全 文 ：书垂穗披碱草 犕犃犇犛犫狅狓基因犠犕８克隆及分析
张妙青，张吉宇，刘志鹏，王彦荣，张磊
（草地农业生态系统国家重点实验室 兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州７３００２０）
摘要：通过同源克隆从垂穗披碱草中获得了 ＭＡＤＳｂｏｘ基因家族犠犕８基因的全长ｃＤＮＡ序列，命名为犈狀犠犕８
（Ｇｅｎｂａｎｋ登录号为ＪＦ６８３８４６）。序列分析表明，该ｃＤＮＡ全长１１９６ｂｐ，开放阅读框共编码２７５个氨基酸，具有典
型的 ＭＡＤＳｂｏｘ结构域以及半保守的Ｋ区，是 ＭＩＫＣ型 ＭＡＤＳｂｏｘ基因，分析认为其与花发育和果实成熟等有
关。犈狀犠犕８与小麦的犠犕８、犃犌犔２９和犳狉狌犻狋犳狌犾犾犻犽犲基因氨基酸的推导序列的相似性分别高达９５．６２％，９６．７２％
和９６．２８％。采用ＤＮＡＭＡＮ软件进行系统进化树分析显示，犈狀犠犕８基因与小麦的犜犪犠犕８进化关系最近，与拟
南芥的犃狋犠犕８、犃狋犃犌犔２９进化关系较远。垂穗披碱草 ＷＭ８蛋白分子量为１３７２６．７Ｄａ，理论等电点为９．１４，为亲
水性的碱性蛋白，无跨膜结构域，定位于细胞核中，其空间结构主要由α螺旋、无规则卷曲和延伸链构成。研究结
果可为进一步从分子水平探明垂穗披碱草花发育、种子成熟等机制提供参考。
关键词：垂穗披碱草；ＭＡＤＳｂｏｘ；犠犕８基因；序列分析；蛋白结构
中图分类号：Ｓ５４３＋．９０３；Ｑ９４３．２　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１２）０４０１４１１０
　　生殖过程是高等植物生活史中最重要的阶段，也是提高植物种子产量的关键时期。因此，与植物生殖密切
相关的花器官的发育和种子成熟等一直是植物学家的研究重点之一。近年来，通过对双子叶模式植物拟南芥
（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）［１］、金鱼草（犃狀狋犻狉狉犺犻狀狌犿犿犪犼狌狊）［２］等花器官的研究，初步揭示了植物花发育遗传调控的
分子机制，提出了著名的花器官发育ＡＢＣ模型［３，４］，后经进一步深入研究逐渐发展为 ＡＢＣＤＥ模型［５７］。ＡＢＣＤＥ
模型中大部分基因属于 ＭＡＤＳｂｏｘ基因，它们编码的转录因子调控不同基因的表达［８］。ＭＡＤＳｂｏｘ基因具有高
度保守的ＭＡＤＳｂｏｘ结构域和半保守的能形成卷曲螺旋的Ｋ区［９］，主要决定花器官的形成，同时参与胚珠、种皮
及果实发育的调控［１０１３］。在整个被子植物中，ＭＡＤＳｂｏｘ基因的功能是保守的，大部分都参与花发育的调
控［１４，１５］。Ｚｈａｏ等［１６］对小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）４２个 ＭＡＤＳｂｏｘ基因进行了分离以及比对分析，结果表明多种
ＭＡＤＳｂｏｘ基因存在于小麦组织中，以特定模式表达，对小麦的生长和发育可能起重要的作用。对水稻（犗狉狔狕犪
狊犪狋犻狏犪）７５个 ＭＡＤＳｂｏｘ基因的研究表明，３１个基因在水稻生殖阶段优先积累，其中１２个在种子、６个在穗部特
定表达［１７］。有关禾本科牧草相关基因的研究较少。Ｐｒｅｓｔｏｎ和Ｋｅｌｏｇｇ［１８］重建了禾本科植物ＭＡＤＳｂｏｘ转录因
子犉犝犔１和犉犝犔２的进化史，并确定了其犃犘犈犜犃犔犃１／犉犚犝犐犜犉犝犔犔犾犻犽犲基因序列和表达的演化。
垂穗披碱草（犈犾狔犿狌狊狀狌狋犪狀狊）是禾本科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）小麦族（Ｔｒｉｔｉｃｅａｅ）披碱草属（犈犾狔犿狌狊）的多年生根茎疏
丛型优质牧草，其抗寒能力强、粗蛋白含量高且适口性好［１９，２０］。主要分布在欧亚大陆和北美洲北部，垂直分布从
海拔几米的海滩一直到海拔５２００ｍ以上的喜马拉雅山区，我国西藏以及西北、华北等地区均有野生分布，是草
原和草甸的重要组成部分［２１］。我国西北高寒、湿润地区，垂穗披碱草栽培较多，主要用于建植人工草地和放牧草
地。近年来，对垂穗披碱草的种子产量、遗传多样性以及栽培放牧等方面的研究较多［２２２５］，而关于 ＭＡＤＳｂｏｘ
基因的研究多集中在拟南芥、金鱼草等模式植物以及水稻、小麦等农作物中，很少涉及到草类植物，垂穗披碱草中
的 ＭＡＤＳｂｏｘ基因尚未见报道。对垂穗披碱草中 ＭＡＤＳｂｏｘ基因的研究，不仅有助于阐明其控制花发育的分
