全 文 ：书瓜果腐霉毒素对多年生黑麦草
的致病作用机理初步研究
徐娇１，许文超１，康占海１，郑辉２，张金林１
（１．河北农业大学植物保护学院，河北 保定０７１００１；２．河北农业大学海洋学院，河北 秦皇岛０６６００３）
摘要：为了明确瓜果腐霉毒素对多年生黑麦草的致病作用机制，本试验对瓜果腐霉毒素处理后多年生黑麦草的叶
绿素、β胡萝卜素、光合系统Ⅱ、丙二醛、超氧自由基、希尔反应活力、根系活力以及叶片含水量进行了测定。结果发
现，毒素处理后的多年生黑麦草叶绿素、β胡萝卜素遭到了破坏，犉狏／犉犿，犉犿 随剂量增加而降低，新速Ⅱ犉狅 几乎不
变，而英斯派犉狅 随剂量的增大而增大，丙二醛含量随除草毒素剂量的增大而增大，超氧自由基含量随除草毒素剂
量的增大而增大，同时发现２种多年生黑麦草的希尔反应活力、叶片含水量、根系活力也受到了不同程度的影响。
关键词：瓜果腐霉；致病机理；除草毒素
中图分类号：Ｓ４３５．４；Ｓ５４３＋．６０８　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２００９）０４０１８１０６
　 植物病原物毒素是病原物在代谢过程中产生的、在生理浓度范围内对植物具有明显致病或致毒作用，并对植
物组织有明显损伤作用的非酶类化合物［１］。根据植物病原真菌毒素对寄主致病范围的不同，可将其分为寄主专
化性和非寄主专化性毒素。植物病原菌毒素的作用机理是相当复杂的，它包括毒素的作用位点、作用方式及对寄
主生理的影响。病原菌毒素的作用位点从目前的研究情况来看主要是在寄主的细胞质膜、线粒体、叶绿体等细胞
结构上，毒素破坏细胞的膜体系，严重影响植物的代谢过程及能量改变，对寄主蛋白、核酸、酶等引起一系列不良
反应，导致生理失调，细胞死亡以至整个植株枯死。非寄主专化性毒素则没有特异的靶位点［２］。张金林等［３，４］从
多年生黑麦草（犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲）上分离得到的瓜果腐霉毒素对多年生黑麦草具有很强的破坏作用，杨亚君等［５］
就瓜果腐霉毒素对多年生黑麦草的抗病性进行了研究，发现多年生黑麦草对毒素敏感。已有许多试验针对植株
在逆境条件下的生理指标进行研究，进而研究其抗逆途径［６～８］，本试验是在前期研究的基础上，通过对光合系统
Ⅱ、丙二醛、超氧自由基、希尔反应活力、根系活力以及叶片含水量等指标的测定，以期明确瓜果腐霉毒素对多年
生黑麦草的致病机理，为了解多年生黑麦草与瓜果腐霉的相互作用以及对瓜果腐霉的控制提供理论依据。
１　材料与方法
１．１　材料
１．１．１　供试菌种　瓜果腐霉（犘狔狋犺犻狌犿犪狆犺犪狀犻犱犲狉犿犪狋狌犿）ＰＡ１菌株，分离自河北农业大学西校区多年生黑麦草
草坪中发病的病株。
１．１．２　供试植物　多年生黑麦草的２个品种：英斯派（Ｉｎｓｐｉｒｅ）和新速Ⅱ（ＮｕｓｐｅｅｄⅡ）。
１．２　方法
１．２．１　瓜果腐霉毒素的制备　将按参考文献［３］的方法制备得到的瓜果腐霉培养滤液２７００ｍＬ注入装有８０ｇ
已处理好的ＨＰＤ５００（购自沧州宝恩化工有限公司）树脂柱中，待树脂吸附饱和后用５００ｍＬ１０％乙醇洗脱得到
含有除草毒素的洗脱液，用乙酸乙酯等体积萃取２次后，合并有机相浓缩，用２ｍＬ甲醇定容后用高效液相色谱
