全 文 ：林业科学研究 ２０１５，２８（４）：５９７ ６０３
ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ
文章编号：１００１１４９８（２０１５）０４０５９７０７
红松４个组织的转录组数据分析与次生代谢
产物的表达差异初探
张 振，张含国，周 宇，张 磊，于宏影，张 莉
（东北林业大学 林木遗传育种国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 １５００４０）
收稿日期：２０１３１０１７
项目基金：林业公益性行业科研专项“红松果材兼用林良种选育与定向培育技术研究”（２０１２０４３２０）
作者简介：张 振（１９８６—），男，在读博士，主要从事林木遗传改良研究．Ｅｍａｉｌ：ｚｈｅｎｚｈ１９８６０５１６＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者：教授，博士生导师，主要研究方向：林木遗传育种与改良
关键词：红松；转录组；基因注释；次生代谢途径
中图分类号：Ｓ７９１．２４５ 文献标识码：Ａ
ＤｉｆｅｒｅｎｔｉａｌＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓｏｎＳｅｃｏｎｄａｒｙＭｅｔａｂｏｌｉｔｅｓａｎｄ
ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｏＦｏｕｒＴｉｓｓｕｅｓｏｆＰｉｎｕｓｋｏｒａｉｅｎｓｉｓ
ＺＨＡＮＧＺｈｅｎ，ＺＨＡＮＧＨａｎｇｕｏ，ＺＨＯＵＹｕ，ＺＨＡＮＧＬｅｉ，ＹＵＨｏｎｇｙｉｎｇ，ＺＨＡＮＧＬｉ
（ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＦｏｒｅｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＴｒｅｅＢｒｅｅｄｉｎｇ，ＮｏｒｔｈｅａｓｔＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ １５００４０，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈｃｏｍｐａｒｅｄｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓｏｆｆｏｕｒｄｉｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｏｆＰｉｎｕｓｋｏｒａｉｅｎｓｉｓｂｙｕｓｉｎｇＲＮＡｓｅｑ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅａｎｄａｌｏｔｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｕｎｉｇｅｎｅｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ．Ａｔｏｔａｌｏｆ２１．３ＧＢｏｆｄａｔａｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄａｎｄ
４１４７６ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｕｎｉｇｅｎｅｓｗｅｒｅｒｅｃｅｉｖｅｄａｆｔｅｒａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ．ＴｈｒｏｕｇｈＧＯａｎｄＣＯＧｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｔｈｅｃｏｍｍｅｎｔｅｄａｎｄ
ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｅｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｅｄｉｎｔｏ２４ｏｒ５６ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ，ｗｈｉｃｈｒｅｆｅｒｅｄｔｏｍａｎｙｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｃｅｓ
ｓｅｓｓｕｃｈａｓｍａｔｅｒｉａｌａｎｄｅｎｅｒｇｙｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ，ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｎｄｄｅｆｅｎｓｅｒｅａｃｔｉｏｎ．
Ｔｈｒｏｕｇｈｐａｔｈｗａｙｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓ，ｔｈｅｐａｔｈｗａｙｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｇｒｅａｓｅｓｙｎｔｈｅｔｉｃｆａｔｙａｃｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｎｄｔｅｒ
ｐｅｎｏｉｄｓｓｙｎｔｈｅｓｉｓｗｅｒｅｆｏｕｎｄ．ＴｗｏｕｎｉｇｅｎｅｓｏｆｍｅｔａｂｏｌｉｃｐａｔｈｗａｙｓｉｎＫＥＧＧｄａｔａｂａｓｅｗｅｒｅｃｏｍｐａｒｅｄａｎｄ１６ｋｅｙ
ｅｎｚｙｍｅｇｅｎｅｓｏｆｆａｔｙａｃｉｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｏｔｈｅｒｓｐｅｃｉｅｓｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓａｎｄ３４ｋｅｙｅｎｚｙｍｅｇｅｎｅｓｏｆｔｅｒｐｅｎｏｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ
ｐａｔｈｗａｙｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｂｙｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｒｅｓｅａｒｃｈ，ａｌａｒｇｅｎｕｍｂｅｒｏｆＰｉｎｕｓｋｏ
ｒａｉｅｎｓｉｓｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｕｎｉｇｅｎｅｓｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｖｉｄｅｓｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｆｏｒｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｔｈｅｇｅｎｅｓｒｅｌａｔｅｄ
ｔｏｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎＰｉｎｕｓｋｏｒａｉｅｎｓｉｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｉｎｕｓｋｏｒａｉｅｎｓｉｓ；ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ；ｇｅｎｅａｎｎｏｔａｔｉｏｎ；ｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
红松（ＰｉｎｕｓＫｏｒａｉｅｎｓｉｓ）为松科松属乔木，主要分
布在中国东北东部，俄罗斯远东南部及朝鲜半岛，日
本岛也有零星分布。红松是中国Ⅱ级重点保护野生
植物，既是优良的用材树种，又是珍贵的食用干果和
油料树种［１］。红松树干圆满通直，叶５针一束，球果
两年成熟，花期５—６月，种子在次年９—１０月成熟。
红松木材可作建筑、造纸，树皮中含有松树脂，可作
药用，松仁是一种营养价值很高的果品［２－４］，含有大
量的粗蛋白，油脂，多糖，粗纤维，除此之外，还富含
维生素、矿物质以及钙、磷、锰、钻、铜、锌等微量元
素［４－５］，与意大利石松（Ｐ．ｐｉｎｅａ），西伯利亚红松
（Ｐ．ｓｉｂｉｒｉｃａ），油松（Ｐ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ），瑞士五针松（Ｐ．