子机制，具有潜在的种子生产价值，而且作为麦类作物的野生近缘种遗传资源，对于丰富麦类作物基因资源库具
有重要的经济利用价值［２６］。
第２１卷　第４期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
１４１－１５０
２０１２年８月
收稿日期：２０１１０４２１；改回日期：２０１１０７０４
基金项目：国家“９７３”课题（编号：２００７ＣＢ１０８９０４），兰州大学中央高校基本科研费专项基金（编号：ｌｚｕｊｂｋｙ２００９１０８，ｌｚｕｊｂｋｙ２００９４），“十一五”
国家科技支撑计划子课题（编号：２００８ＢＡＤＢ３Ｂ０３４）资助。
作者简介：张妙青（１９８４），女，陕西岐山人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｐｌａｎｔｓｅｅｄ＠ｙｅａｈ．ｎｅｔ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｙｒｗａｎｇ＠ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
１　材料与方法
１．１　材料
垂穗披碱草种子于２００８年采自甘肃甘南草原，采集后保存在农业部牧草与草坪草种子质量监督检验测试中
心（兰州）低温种子库。２００９年在兰州大学草地农业科技学院盆栽，苗期采集幼嫩叶片，用液氮处理，然后置于
－８０℃ 超低温保存备用。
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ－ＰＣＲＫｉｔ（ＴａＫａＲａ），ＲＮｅａｓｙＰｌａｎｔＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ），ＤＮＡＭａｒｋｅｒ，ＤＮＡ凝胶回收
试剂盒，ＤＨ５α感受态细胞，ｐＧＭＴ克隆试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司。引物由北京赛百盛生物工
程公司合成，其他试剂采用国产或进口分析纯。
１．２　方法
１．２．１　总 ＲＮＡ的提取　参照ＲＮｅａｓｙＰｌａｎｔＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）使用说明，提取垂穗披碱草幼嫩叶片的总
ＲＮＡ，用紫外分光光度计Ｎａｎｏｄｒｏｐ进行ＲＮＡ纯度测定，并通过琼脂糖凝胶电泳检验ＲＮＡ完整性。
１．２．２　引物设计　检索ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（简称ＮＣＢＩ）上已公布的与垂穗披碱草
近缘种的犠犕８及其同源基因的蛋白序列，多序列比对找出高度同源区域，用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０进行简并引物
设计，从垂穗披碱草扩增该基因的核心片段。上游引物为Ｐ１：５′ＡＲＷＳＮＧＡＲＧＧＮＡＡＹＴＧＧＴ３′，下游引物为
Ｐ２：５′ＲＣＡＮＡＣＲＴＴＹＴＧＹＴＧＮＧＧ３′，预测片段长度为４４９ｂｐ。
用获得的该基因核心序列在 ＮＣＢＩ上Ｂｌａｓｔ，取相似性最高的全长序列，用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０设计引物，上
游引物为Ｐ３：５′ＧＣＡＴＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＴＣＡＣＣＧ３′，下游引物为Ｐ４：５′ＴＡＡＧＣＣＡＡＧＣＡＧＧＴＣＡＴＣＣＡＴＧＣ
ＴＡ３′，以从垂穗披碱草扩增该基因的全长片段，预测片段长度为１１９４ｂｐ。
１．２．３　ｃＤＮＡ第一条链的合成　参照ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ－ＰＣＲＫｉｔ（ＴａＫａＲａ）使用说明，取２μＬ垂穗披碱草叶
片总ＲＮＡ，以ＯｌｉｇｏｄＴ为引物，进行ｃＤＮＡ第一条链的合成。第１步反应体系为１０μＬ：ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（１０