Ａｇｉｌｅｎｔ１２００ＬＣ检测，ＡｇｉｌｅｎｔＺＯＲＢＡＸＥｃｌｉｐｓｅＸＤＢＣ１８柱４．６ｍｍ×１５０ｍｍ×０．４５μｍ，流动相为水（Ａ）－甲
醇（Ｂ），梯度条件：初始流动相浓度为２％（Ｂ），在２５ｍｉｎ内线性梯度变化到１００％（Ｂ），流速为１ｍＬ／ｍｉｎ，柱温为
２５℃，检测波长为２５４ｎｍ。检测后用半制备柱进行制备。半制备柱为ＮａｖｅｐａｋＣ１８，柱长３００ｍｍ×７．８ｍｍ，内
第１８卷　第４期
Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．４
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
１８１－１８６
２００９年８月
 收稿日期：２００８０９２７；改回日期：２００８１０２９
基金项目：河北省自然基金（Ｃ２００７０００４６４）和国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２００６ＡＡ１０Ａ２１４）资助。
作者简介：徐娇（１９８３），女，河北辛集人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｘｕｊｉａｏ４３１＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｊｉｎｌｉｎ＠ｈｅｂａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
径６μｍ（美国 Ｗａｔｅｒｓ公司）；流动相为水∶甲醇＝９２∶８，流速为１ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长为２５４ｎｍ。收集洗脱液，
浓缩后备用。
１．２．２　多年生黑麦草的种植方法　参考杨亚君等［５］的方法。
１．２．３　病菌毒素对多年生黑麦草叶片的处理　采用１．２．２的多年生黑麦草种植方法，待多年生黑麦草生长至６
ｃｍ时，选取长势一致的叶片进行处理，分别将毒素甲醇稀释液１５，３０和４５μＬ，用微量注射器将其均匀的点到
１０片杂草叶片上，以甲醇为对照，处理后置于培养室中培养，培养条件２５℃，１２ｈ光照，１２ｈ黑暗，处理４８ｈ后，
取０．５ｇ叶片用于试验。
１．２．４　病菌毒素对多年生黑麦草叶片中叶绿素含量的影响　用１．２．３的方法处理黑麦草后，将处理后的黑麦草
叶片剪下，放入试管中，同时加入５ｍＬ丙酮∶乙醇∶水＝４．５∶４．５∶１（Ｖ／Ｖ）的浸提液，在黑暗条件下浸提２４ｈ
后取上清液，以浸提液为空白对照，用７２１型分光光度计（上海光谱仪器有限公司）在６４５和６６３ｎｍ测定吸光度，
用下列公式计算叶绿素含量［９，１０］。
犆（μｇ／ｍＬ）＝８．０２×犗犇６６３＋２０．２０×犗犇６４５
１．２．５　病菌毒素对多年生黑麦草叶片中β胡萝卜素含量的影响　用１．２．３的方法处理黑麦草后，将处理后的黑
麦草叶片剪下，放入试管中同时加入５ｍＬ９０％丙酮浸提液，黑暗条件下浸提２４ｈ，取上清液，以浸提液为空白对
照，在４５２ｎｍ测定吸光度，用下列公式计算对β胡萝卜素的相对破坏率。
β胡萝卜素的相对破坏率（％）＝１－处理后吸光度／对照吸光度