ｃｅｍｂｒａ），克罗拉多果松（Ｐ．ｅｄｕｌｉｓ），单叶果松（Ｐ．
ｍｏｎｏｐｈｙｌａ）等松科球果为目前世界松仁商品主要种
类。目前，在红松的遗传育种进程中，主要以可食用
坚果林选育及品质改良为主，但针对红松的分子生
林 业 科 学 研 究 第２８卷
物学研究进展较慢，红松的基因组及转录组数据还
比较缺乏，对生长发育及代谢途径、遗传图谱构建等
的研究较少，影响了红松遗传改良的研究进程。
ＥＳＴ技术是开展转录组研究的有效方法［６］，已
被广泛应用于动、植物和微生物的基因表达谱分析、
功能基因预测等［７－９］。目前公共数据库中已有松属
多个树种的ＥＳＴ序列，如火炬松、北美短叶松、海岸
松［１０－１２］。截止２０１４年５月，从 ＧｅｎＢａｎｋ查找发现
松属 ＥＳＴ序列有７３００３７条，但红松的 ＥＳＴ序列仅
为６５条。随着测序技术的发展，将高通量测序应用
到红松的转录组研究中，不仅可降低测序的成本和
时间，而且可获得的丰富的数据，有利于松属的转录
组和生长发育相关研究。本研究采用 Ｉｌｕｍｉｎａ公司
开发的ＨｉＳｅｑ２０００测序技术进行松属树种转录组的
研究，构建红松均一化 ｃＤＮＡ文库、测序，对序列再
做基因功能注释和分类等，以研究红松生长发育过
程中重要基因的表达，获得包括脂肪酸类合成、萜类
化合物合成等的合成相关的生物酶基因及参与植物
次生代谢的基因，获得的 Ｕｎｉｇｅｎｅｓ为红松及其相近
物种的群体基因组学和功能基因组学提供了有价值
的候选基因，这些基因将有助于开展选择育种和基
因工程研究。
１ 材料与方法
１．１ 样本材料来源
样本采集于黑龙江省林口县青山林场红松种子
园内，种子园为１９７９年嫁接营建，株行距４ｍ×６ｍ。
于２０１３年６月分别采集无性系‘ＬＫ１５’与无性系
‘ＬＫ２０’的上部针叶（Ｔ１）、嫩梢（Ｔ２）、雌花（Ｔ３）和球
果（Ｔ４）４个组织，液氮速冻后 －８０℃保存。每个无
性系的４个组织材料单独提取 ＲＮＡ后，再将提取的
ＲＮＡ分组织混合用于转录组测序。
１．２ 总ＲＮＡ的提取和ｍＲＮＡ的分离
Ｔ１－Ｔ４总ＲＮＡ提取方法参照ＴｒｉｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ说
明书进行。用１．２％琼脂糖凝胶电泳和Ｎａｎｏｄｒｏｐ纯
度检测，Ｑｕｂｉｔ２．０浓度检测及 Ａｇｉｌｅｎｔ２１００质量检
测。确定总ＲＮＡ完整性和纯度质量后，用ＮＥＢＮｅｘｔ
Ｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡＭａｇｎｅｔｉｃＩｓｏｌａｔｉｏｎＭｏｄｕｌｅ（ＮＥＢ，
Ｅ７４９０）富集ｍＲＮＡ。
１．３ ｃＤＮＡ片段合成及测序文库构建
以ｍＲＮＡ为模板，用 ＮＥＢＮｅｘｔｍＲＮＡＬｉｂｒａｒｙ
ＰｒｅｐＭａｓｔｅｒＭｉｘＳｅｔｆｏｒＩｌｕｍｉｎａ（ＮＥＢ，Ｅ６１１０）和
ＮＥＢＮｅｘｔＭｕｌｔｉｐｌｅｘＯｌｉｇｏｓｆｏｒＩｌｕｍｉｎａ（ＮＥＢ，Ｅ７５００）
构建上机文库。使用 Ｑｕｂｉｔ２．０进行初步定量，稀释
文库至２ｎｇ·μＬ－１，制备好的文库用１．８％琼脂糖
凝胶电泳进行检测文库插入片段大小（ｉｎｓｅｒｔｓｉｚｅ），
然后用ＬｉｂｒａｒｙＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔＩｌｕｍｉｎａＧＡＵｎｉｖｅｒ
ｓａｌ（Ｋａｐａ，ＫＫ４８２４）进行ＱＰＣＲ定量（文库有效浓度
＞２ｎｍｏｌ·Ｌ－１）。检测合格的文库在 ｉｌｕｍｉｎａｃｂｏｔ
上进行簇的生成，最后用 ＩｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑＴＭ２０００进
行测序。
１．４ 序列分析
利用Ｉｌｕｍｉｎａ平台将测序所得的图像数据转化
为相应的核苷酸序列数据，对所产生的原始序列文
件进行质量评估和可信度分析，并去除测序过程中
低质量的序列和不确定的序列（Ｑ＜２０）。使用Ｔｒｉｎ
ｉｔｙ［１３］软件对样品数据进行混合组装，通过序列之间
的 ｏｖｅｒｌａｐ信息组装得到 ｃｏｎｔｉｇ，再根据序列的
ｐａｉｒｅｄｅｎｄ信息和ｃｏｎｔｉｇ之间的相似性对ｃｏｎｔｉｇ进行