ｍｍｏｌ／Ｌｅａｃｈ），１μＬ；Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）Ｐｒｉｍｅｒ（２．５μｍｏｌ／Ｌ），１μＬ；总ＲＮＡ２μＬ；ＲｎａｓｅＦｒｅｅｄＨ２Ｏ至１０μＬ。反应为
６５℃５ｍｉｎ。第２步反应体系为２０μＬ：上述反应产物，１０μＬ；５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ
ＴＭＢｕｆｆｅｒ，４μＬ；ＲｎａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０
Ｕ／μＬ），０．５μＬ；ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ
ＴＭ ＲＴａｓｅ（ｆｏｒ２ｓｔｅｐ），０．５μＬ；ＲｎａｓｅＦｒｅｅｄＨ２Ｏ至２０μＬ。反转录反应为４２℃３０
ｍｉｎ，９５℃５ｍｉｎ。
１．２．４　ｃＤＮＡ核心序列的ＰＣＲ扩增　以合成的ｃＤＮＡ第一链产物为模板，参照 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ－ＰＣＲＫｉｔ
（ＴａＫａＲａ）使用说明，ＰＣＲ反应体系５０μＬ：１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ，５μＬ；ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ），２μＬ；ＥｘＴａｑ
ＨＳ（５Ｕ／μＬ），０．５μＬ；引物Ｐ１和Ｐ２，各２μＬ；反转录的总ｃＤＮＡ１μＬ；ｄｄＨ２Ｏ补至５０μＬ。反应程序：９４℃预变
性１ｍｉｎ，然后以９４℃３０ｓ，４５℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ进行３５个循环，７２℃延伸１０ｍｉｎ。取５μＬ扩增产物用１％琼
脂糖凝胶电泳鉴定。
１．２．５　全长序列的ＰＣＲ扩增　以合成的ｃＤＮＡ第一链产物为模板，参照ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ－ＰＣＲＫｉｔ（ＴａＫａ
Ｒａ）使用说明，ＰＣＲ反应体系５０μＬ：１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ，５μＬ；ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ），２μＬ；ＥｘＴａｑＨＳ（５
Ｕ／μＬ），０．５μＬ；引物Ｐ３和Ｐ４，各１μＬ；反转录的总ｃＤＮＡ，１μＬ；ｄｄＨ２Ｏ补至５０μＬ。反应程序：９４℃ 预变性１
ｍｉｎ，然后以９４℃３０ｓ，５８℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ进行３０个循环，７２℃延伸１０ｍｉｎ。取５μＬ扩增产物用１％琼脂糖
凝胶电泳鉴定。
１．２．６　测序、生物信息学分析以及蛋白结构分析　ＰＣＲ产物进行琼脂糖凝胶回收后连接在ｐＧＭＴ载体上，转
化到ＤＨ５α感受态细胞中，ＬｕｒｉａＢｅｒｔａｎｉ（简称ＬＢ）固体培养基培养，蓝白斑筛选挑取阳性克隆，通过ＰＣＲ鉴定
后送上海生工生物工程有限公司进行测序。
通过ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．Ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）网站进行Ｂｌａｓｔ检索，利用 ＤＮＡＭＡＮ６．０和Ｓｅ
ｑｕｅｎｃｈｅｒ４．９Ｄｅｍｏ生物技术软件进行序列翻译、多重比对以及同源树等分析。
蛋白质的一级结构利用ＰｒｏｔＰａｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉｂｉｎ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ）进行分析，包括氨基酸残基
数目、氨基酸组成、蛋白质相对分子质量、理论等电点以及疏水性等参数；利用 ＴＭＨＭＭ２．０Ｓｅｒｖｅ（ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ）和ＴＭｐｒｅｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＴＭＰＲＥＤ）２个软件
２４１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
同时对该蛋白序列的跨膜区域进行分析；用 ＰＳＯＲＴ ＷＷＷＳｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｐｓｏｒｔ．ｎｉｂｂ．ａｃ．ｊｐ／）中的 ＰＳＯＲＴ
Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ工具进行细胞定位。利用 ＮＰＳＡ（ｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／）中的 ＭＬＲＣ程序在线分析蛋白质二级
结构中α螺旋、无规则卷曲和延伸链等结构的预测。通过Ｅｘｐａｓｙ（ｈｔｔｐ：／／ａｕ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／）网站中Ｓｗｉｓｓ
Ｍｏｄｅｌ程序进行同源建模，推测垂穗披碱草 ＷＭ８蛋白的三维结构。
２　结果与分析
图１　垂穗披碱草总犚犖犃的琼脂糖凝胶电泳
犉犻犵．１　犈犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狉犲狊狌犾狋狅犳狋狅狋犪犾犚犖犃犳狉狅犿犈．狀狌狋犪狀狊
２．１　垂穗披碱草犠犕８基因全长序列的ＰＣＲ扩增
用ＲＮｅａｓｙＰｌａｎｔＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）提取的垂
穗披碱草叶片的总ＲＮＡ（图１），ＲＮＡ２８Ｓ与１８Ｓ条带
明显，效果理想，满足进一步实验所需。
利用提取的总 ＲＮＡ，ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ－ＰＣＲ
Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ），以 Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）为引物，进行反转录所得
的产物为模板，以设计的引物Ｐ１、Ｐ２进行垂穗披碱草
犠犕８基因核心片段的ＰＣＲ扩增，获得了与预期大小
相符的条带（图２），经测序确认，片段长度为４４３ｂｐ。以引物Ｐ３、Ｐ４，进行其全长序列的ＰＣＲ扩增，获得了与预
期大小相符的特异条带（图３），经测序确认，片段长度为１１９６ｂｐ。由于所设计引物为同源比对保守区域，ＰＣＲ
扩增结果较为特异，大小亦与预期结果相符，虽有部分非特异性扩增条带，但其浓度、大小均不符。
图２　犈狀犠犕８基因犮犇犖犃核心序列电泳分析
犉犻犵．２　犈犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狅犳犈狀犠犕８犵犲狀犲
犮犇犖犃犮狅狉犲狊犲狇狌犲狀犮犲犳狉狅犿犈．狀狌狋犪狀狊
图３　犈狀犠犕８基因犮犇犖犃全长序列电泳分析
犉犻犵．３　犈犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狅犳犈狀犠犕８犵犲狀犲
犮犇犖犃犳狌犾犾犲狀犵狋犺狊犲狇狌犲狀犮犲犳狉狅犿犈．狀狌狋犪狀狊
２．２　犈狀犠犕８基因全序列分析
对分离得到的基因片段进行测序，获得了一段完整的ｃＤＮＡ序列，全长１１９６ｂｐ，其中包含一段８２８ｂｐ的开
放阅读框，编码２７５个氨基酸残基的蛋白质，具有典型的植物 ＭＡＤＳｂｏｘ基因的结构［８］。将此片段命名为犈狀
犠犕８，在ＧｅｎＢａｎｋ注册，登录号为ＪＦ６８３８４６。
从结构上可将犈狀犠犕８基因推导的氨基酸序列分成４个区（图４），第１～６１个氨基酸为高保守的 ＭＡＤＳ
ｂｏｘ结构区域，是识别 ＤＮＡ 顺式作用元件并与之结合的一段氨基酸序列；第７５～１７４个氨基酸为半保守的 Ｋ
区；位于 ＭＡＤＳｂｏｘ区和Ｋ区之间的部分为Ｉ区，是 ＭＡＤＳｂｏｘ区和Ｋ区的衔接部分；Ｋ区的下游为极不保守
的Ｃ末端。
将获得的ｃＤＮＡ序列在ＮＣＢＩ上进行ＢＬＡＳＴＸ比较，其编码的蛋白质与其他多种植物 ＭＡＤＳｂｏｘ基因蛋
３４１第２１卷第４期 草业学报２０１２年
白具有很高的同源性，其中与小麦的犠犕８（９０％）、犃犌犔２９（９５％）和大麦的 犕犃犇犛８（９３％）相似性最高。犈狀
犠犕８与二倍体小麦（犜．犪犲狊狋犻狏狌犿）的犜犪犠犕８、犜犪犃犌犔２９、六倍体小麦（犜．犿狅狀狅犮狅犮犮狌犿）的犳狉狌犻狋犳狌犾犾犻犽犲基因推
