｅｇａ
ｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；１～２７：转犌狊犆犚犆犓抗性植株 Ｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｌａｎｔｓｔｈａｔｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｗｉｔｈ犌狊犆犚犆犓．
ＰＣＲ及ＲＴ－ＰＣＲ的检测结果表明基因犌狊犆犚犆犓
图３　转犌狊犆犚犆犓基因植株的犚犜－犘犆犚检测
犉犻犵．３　犚犜－犘犆犚犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犌狊犆犚犆犓狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋狊
　　　ＷＴ：野生型植株 Ｗｉｌｄｔｙｐｅｐｌａｎｔｓ；ＮＣ７９，ＮＣ１９，ＮＣ９：转基因植株
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ．
已经整合到农菁１号苜蓿基因组中并能够在转基因
植株中转录表达。
２．２　转基因苜蓿的耐盐性分析
选取ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ检测均呈阳性的２个
转基因植株（ＮＣ１９和ＮＣ７９）及野生型（ＷＴ）苜蓿进
行扦插扩繁，以３００和４００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ分别作为
胁迫浓度和致死浓度，对转基因与野生型株系进行
耐盐性分析。
２．２．１　盐胁迫下苜蓿的生长状况　处理１５ｄ后，在正常条件下（０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ），转基因苜蓿与野生型（ＷＴ）
苜蓿生长状态良好且大致相同（图４Ａ），表明犌狊犆犚犆犓 基因的导入并未对苜蓿的生长发育造成影响。在３００
ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ胁迫条件下，野生型苜蓿盐害严重，生长发育受抑制，叶片逐渐变黄、卷曲、萎蔫，而转基因苜蓿只
受到轻微影响，仍能正常生长，耐盐表现明显好于野生型（图４Ｂ）。在４００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理下，大部分野生型
苜蓿死亡，死亡率为６３．３３％，存活植株的生长也严重受抑制；转基因苜蓿只有极少数植株死亡，ＮＣ１９和ＮＣ７９
的死亡率分别为１３．３３％和１０．００％，存活植株的生长虽有所抑制，但表现明显好于野生型（图４Ｃ）。
２．２．２　盐胁迫下相对电导率及丙二醛（ＭＤＡ）含量变化　在非盐分胁迫条件下，各株系细胞内电解质相对渗出
率较低，野生型（ＷＴ）和转基因苜蓿间没有明显差异（未发表数据）。在３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理下，质膜透性增大
（图５Ａ）；随着胁迫时间的延长，野生型和转基因苜蓿的相对电导率都呈现出增加的动态变化趋势；胁迫期间，２
个转基因株系的相对电导率相近且低于野生型，胁迫９ｄ时差异显著（犘＜０．０５），胁迫１２，１５ｄ时差异极显著
（犘＜０．０１）。表明高盐胁迫下转基因苜蓿的细胞膜受到的伤害较小，质膜完整性较好，具有较高的耐盐性。
在０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理下，野生型（ＷＴ）和转基因苜蓿间的 ＭＤＡ含量差异不显著（未发表数据）。在３００
ｍｍｏｌ／Ｌ的盐胁迫下，各株系的 ＭＤＡ含量升高（图５Ｂ），其变化趋势与电导率的变化基本一致，呈动态变化，２个
转基因株系的 ＭＤＡ含量相近且低于野生型，１５ｄ时差异显著（犘＜０．０５），说明高盐胁迫下转基因苜蓿的膜脂过
氧化程度较低，遭受的伤害较轻，耐盐能力有了显著地提高。
２．２．３　盐胁迫下叶绿素（Ｃｈｌ）含量变化　在非盐分胁迫条件下，各株系的Ｃｈｌ含量基本一致（未发表数据）。经
３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理后，各株系的Ｃｈｌ含量降低，随胁迫时间的延长呈逐渐下降趋势（图５Ｃ）；胁迫期间，２个
转基因株系的Ｃｈｌ含量相近且高于野生型（ＷＴ），胁迫１２和１５ｄ时，差异达到了显著水平（犘＜０．０５）。表明高
盐胁迫下，转基因苜蓿叶绿体的结构和功能受到的伤害较小，耐盐性较好。
２．２．４　盐胁迫下超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性变化　胁迫１５ｄ后，在０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理下，各株系的ＳＯＤ活
性较低且无明显差异；在３００ｍｍｏｌ／Ｌ高盐胁迫下，各株系的ＳＯＤ活性增强，２个转基因株系的ＳＯＤ活性相近
３５１第２２卷第２期 草业学报２０１３年
图４　盐胁迫１５犱植株生长状况
犉犻犵．４　犜犺犲狆犲狉犳狅狉犿犪狀犮犲狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋狊犪狀犱狑犻犾犱狋狔狆犲狆犾犪狀狋狊（犠犜）狌狀犱犲狉狊犪犾狋狊狋狉犲狊狊犳狅狉１５犱犪狔狊