１．２．６　病菌毒素对多年生黑麦草抗病性指标的测定　用１．２．３的方法处理多年生黑麦草后，用羟胺氧化法测定
超氧自由基含量的变化［１１］；用硫代巴比妥酸法测定丙二醛的含量［１２］；用邻菲罗林盐酸盐显色法测定希尔反应活
力［１３］；并采用英国 Ｈａｎｓａｔｅｃｈ公司生产的ＦＭＳ２型调制式荧光仪对犉犿、犉狅、犉狏／犉犿 荧光参数进行测定。
１．２．７　病菌毒素对多年生黑麦草含水量的影响　分别用１５，３０和４５μＬ的毒素处理多年生黑麦草叶片各１５
片，处理６ｈ后，剪下迅速称重，然后将叶片放到盛有蒸馏水的烧杯中，饱和１２ｈ后称饱和重，之后置于通风烘箱
中１０５℃烘干至恒重，称干重，并按照以下公式计算水分亏损率［１４］。
水分亏损率（％）＝１－
鲜重（ｇ）－干重（ｇ）
饱和重（ｇ）－干重（ｇ）×１００
１．２．８　病菌毒素对多年生黑麦草根系活力的影响　在直径５ｃｍ的培养皿中放入同皿底大小的双层滤纸，灭菌
后备用。将英斯派和新速Ⅱ种子用１０％ Ｈ２Ｏ２ 消毒１０ｍｉｎ，然后用蒸馏水冲干净，播种于放双层滤纸的培养皿
中，置于２５℃培养，露白后，去掉培养皿盖，置于室温下继续培养，待叶片长到２ｃｍ时，按照１．２．３对黑麦草叶片
进行处理，分别将１５，３０和４５μＬ毒素均匀涂抹到大小均匀一致的英斯派和新速Ⅱ叶子各１５片，每处理重复３
次，处理６ｈ后，剪下根长度１ｃｍ（从根尖开始），放入小烧杯中，采用ＴＴＣ染色法测定根系活力［１５］，用７２１型分
光光度计测定吸光度，作为根系活力评价指标。
２　结果与分析
２．１　瓜果腐霉毒素对多年生黑麦草叶绿素含量的影响
经过毒素处理后，英斯派中叶绿素含量均显著低于对照，且随毒素处理剂量的增加而降低（表１），当毒素处
理剂量为１５，３０和４５μＬ时英斯派叶绿素含量分别为１０．７８，１０．２８和９．３０μｇ／ｍＬ；同样发现，不同剂量的毒素
处理新速Ⅱ后叶绿素的含量也随剂量的增大而出现降低现象，但１５μＬ的毒素处理叶绿素含量与对照之间差异
不显著，而另外２个处理则显著低于对照。由此说明，经毒素处理后新速Ⅱ和英斯派的叶绿素遭到了不同程度的
破坏。
２．２　瓜果腐霉毒素对多年生黑麦草β胡萝卜素含量的影响
毒素处理后多年生黑麦草叶片中β胡萝卜素相对破坏率随剂量的增加而逐渐增大（表１）。英斯派经１５，３０
和４５μＬ毒素处理过的β胡萝卜素相对破坏率分别为１２．１％，１３．５％和２０．９％，３个剂量处理之间存在显著性
差异；新速Ⅱ经１５，３０和４５μＬ毒素处理过的β胡萝卜素相对破坏率分别为８．３％，１１．９％和１７．４％，３个剂量处
理之间也存在显著性差异。由此可以看出毒素处理后对多年生黑麦草叶片中β胡萝卜素也有一定程度的破坏。
２８１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．４
２．３　瓜果腐霉毒素对多年生黑麦草叶片中超氧自由基含量的影响
经不同剂量的毒素处理后自由基的含量均显著高于对照处理，随着毒素剂量的增大，多年生黑麦草叶片中超
氧自由基的含量逐渐增加，且同样剂量下，新速Ⅱ超氧自由基含量高于英斯派（图１）。ＣＫ，１５，３０和４５μＬ的毒
素处理过的新速Ⅱ超氧自由基含量分别为０．０５，０．９３，０．９９和１．３１ｇ／ｍｉｎ，而同样条件下ＣＫ，１５，３０和４５μＬ的
毒素处理过的英斯派超氧自由基含量为０．０２，０．２１，０．２７和０．３１ｇ／ｍｉｎ。