导的氨基酸序列进行比对，相似性分别高达９５．６２％（２６２／２７４），９６．７２％（２６５／２７４）和９６．２８％（１８１／１８８）（图５）。
犈狀犠犕８与小麦的５０ＭＡＤＳ基因、拟南芥的犃狋犠犕８及犃狋犃犌犔２９基因编码的蛋白质序列经由ＤＮＡＭＡＮ
软件推演的系统进化树显示，不同组的基因被分到不同的分支，犈狀犠犕８属于 ＭＩＫＣ型 ＭＡＤＳｂｏｘ基因，与
犜犪犠犕８进化关系最近，其次依次是犜犪犃犌犔２９、犜犪犞犚犜１、犜犪犃犌犔１０，与拟南芥的犜犪犠犕８、犜犪犌犔２９进化关系较
远（图６）。
图４　犈狀犠犕８基因犮犇犖犃核苷酸序列和推导氨基酸序列
犉犻犵．４　犖狌犮犾犲狅狋犻犱犲狊犲狇狌犲狀犮犲狊犪狀犱犱犲犱狌犮犲犱犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狊犳狅狉犈狀犠犕８犵犲狀犲犮犇犖犃犳狉狅犿犈．狀狌狋犪狀狊
　粗体ＡＴＧ表示起始密码子；粗体ＴＧＡ表示终止子；粗下划线为 ＭＡＤＳｂｏｘ区；细下划线为Ｋ区。ＴｈｅＡＴＧｉｎｉｔｉａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅＴＧＡｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ｃｏｄｏｎｉｓｉｎｂｏｌｄ；ＴｈｅＭＡＤＳｂｏｘｄｏｍａｉｎｉｓｉｎｂｏｌｄｕｎｄｅｒｌｉｎｅ；ＴｈｅＫｂｏｘｄｏｍａｉｎｉｓｉｎｓｅｒｉｆｕｎｄｅｒｌｉｎｅ．
４４１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
图５　垂穗披碱草的犈狀犠犕８与小麦的犠犕８、犃犌犔２９、犳狉狌犻狋犳狌犾犾犻犽犲基因氨基酸序列比对
犉犻犵．５　犜犺犲犮狅犿狆犪狉犻狊狅狀狅犳狋犺犲犱犲犱狌犮犲犱犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狊犫犲狋狑犲犲狀犈狀犠犕８狅犳犈．狀狌狋犪狀狊，
犠犕８犪狀犱犃犌犔２９狅犳犜．犪犲狊狋犻狏狌犿，犳狉狌犻狋犳狌犾犾犻犽犲狅犳犜．犿狅狀狅犮狅犮犮狌犿
２．３　垂穗披碱草 ＷＭ８蛋白质结构分析
２．３．１　垂穗披碱草 ＷＭ８蛋白氨基酸序列分析　垂穗披碱草 ＷＭ８蛋白由２７５个氨基酸组成，分子量为
１３７２６．７Ｄａ，理论等电点为９．１４，是一个碱性蛋白。对其氨基酸组成的分析结果表明，该蛋白分子式为Ｃ１３５３
Ｈ２１９２Ｎ４１２Ｏ４２７Ｓ１４，原子总数为４３９８。碱性氨基酸残基总数（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）为３８，酸性氨基酸残基总数（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）
为３１。
２．３．２　垂穗披碱草 ＷＭ８蛋白疏水性和跨膜分析以及细胞定位　垂穗披碱草犠犕８氨基酸序列疏水性分析表
明，该蛋白的氨基酸中大部分为亲水性氨基酸，疏水性的总平均值（ＧＲＡＶＹ）为－０．９３５，所以该蛋白为亲水性蛋
白（图７）。
利用ＴＭＨＭＭ２．０Ｓｅｒｖｅｒ和ＴＭｐｒｅｄ对该蛋白跨膜区域进行分析，结果表明跨膜区域为０。跨膜区域中氨
基酸序列的期望值大于１８时，蛋白才有跨膜区域。该蛋白在跨膜区域中的氨基酸序列期望值仅为０．０１３２６。因
此，垂穗披碱草 ＷＭ８蛋白没有跨膜区域。
通过ＰＳＯＲＴＷＷＷＳｅｒｖｅｒ中的工具ＰＳＯＲＴＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，对垂穗披碱草 ＷＭ８蛋白进行细胞定位显示，该
蛋白存在于细胞核（ｎｕｃｌｅｕｓ）中的可能性为７６．０％，存在于过氧化物酶体（ｍｉｃｒｏｂｏｄｙｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ）、线粒体杂基
空间（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｍａｔｒｉｘｓｐａｃｅ）和叶绿体类囊体膜（ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｔｈｙｌａｋｏｉｄｍｅｍｂｒａｎｅ）中的可能性较小，分别为