且高于野生型（ＷＴ），差异显著（犘＜０．０５）（图６）。犌狊犆犚犆犓 基因的表达提高了转基因苜蓿的ＳＯＤ活性，有利于
保护细胞内的蛋白和膜系统免受氧化胁迫的伤害，增强其在高盐环境下的耐受能力。
３　讨论
植物对逆境耐性的强弱往往不取决于某一单个因子，其性状受众多因子的综合影响，通过分子育种导入个别
功能基因对植物抗逆性的改良效果十分有限，即使进行多基因的联合导入，各基因间的相互协调问题也很难解
决。而一些在信号转导网络中起调控作用的蛋白质因子，尤其是蛋白激酶，其单基因的表达就可以激活下游众多
功能基因的转录和表达，达到多个功能基因的效果，同时各基因间的调节问题可以由细胞自身解决［１３］。因而将
４５１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．２
图５　３００犿犿狅犾／犔盐胁迫下相对电导率（犃）、丙二醛含量（犅）及叶绿素含量（犆）的变化
犉犻犵．５　犆犺犪狀犵犲狅犳狉犲犾犪狋犻狏犲犲犾犲犮狋狉犻犮犪犾犮狅狀犱狌犮狋犻狏犻狋狔（犃），犕犇犃（犅）犪狀犱犮犺犾狅狉狅狆犺狔犾犮狅狀狋犲狀狋（犆）狌狀犱犲狉狊犪犾狋狊狋狉犲狊狊狅犳３００犿犿狅犾／犔
　表示差异显著（犘＜０．０５），表示差异极显著（犘＜０．０１）。下同。Ｔｈｅａｎｄｓｔａｎｄｆｏｒｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（犘＜０．０５）ａｎｄｅｘｔｒｅｍｅｌｙ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（犘＜０．０１），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
具有较强抗逆性的野生大豆中克隆得到的耐盐蛋白激
图６　３００犿犿狅犾／犔盐胁迫１５犱犛犗犇活性的变化
犉犻犵．６　犆犺犪狀犵犲狅犳犛犗犇狌狀犱犲狉狊犪犾狋狊狋狉犲狊狊狅犳３００犿犿狅犾／犔犳狅狉１５犱犪狔狊
酶基因犌狊犆犚犆犓 转化农菁１号苜蓿，对于增强苜蓿的
耐盐性具有重要的现实意义。
植物的耐盐性研究是选育、培育耐盐植物品种的
基础，前期对农菁１号苜蓿耐盐性研究的结果表明其
耐盐性较强，能够抵抗持续１５ｄ的２００ｍｍｏｌ／Ｌ的盐
胁迫，但难以耐受３００ｍｍｏｌ／Ｌ的盐胁迫，特别是４００
ｍｍｏｌ／Ｌ高盐胁迫。因此在对获得的２个转基因株系
进行耐盐性分析时，选定３００ｍｍｏｌ／Ｌ作为胁迫浓度
且以４００ｍｍｏｌ／Ｌ作为致死浓度。紫花苜蓿是典型异
花授粉四倍体植物，通过种子繁殖难以获得优良性状
５５１第２２卷第２期 草业学报２０１３年
一致的后代群体，特别是转基因苜蓿的纯合体［２３，２４］。因此，本研究采用无性扦插繁殖的方式扩繁材料。
当质膜的选择透性因逆境伤害而增大时，细胞内的电解质外渗，相对电导率变化可反映出质膜的伤害程度和
植物抗逆性的强弱［２２，２５］。盐害等逆境条件下植物往往发生膜脂过氧化作用，ＭＤＡ是膜脂过氧化作用的最终产
物之一，其含量也可反映植物遭受逆境伤害的程度［２２，２６３２］。叶绿体是受盐胁迫影响最敏感的细胞器之一［２８］，盐
胁迫条件下，植物叶片内盐分积累，叶绿素酶活性增加，叶绿素分解，光合作用下降［３３］。此外，盐胁迫会导致细胞
内活性氧累积，产生氧化胁迫［３３］。ＳＯＤ在植物抗氧化胁迫中具有清除氧自由基、维持活性氧代谢平衡的功能，
是防止膜脂过氧化，保护膜系统的关键酶［３１，３４］，在氧化胁迫反应早期起主要调节作用［３３］。因而，以上生理生化指
标可用来衡量植物的耐盐性。
本研究将犌狊犆犚犆犓 基因转入农菁１号苜蓿，获得了２个转基因株系，经３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ持续胁迫１５ｄ后
仍能正常生长，而野生型则盐害严重，且盐胁迫期间转基因苜蓿的相对电导率、ＭＤＡ和叶绿素含量以及ＳＯＤ活
性均优于野生型；４００ｍｍｏｌ／Ｌ胁迫１５ｄ后，转基因苜蓿的存活率和耐盐表现均好于野生型，表明犌狊犆犚犆犓 基因
在农菁１号苜蓿中的超表达明显提高了转基因苜蓿的耐盐性。
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犜狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲犌狊犆犚犆犓犵犲狀犲犻狀狋狅犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪犮狏．犖狅狀犵犼犻狀犵
犖狅．１犪狀犱狊犪犾狋狋狅犾犲狉犪狀犮犲犪狀犪犾狔狊犻狊犻狀狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋狊
ＬＩＵＹｉｎｇ，ＣＡＩＨｕａ，ＬＩＵＪｉｎｇ，ＢＡＩＸｉ，ＪＩＷｅｉ，ＺＨＵＹａｎｍｉｎｇ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＮｏｒｔｈｅａｓｔＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ１５００３０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｈｅｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｋｉｎａｓｅｇｅｎｅｏｆｗｉｌｄｓｏｙｂｅａｎ（犌狊犆犚犆犓）ｗａｓｓｅｌｅｃｔｅｄｂｅｃａｕｓｅｏｆｔｈｅｇｅｎｅｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｓｕｎｄｅｒｓａｌｉｎｉｔｙ，ｄｒｏｕｇｈｔａｎｄｃｏｌｄｓｔｒｅｓｓｅｓ，ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｉｎｏｕｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｏｖｅｒｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ犌狊犆犚犆犓ｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊ｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎｅｎｈａｎｃｅｄｐｌａｎｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏｈｉｇｈｓａｌｉｎｉｔｙａｎｄＡＢＡ．
Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｏｎｅｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙａ３５Ｓｐｒｏｍｏｔｅｒ（ｎａｍｅｄａｓｐＢＥＯＣＲＣＫ）ｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃ
ｔｅｄｔｏｔｒａｎｓｆｅｒｔｈｅｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｉｎｔｏ犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪ｃｖ．ＮｏｎｇｊｉｎｇＮｏ．１ｓｅｐａｒａｔｅｌｙｂｙｔｈｅＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｄｉ
ａｔｅｄｍｅｔｈｏｄ．Ｍａｎｙｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｅｅｄｌｉｎｇｓｏｆ犌狊犆犚犆犓ｈａｖｅｂｅｅｎｏｂｔａｉｎｅｄ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＰＣＲａｎｄＲＴ－ＰＣＲ
ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅ犌狊犆犚犆犓ｇｅｎｅｗａｓｎｏｒｍａｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ．Ａｆｔｅｒ犌狊犆犚犆犓ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犕．狊犪
狋犻狏犪ｃｖ．ＮｏｎｇｊｉｎｇＮｏ．１ｗｅｒｅｓｔｒｅｓｓｅｄｗｉｔｈ０，３００ａｎｄ４００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，ｗｅｃｏｍｐａｒｅｄｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犕．狊犪狋犻狏犪ｔｏ
ｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犕．狊犪狋犻狏犪ｂｙａｓｓｅｓｓｉｎｇｓｐｅｃｉｆｉｃｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ．Ｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｍｅｍｂｒａｎｅｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ，
ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌ，ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＭＤＡ，ａｎｄｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＳＯＤｉｎｐｌａｎｔｓｗｈｉｃｈｗｅｒｅｓｔｒｅｓｓｅｄｗｉｔｈ３００
ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｔｏｇｅｔｈｅｒｗｉｔｈｔｈｅｄｅａｔｈｒａｔｅｆｒｏｍａ４００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌｓｔｒｅｓｓ．Ｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犕．
狊犪狋犻狏犪ｈａｄａｇｒｅａｔｅｒｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆｓａｌｉｎｉｔｙｓｔｒｅｓｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犌狊犆犚犆犓ｇｅｎｅ；犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪ｃｖ．ＮｏｎｇｊｉｎｇＮｏ．１；ｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ
７５１第２２卷第２期 草业学报２０１３年