２．４　瓜果腐霉毒素对多年生黑麦草叶片中丙二醛含量的变化
供试的２种黑麦草的空白对照处理丙二醛含量均为０。而经过毒素处理后，英斯派叶片中丙二醛含量随毒
素剂量的增大而增大（图２），分别用１５，３０和４５μＬ毒素处理后的丙二醛含量分别为０．０１３，０．０２６和０．０３２
μｍｏｌ／Ｌ；新速Ⅱ的丙二醛含量也随毒素剂量的增大而增大，分别用１５，３０和４５μＬ处理后的丙二醛含量分别为
０．０２６，０．０９７和０．２２６μｍｏｌ／Ｌ。由此可知，经毒素处理后新速Ⅱ和英斯派的光合作用膜遭到了氧化破坏，但对
新速Ⅱ的破坏强度要高于英斯派。
２．５　瓜果腐霉毒素对多年生黑麦草希尔反应活力的影响
经过毒素处理后希尔反应活力均显著低于对照处理（表１）。英斯派的希尔反应活力随毒素剂量的增大而减
弱，ＣＫ，１５，３０和４５μＬ毒素处理后的希尔反应活力分别为６７．１，５６．７，４５．２和３０．８μｍｏｌＯ２／（ｍｇ叶绿素·ｈ），
各处理间存在显著性差异；同样新速Ⅱ的希尔反应活力随毒素剂量的增大而减弱，ＣＫ，１５，３０和４５μＬ处理后的
希尔反应活力分别为７７．８，６２．６，４９．２和３７．７μｍｏｌＯ２／（ｍｇ叶绿素·ｈ），各处理间也存在显著性差异。由此可
知，多年生黑麦草经瓜果腐霉毒素处理后希尔反应活力受到了影响。
表１　毒素处理后对多年生黑麦草的影响
犜犪犫犾犲１　犈犳犳犲犮狋狅犳犺犲狉犫犻犮犻犱犪犾犮狅犿狆狅狀犲狀狋狅狀犔．狆犲狉犲狀狀犲
剂量
Ｄｏｓｅ
（μＬ）
英斯派Ｉｎｓｐｉｒｅ
叶绿素含量
Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｃｏｎｔｅｎｔ
（μｇ／ｍＬ）
β胡萝卜素相对破坏率
Ｒｅｌａｔｉｖｅｌｏｓｓｏｆ
βｃａｒｏｔｅｎｅ（％）
希尔反应活力
Ｈｉｌａｃｔｉｖｉｔｙ
（μｍｏｌＯ２／ｍｇｃｈｌ·ｈ）
新速Ⅱ ＮｕｓｐｅｅｄⅡ
叶绿素含量
Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｃｏｎｔｅｎｔ
（μｇ／ｍＬ）
β胡萝卜素相对破坏率
Ｒｅｌａｔｉｖｅｌｏｓｓｏｆ
βｃａｒｏｔｅｎｅ（％）
希尔反应活力
Ｈｉｌａｃｔｉｖｉｔｙ
（μｍｏｌＯ２／ｍｇｃｈｌ·ｈ）
ＣＫ １１．７３ａ ０ ６７．１ａ １３．９９ａ ０ ７７．８ａ
１５ １０．７８ｂ １２．１ｃ ５６．７ｂ １３．１２ａ ８．３ｃ ６２．６ｂ
３０ １０．２８ｂ １３．５ｂ ４５．２ｃ １０．９４ｂ １１．９ｂ ４９．２ｃ
４５ ９．３０ｃ ２０．９ａ ３０．８ｄ ９．９８ｃ １７．４ａ ３７．７ｄ
　注：同列中不同字母表示犘＜０．０５水平差异显著，下同。
　Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｃｏｌｕｍｎｉｎｄｉｃａｔｅｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ犘＜０．０５，ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
图１　超氧自由基含量的变化
犉犻犵．１　犜犺犲犮犺犪狀犵犲狅犳狊狌狆犲狉狅狓犻犱犪狀犻狅狀狉犪犱犻犮犪犾犮狅狀狋犲狀狋