３０％，１０％和１０％。该蛋白是否存在于细胞壁膜间隙、外膜及内膜等都无法确定。
５４１第２１卷第４期 草业学报２０１２年
图６　犈狀犠犕８与小麦５０个 犕犃犇犛基因、犃狋犠犕８和犃狋犃犌犔２９序列系统进化树分析
犉犻犵．６　犃狀犪犾狔狊犻狊狅犳狋犺犲狆犺狔犾狅犵犲狀狋犻犮狉犲犾犪狋犻狅狀狊犺犻狆犪犿狅狀犵狋犺犲犱犲犱狌犮犲犱犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳犈狀犠犕８，
５０犕犃犇犛犵犲狀犲狊狅犳犜．犪犲狊狋犻狏狌犿，犃狋犠犕８犪狀犱犃狋犃犌犔２９
表示犈狀犠犕８。ｉｓｔｈｅ犈狀犠犕８．
２．３．３　垂穗披碱草 ＷＭ８蛋白二级和三级结构预测　通过 ＮＰＳＡ（ｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／）对垂穗披碱草
ＷＭ８蛋白的二级结构进行预测（图８），分析预测结果显示，垂穗披碱草 ＷＭ８蛋白的二级结构中主要为α螺旋、
无规则卷曲和延伸链，所占比例分别为５２．３６％，３７．８２％和９．８２％。可见，α螺旋、无规则卷曲和延伸链构成了
其二级结构的重要部分。
通过Ｅｘｐａｓｙ（ｈｔｔｐ：／／ａｕ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／）网站中ＳｗｉｓｓＭｏｄｅｌ程序对垂穗披碱草 ＷＭ８蛋白的三维空间
结构进行了预测，结果表明（图９），该蛋白的二级结构中主要为α螺旋、无规则卷曲和延伸链，所占比例依次为α
螺旋最多，无规则卷曲次之，延伸链最少，无β折叠存在。这与通过ＮＰＳＡ（ｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／）对该蛋白
进行的二级结构的预测结果一致。
６４１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４
图７　垂穗披碱草 犠犕８蛋白的疏水性分析
犉犻犵．７　犜犺犲犺狔犱狉狅狆犺狅犫犻犮犻狋狔犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犠犕８狆狉狅狋犲犻狀犳狉狅犿犈．狀狌狋犪狀狊
图８　垂穗披碱草 犠犕８蛋白的二级结构预测
犉犻犵．８　犜犺犲狊犲犮狅狀犱犪狉狔狊狋狉狌犮狋狌狉犲狆狉犲犱犻犮狋犻狅狀狅犳犠犕８狆狉狅狋犲犻狀犳狉狅犿犈．狀狌狋犪狀狊
图９　垂穗披碱草 犠犕８蛋白的三维结构预测
犉犻犵．９　犜犺犲狋犺狉犲犲犱犻犿犲狀狊犻狅狀犪犾狊狋狉狌犮狋狌狉犲狆狉犲犱犻犮狋犻狅狀狅犳犠犕８狆狉狅狋犲犻狀犳狉狅犿犈．狀狌狋犪狀狊
７４１第２１卷第４期 草业学报２０１２年
３　讨论
本研究根据 ＭＡＤＳ区设计简并性引物，利用 ＲＴ－ＰＣＲ的方法获得犈狀犠犕８基因ｃＤＮＡ 片段，然后利用与
ＮＣＢＩ上已公布的犠犕８及其同源基因的序列进行比对，选取与其相似性最高的全长序列设计特异引物，通过
ＲＴ－ＰＣＲ的方法克隆获得了一段完整的ｃＤＮＡ序列，全长１１９６ｂｐ，其中包含一段８２８ｂｐ的开放阅读框，编码
２７５个氨基酸残基的蛋白质，具有典型的高保守的 ＭＡＤＳｂｏｘ结构域以及半保守的 Ｋ区，说明犈狀犠犕８是典型
的 ＭＡＤＳｂｏｘ基因。
犈狀犠犕８推导的氨基酸序列与小麦的犠犕８、犃犌犔２９和犳狉狌犻狋犳狌犾犾犻犽犲相似性较高，分别为９５．６２％，９６．７２％和
９６．２８％，且与小麦的５０个 ＭＡＤＳｂｏｘ基因、拟南芥的犃狋犠犕８及犃狋犃犌犔２９基因编码的蛋白质序列经由ＤＮＡ
ＭＡＮ软件推演的系统进化树显示结果与其相符，同时也说明了垂穗披碱草与小麦亲缘关系较近，而与拟南芥亲
缘关系较远。另外，推演系统进化树时还发现 ＭＡＤＳｂｏｘ基因５′端均高度保守，而３′末端变异较大，这也验证了
ＭＡＤＳｂｏｘ基因家族典型的 ＭＡＤＳｂｏｘ结构域的存在。单子叶植物和双子叶植物两者花器官形态虽有所不同，
但其各轮花器官亦可基本对应。就垂穗披碱草和拟南芥而言，水稻中的内外稃、浆片、雄蕊和心皮分别对应拟南
芥中的萼片、花瓣、雄蕊和心皮，且 ＭＡＤＳｂｏｘ基因在单子叶植物和双子叶植物中在结构和功能上都具有相当的
保守性［１４，２７］。按系统进化分析，犈狀犠犕８属于 ＭＩＫＣ型 ＭＡＤＳｂｏｘ基因，且与小麦的犠犕８、犃犌犔２９和犳狉狌犻狋犳狌犾
犾犻犽犲氨基酸序列相似性较高（均大于９５％）。拟南芥中犃犌犔２９基因是控制花粉成熟及其竞争能力的下游调控因