图２　丙二醛含量的变化
犉犻犵．２　犜犺犲犮犺犪狀犵犲狅犳犕犃犇犮狅狀狋犲狀狋
３８１第１８卷第４期 草业学报２００９年
２．６　瓜果腐霉毒素对多年生黑麦草叶绿素荧光参
图３　新速Ⅱ和英斯派犉犿，犉狅 值
犉犻犵．３　犜犺犲狏犪犾狌犲狅犳犉犿，犉狅狅犳犖狌狊狆犲犲犱Ⅱ犪狀犱犐狀狊狆犻狉犲
图４　新速Ⅱ与英斯派水分亏损率趋势
犉犻犵．４　犔狅狊狊狉犪狋犲狅犳狑犪狋犲狉犮狅狀狋犲狀狋狅犳犖狌狊狆犲犲犱Ⅱ犪狀犱犐狀狊狆犻狉犲
数的影响
新速Ⅱ犉狅随毒素剂量的增大变化不大（图３），
犉犿 随毒素剂量的增加逐渐降低，ＣＫ，１５，３０和４５
μＬ处理后新速Ⅱ犉犿 值分别为１１６０，７６２，５３９和
４６４。同时测得犉狏／犉犿 随剂量的增加而逐渐减小，
ＣＫ，１５，３０和４５μＬ 处理后的 犉狏／犉犿 值分别为
０．８３９，０．７６２，０．６６７和０．６２３。英斯派犉狅 随毒素剂
量的增大略有增加，分别为１９８，２１９，２４３和２５２，犉犿
随剂量的增加逐渐降低，ＣＫ，１５，３０和４５μＬ处理
后英斯派 犉犿 值分别为１１４９，９８１，７８３和６１７，
犉狏／犉犿分别为０．７８１，０．７５０，０．７２０和０．６７９。由此
可知，多年生黑麦草光合系统Ⅱ的电子传递以及反
应中心光能转换效率均受到了影响。
２．７　瓜果腐霉毒素对多年生黑麦草含水量的影响
多年生黑麦草的水分亏损率随毒素剂量的增大
而增大（图４），且水分亏损率与剂量呈一定的线性
关系。新速Ⅱ空白对照，１５，３０和４５μＬ毒素处理
后的叶片水分相对亏损率分别为１５．１６％，１７．１１％，
１９．５９％和２０．７３％。英斯派空白对照，１５，３０和４５
μＬ毒 素 处 理 后 叶 片 水 分 相 对 亏 损 率 分 别 为
１０．７７％，１４．３４％，１７．０６％和２０．００％。
２．８　瓜果腐霉毒素对多年生黑麦草根系活力的影
响
通过ＴＴＣ法测定根系活力，结果发现，随瓜果
腐霉毒素剂量的增大吸光度值减小，根系受到的损
伤越大，根系活力越差。新速Ⅱ空白对照，１５，３０和
４５μＬ毒素处理后根系甲醇浸提液的吸光度值为别
为０．０６１，０．０４３，０．０２９和０．０１５。英斯派空白对照，１５，３０和４５μＬ毒素处理后根系甲醇浸提液的吸光度值分别
为０．０４９，０．０６２，０．０７３和０．０８１，由此可知毒素处理影响了多年生黑麦草的根系活力。
３　讨论
病原物的致病性和寄主的抗病性决定病害的发生和严重程度。病菌产生的对植物有害的物质统称为致病因
子，近几十年研究成果表明，植物病原物致病因子主要包括酶、毒素、激素等［１６］。很多研究认为，病菌致病因子的
多少及其活力大小影响其致病力强弱。毒素是由病原菌产生的对寄主有毒害作用的次生代谢物，由于在病菌致
病过程中起着重要作用而倍受人们关注［１７］。研究病原真菌毒素及其作用机理对于了解寄主与病原物的互相作
用，寻找新的病害防治途径都具有十分重要的意义。
光合系统Ⅱ（ＰＳⅡ）原初光能转换效率（犉狏／犉犿）反映ＰＳⅡ反应中心光能转换效率［１８］，由本试验结果可知，
犉狏／犉犿 随毒素剂量的增加逐渐减小，这说明反映中心光能转换效率减低。初始荧光（犉狅）是ＰＳⅡ反应中心处于完
全开放时的荧光产量，它与叶片叶绿素浓度有关，非光化学能量耗散易造成犉狅 的降低，而光合机构被破坏又使其
升高，所以该参数的变化趋势可以反映引起光合机构变化的内在机制，本试验中英斯派品种犉狅 随毒素剂量的增
加而增加，犉狅 的上升表明ＰＳⅡ反应中心受到破坏或发生可逆失活。而对于新速Ⅱ犉狅 几乎没有变化，这说明毒素
对新速Ⅱ的反映中心可能没有影响，同样为多年生黑麦草，但对于毒素的反映不相同可能由于品种不同的原因，
具体原因还有待于深入研究。最大荧光（犉犿）是ＰＳⅡ反应中心处于完全关闭时的荧光产量，可反映通过ＰＳⅡ的
电子传递情况，本试验中２个多年生黑麦草品种的犉犿 均随毒素剂量的增加而降低，说明ＰＳⅡ的电子传递受到了
４８１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．４
影响。
植物器官衰老或在逆境中遭到伤害，往往会造成膜脂的过氧化作用，丙二醛是膜脂过氧化作用的最终分解产
物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。本试验发现瓜果腐霉毒素处理黑麦草后，光合作用膜的氧化破
坏，是通过测定丙二醛含量来进行衡量的。结果发现新速Ⅱ的破坏强度要高于英斯派，新速Ⅱ与英斯派同属于黑
麦草的２个品种，但毒素对两者的破坏作用却不相同，说明这２种黑麦草在逆境中的抗病能力是不同的，在英斯
派这一品种中的抗逆因子到底是什么，还有待于进一步研究，这对黑麦草的抗病机制具有很重要的意义。试验发
现瓜果腐霉毒素确实影响了光合系统Ⅱ，影响了光能的转化率，电子传递等这些作用位点，但研究中并未弄清楚
是这些作用部位共同作用，还是由于一个作用位点受到抑制而影响到其他作用位点还有待于进一步研究，至于电
子传递的具体作用部位也有待于进一步确定。
有很多学者对致病性的研究多考虑对酶类的影响［１９，２０］，而本试验是通过测定毒素处理多年生黑麦草后对光
合系统、丙二醛、超氧自由基、叶绿素、水分含量和根系活力的影响来考察致病性，但致病作用机理还与很多因素
有关，诸如呼吸作用、蛋白质和核酸合成、酶活性等，在这些方面瓜果腐霉毒素对这２种多年生黑麦草的致病作用
是否相同，以及对其他品种的多年生黑麦草的致病机理还有待于进一步研究。
对毒素处理多年生黑麦草后含水量的变化进行了测定，结果发现，随毒素剂量的增大水分亏损率增大，由此
可知，多年生黑麦草的水分代谢受到了影响，但具体是毒素直接破坏了多年生黑麦草的水分代谢，还是由于破坏
了其他作用部位，造成叶片的萎蔫而间接影响了水分的运输和传递，还有待于进一步研究。
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５８１第１８卷第４期 草业学报２００９年
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２．ＯｃｅａｎＣｏｌｅｇｅｏｆＨｅｂｅｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｑｉｎｈｕａｎｇｄａｏ０６６００３，Ｃｈｉｎａ）
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６８１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．４