子［２８］，而犳狉狌犻狋犳狌犾犾犻犽犲基因既在花发育早期促进花序分生组织的形成，又在花发育的晚期影响心皮的形成及角果
的开裂，同时还影响叶片的发育［２９］。据此推测犠犕８基因与它们的功能相似。然而，关于 ＭＡＤＳｂｏｘ基因犠犕８
的研究很少，仅在拟南芥、小麦等植物中少有报道［１５］，其具体基因功能更是未明，有待于进一步研究。
利用生物信息学分析软件对垂穗披碱草 ＷＭ８蛋白的结构分析结果显示，主肽链由２７５个氨基酸组成，理论
等电点为９．１４，蛋白分子量为３１５１１．７Ｄａ，分子式为Ｃ１３５３Ｈ２１９２Ｎ４１２Ｏ４２７Ｓ１４，是一个碱性蛋白。蛋白质疏水性预
测中，ＧＲＡＶＹ值的范围是－２～２，正值表明该蛋白为疏水性蛋白，负值表明为亲水性蛋白。利用ＰｒｏｔＰａｒａｍ工
具统计的ＧＲＡＶＹ为－０．９３５，所以垂穗披碱草 ＷＭ８蛋白质为亲水性蛋白质。对垂穗披碱草 ＷＭ８蛋白二级结
构的分析发现，该蛋白可以形成α螺旋、无规则卷曲和延伸链，所占比例分别为５２．３６％，３７．８２％和９．８２％。不
同的氨基酸，对于形成不同的二级结构有着不同的能力。异亮氨酸、缬氨酸及苏氨酸等有分枝的氨基酸，通常采
用β折叠的形态。脯氨酸对于α螺旋的稳定性有一定的破坏能力。而在垂穗披碱草 ＷＭ８蛋白中，这些氨基酸
的含量较少，因此形成β折叠的可能性也较小，这可能是相当比例的无规则卷曲出现的原因。该蛋白碱性氨基酸
含量大于酸性氨基酸含量，因此其等电点较高（ｐＩ为９．１４）。垂穗披碱草 ＷＭ８蛋白通过生物信息软件分析，没
有 Ｎ端信号肽，也没有跨膜结构，因此可以预测该蛋白可能定位于细胞质和细胞核中。通过ＰＳＯＲＴ ＷＷＷ
Ｓｅｒｖｅｒ中的工具ＰＳＯＲＴＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎ对垂穗披碱草 ＷＭ８蛋白进行细胞定位，结果显示，该蛋白存在于细胞核中
的可能性为７６．０％，与上述预测一致。对该蛋白的二级和三级结构分析可知，该蛋白富含α螺旋和无规则卷曲
结构，因此，该蛋白的主要功能很可能由这些结构承载。
总之，本研究从垂穗披碱草中分离获得了犈狀犠犕８基因的全长ｃＤＮＡ序列，并进行了系统的序列分析以及
蛋白结构分析，不仅为进一步研究犈狀犠犕８基因在垂穗披碱草中的表达分析、功能验证、蛋白的分子结构与功能
的关系等奠定了基础，且可为深入研究垂穗披碱草的花发育、种子成熟等机制提供参考。
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９４１第２１卷第４期 草业学报２０１２年
犆犾狅狀犻狀犵犪狀犱犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狋犺犲犕犃犇犛犫狅狓犵犲狀犲犠犕８狅犳犈犾狔犿狌狊狀狌狋犪狀狊
ＺＨＡＮＧＭｉａｏｑｉｎｇ，ＺＨＡＮＧＪｉｙｕ，ＬＩＵＺｈｉｐｅｎｇ，ＷＡＮＧＹａｎｒｏｎｇ，ＺＨＡＮＧＬｅｉ
（ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄＡｇｒｏｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣｏｌｅｇｅｏｆＰａｓｔｏｒａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＳｃｉｅｎｃｅ
ａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＬａｎｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００２０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＴｈｅｆｕｌｌｅｎｇｔｈＭＡＤＳｂｏｘｇｅｎｅ犈狀犠犕８ｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍ犈犾狔犿狌狊狀狌狋犪狀狊ｂｙｈｏｍｏｌｏｇｙｃｌｏｎｉｎｇ，ａｎｄ
ｗａｓｓｕｂｍｉｔｔｅｄｔｏＧｅｎＢａｎｋ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＪＦ６８３８４６）．ＡｎａｌｙｓｅｓｏｆｔｈｅｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ犈狀
犠犕８ｗａｓ１１９６ｂｐａｎｄｅｎｃｏｄｅｄ２７５ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ，ｔｙｐｉｃａｌｏｆｔｈｅＭＩＫＣｔｙｐｅＭＡＤＳｂｏｘｇｅｎｅｓｗｉｔｈａｔｙｐｉｃａｌ
ＭＡＤＳｂｏｘｄｏｍａｉｎａｎｄＫｓｅｍｉｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｄｉｓｔｒｉｃｔ．Ｉｔｉｓｓｐｅｃｕｌａｔｅｄｔｈａｔｉｔｈａｓｓｏｍｅｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈｆｌｏｗｅｒ
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９６．２８％ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｇｅｎｅａｎｄ犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿ｇｅｎｅｓ犠犕８，犃犌犔２９，ａｎｄ犳狉狌犻狋犳狌犾犾犻犽犲．Ｔｈｅｐｈｙ
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ｔｈｅ犜犪犠犕８ｏｆ犜．犪犲狊狋犻狏狌犿，ａｎｄｗａｓｄｉｓｔａｎｔｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅ犃狋犠犕８ａｎｄ犃狋犃犌犔２９ｏｆ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊．Ｔｈｅ犠犕８
ｐｒｏｔｅｉｎｏｆ犈．狀狌狋犪狀狊ｉｓａｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃａｎｄｂａｓｉｃｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈａｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｏｆ１３７２６．７Ｄａ：ｔｈｅｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ
ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｐｏｉｎｔｉｓ９．１４．Ｉｔｈａｓｎｏｍｅｍｂｒａｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｉｓｍａｉｎｌｙｌｏｃａｔｅｄｉｎｔｈｅｎｕｃｌｅｕｓ．Ｔｈｅｒｅａｒｅｍａｎｙα
ｈｅｌｉｘ，ｒａｎｄｏｍｃｏｉｌａｎｄｅｘｔｅｎｄｅｄｓｔｒａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．Ｔｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓａｒｅａｂａｓｉｓｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｆｌｏｗｅｒｄｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｓｅｅｄｍａｔｕｒａｔｉｏｎａｎｄｏｔｈｅｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆ犈．狀狌狋犪狀狊ａｔｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｅｖｅｌ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犈犾狔犿狌狊狀狌狋犪狀狊；ＭＡＤＳｂｏｘ；犠犕８ｇｅｎｅ；ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ；ｐｒｏｔｅｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
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