聚类，然后在局部进行组装得到转录本，最后从局部
中挑选最主要的转录本作为Ｕｎｉｇｅｎｅ。
１．５ 序列注释、功能分类和生物学通路分析
使用ＢＬＡＳＴ［１４］软件将 Ｕｎｉｇｅｎｅｓ序列与 ＮＲ［１５］、
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ［１６］、ＧＯ［１７］、ＣＯＧ［１８］、ＫＥＧＧ［１９］数据库比对，
获得Ｕｎｉｇｅｎｅｓ的注释信息（Ｅｖａｌｕｅ＜＝１ｅ０５），再将
注释上的序列按照不同的功能划分成不同的类别。
最后对 ＫＥＧＧ注释的基因功能信息进行生物学通路
的注释和预测。
１．６ 差异表达Ｕｎｉｇｅｎｅ的筛选
利用比对软件 Ｂｏｗｔｉｅ将各样品测序得到的
ｒｅａｄｓ与Ｕｎｉｇｅｎｅ库进行比对，然后根据比对信息并
利用ＲＳＥＭ［２０］进行表达量水平估计，我们利用 ＲＰ
ＫＭ［２１］值来反映对应 Ｕｎｉｇｅｎｅｓ的表达丰度。选择
ＥＢＳｅｑ［２２］进行差异表达分析，利用 ＦＤＲ方法分析
Ｕｎｉｇｅｎｅ的表达，在差异基因筛选中，我们选取 ＦＤＲ
＜０．０１且ＦｏｌｄＣｈａｎｇｅ≥２作为标准定义为差异Ｕｎｉ
ｇｅｎｅ。
１．７ 差异 Ｕｎｉｇｅｎｅ的ＧＯ和ｐａｔｈｗａｙ分析
ＧＯ功能显著性富集分析能确定差异表达基因
行使的主要生物学功能。通过 Ｐａｔｈｗａｙ显著性富集
能确定差异表达基因参与的最主要生化代谢途径和
信号转导途径。
２ 结果与分析
２．１ 高通量测序与功能注释
通过对红松的针叶、茎、雌花和球果的转录组进
８９５
第４期 张 振等：红松４个组织的转录组数据分析与次生代谢产物的表达差异初探
行高通量的测序，总共获得２１．３ＧＢ的数据，经过序
列拼接，获得４９０１１０６个 ｃｏｎｔｉｇ片段，大于３００ｂｐ
的有 ３５３３１个，大于 １ｋｂ的有 １４６６１个。通过
Ｔｒｉｎｉｔｙ组装共得到 ７１２３８条转录本和 ４１４７６条
Ｕｎｉｇｅｎｅ。
与 ＢＬＡＳＴ序列比对，最终获得有注释信息的
Ｕｎｉｇｅｎｅｓ有２６８４９个（占全部Ｕｎｉｇｅｎｅ的６４．７３％）。
将组装得到的４１４７６条红松 Ｕｎｉｇｅｎｅ与 Ｎｒ数据库
比对，有１１８３７条与云杉（Ｐｉｃｅａｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ）、２８３０条
与葡萄（Ｖｉｔｉｓｖｉｎｉｆｅｒａ）等植物的序列同源。
如图１所示，在 ＣＯＧ功能分类体系中，获得的
功能注释涉及 ２４个 ＣＯＧ功能类别，其中，Ｇｅｎｅｒａｌ
ｆｕｎｃｔｉｏｎｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｎｌｙ转录物的比例最大（２２１６
条），Ｎｕｃｌｅａｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅ最少（１条），其他种类基因的
表达丰度不尽相同。
图２所示，ＧＯ富集性分析将注释的 Ｕｎｉｇｅｎｅ序
列分成细胞组分（Ｃｅｌｕｌａｒｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）、分子功能（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＦｕｎｃｔｉｏｎ）、生物过程（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｃｅｓｓ）３个
大类５６个小类，分别包含了１６、１６、２４个功能亚类，
其 中，Ｃｅｌｕｌａｒｃｏｍｐｏｎｅｎｔ中，ｃｅｌｐａｒｔ、ｃｅｌ、ｏｒｇａｎｅｌｅ
基因最多；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＦｕｎｃｔｉｏｎ中，ｃａｔａｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ、
ｂｉｎｄｉｎｇ基因最多；ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＰｒｏｃｅｓｓ中，ｍｅｔａｂｏｌｉｃ、
ｃｅｌｕｌａｒ基因最多。
图１ 红松ｕｎｉｇｅｎｅ的ＣＯＧ注释
图２ Ｕｎｉｇｅｎｅ的ＧＯ功能注释及分类统计结果
２．２ 不同组织差异Ｕｎｉｇｅｎｅ的ＧＯ分析
在转录组测序、组装和注释的基础上，将红松不
同部位进行基因表达对比分析（见表１）。发现嫩茎
（Ｔ２）、花（Ｔ３）、球果（Ｔ４）分别与针叶（Ｔ１）相比，分
别有７９２个、１０５５个、２６６８个Ｕｎｉｇｅｎｅ上调表达，有
１０６９个、１５１６个、３２４８个 Ｕｎｉｇｅｎｅ下调表达；花
（Ｔ３）、球果（Ｔ４）分别与嫩茎（Ｔ２）相比，分别有８３４
个、２８４１个 Ｕｎｉｇｅｎｅ上调表达，有８０２个、３０１６个
Ｕｎｉｇｅｎｅ下调表达；球果（Ｔ４）与花（Ｔ３）相比，有 ２
７７１个 Ｕｎｉｇｅｎｅ上调表达，有２８５０个 Ｕｎｉｇｅｎｅ下调
表达。研究发现球果分别与针叶、嫩茎、花的差异
Ｕｎｉｇｅｎｅ数量最多，说明球果在形成过程中的各途径
中Ｕｎｉｇｅｎｅ表达量丰富。通过ＧＯ分类，分别研究不
同部位间差异Ｕｎｉｇｅｎｅ的功能（见图３）及不同部位
间差异显著的 ＵｎｉｇｅｎｅＧＯ富集。ＧＯ功能分类表
明，在所有组织部位间的差异基因，被分为细胞组
分、分子功能、生物过程三大类。而细胞组分中ｃｅｌ、
ｏｒｇａｎｅｌｅ、ｃｅｌｐａｒｔ三个亚类所占比例较高，分子功能
中ｃａｔａｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ、ｂｉｎｄｉｎｇ两个亚类所占比例较高，
生物过程中 ｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃｅｓ、ｃｅｌｕｌａｒｐｒｏｃｅｓｓ所占比
９９５
林 业 科 学 研 究 第２８卷
例较高，同时，由图３可知，球果（Ｔ４）较针叶（Ｔ１）、
茎（Ｔ２）、花（Ｔ３）四个组织部位的转录组差异 Ｕｎｉ
ｇｅｎｅ在ＧＯ功能分类中所占的比例均较高。在此基
础上，分别对不同部位间差异 Ｕｎｉｇｅｎｅ进行 ＧＯ富
集，我们以叶（Ｔ１）ＶＳ果（Ｔ４）为例（见图４），发现叶
与果在 ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｐｅｃｉｆｉｃＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
ｆａｃｔｏｒａｃｔｉｖｉｔｙ（１２２）、ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ（６３）、ｍｅｔ
ａｂｏｌｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓ（１８３）、ｏｘｉｄａｔｉｏｎｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ
（２９８）、ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃｅｓｓ（８３）、ｅｘｔｒａｃｅｌ
ｌｕｌａｒｒｅｇｉｏｎ（１２９）、ｐｌａｎｔｔｙｐｅｃｅｌｗａｌ（９５）、ｃｙｔｏｐｌａｓ
ｍｉｃｍｅｍｂｒａｎｅｂｏｕｎｄｅｄｖｅｓｉｃｌｅ（１９０）、ａｐｏｐｌａｓｔ（９１）等
方面差异显著。
表１ 注释的差异基因数量统计
Ｔｙｐｅ Ｔｏｔａｌｎｕｍｂｅｒ Ｕｐｎｕｍｂｅｒ Ｄｏｗｎｎｕｍｂｅｒ
Ｔ１ｖｓＴ２ １８６１ ７９２ １０６９
Ｔ１ｖｓＴ３ ２５７１ １０５５ １５１６
Ｔ１ｖｓＴ４ ５９１６ ２６６８ ３２４８
Ｔ２ｖｓＴ３ １６３６ ８３４ ８０２
Ｔ２ｖｓＴ４ ５８５７ ２８４１ ３０１６
Ｔ３ｖｓＴ４ ５６２１ ２７７１ ２８５０
注：第一列表示样品组合，前一个样品为对照组，后一个样品为
实验组。
图３ 不同部位间差异ｕｎｉｇｅｎｅｓ的ＧＯ功能注释及分类统计
图４ 叶（Ｔ１）ＶＳ果（Ｔ４）间的 ＧＯ富集分析
２．３ 不同组织差异Ｕｎｉｇｅｎｅ的ｐａｔｈｗａｙ注释分析
为了研究差异 Ｕｎｉｇｅｎｅ涉及的代谢途径，利用
ＫＥＧＧ数据库分别对其进行了ｐａｔｈｗａｙ富集分析（见
图５），同样以叶（Ｔ１）ＶＳ果（Ｔ４）为例，发现叶与球
果在Ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（６１）、Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ
ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（４３）、Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（３１）、Ｃｉｒｃａｄｉａｎ
ｒｈｙｔｈｍ（１７）、Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２５）Ｄｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ
ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉ（１３）、Ｐｒｏｔｅｉｎｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｉｎｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅ
ｔｉｃｕｌｕｍ（４７）等途径差异显著。研究不同部位间差异
Ｕｎｉｇｅｎｅ的ｐａｔｈｗａｙ富集分析的前３位差异 ｐａｔｈｗａｙ
数据，表明，（Ｔ１）ＶＳ（Ｔ２）间与（Ｔ１）ＶＳ（Ｔ３）间的差
异 ｐａｔｈｗａｙ一致，均为 Ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、
Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；（Ｔ１）ＶＳ
（Ｔ４）间、（Ｔ２）ＶＳ（Ｔ４）间与（Ｔ３）ＶＳ（Ｔ４）间的差异
ｐａｔｈｗａｙ一致，均为 Ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、
Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｐｒｏｔｅｉｎｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｉｎｅｎｄｏ
ｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍ；（Ｔ２）ＶＳ（Ｔ３）间的差异 ｐａｔｈｗａｙ为
Ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅｍｅｔａｂｏ
ｌｉｓｍ、Ｐｌａｎｔｈｏｒｍｏｎｅｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ。
２．４ 红松次生代谢产物初探
２．４．１ 脂肪酸合成途径相关基因 转录组数据库
中注释到次生代谢产物代谢途径的 Ｕｎｉｇｅｎｅ基因有
６６９个，代谢途径有２５个不同的分支。对不同部位
的转录组数据进行Ｐａｔｈｗａｙ富集性分析发现共有４８
个Ｕｎｉｇｅｎｅ可归类于脂肪酸生物合成途径，脂肪酸合
成是油脂合成的基础，因此对脂肪酸合成途径基因的
研究有助于更深入的认识油脂合成的机理。对每组
两两比较获得的差异表达Ｕｎｉｇｅｎｅ分别进行Ｐａｔｈｗａｙ
００６
第４期 张 振等：红松４个组织的转录组数据分析与次生代谢产物的表达差异初探
图５ 不同部位差异Ｕｎｉｇｅｎｅ的ＫＥＧＧ富集分析
富集性分析后发现，每组差异表达 Ｕｎｉｇｅｎｅ中都有
一些被归类于脂肪酸生物合成途径。将４８个 Ｕｎｉ
ｇｅｎｅ序列在 ＫＥＧＧ数据库中比对后获得１６个与其
他物种同源的脂肪酸合成相关的关键酶基因，片段
平均长度１３９７．６５ｂｐ，其中，ＫＡＳⅠ片段序列最长，为２
５４２．５ｂｐ；在表达水平上，以ＦａｔＢ和ＳＡＤ最高，同时，
两个基因均在球果中表达量最高（见图６）。
图６ ＦＡＴＢ与ＳＡＤ基因在不同部位间的表达水平
２．４．２ 挥发油、萜类化合物合成途径关键酶基因
萜类化合物是植物次生代谢物中的一类重要化合
物，被植物用于防御外病虫害，是针叶树的重要防御
物质。萜类化合物在针叶树中通常以复杂的混合物
形式存在，其数量和特性，会影响萜烯类化合物对潜
在的致病菌和植食性昆虫的防御作用［２３］。目前，萜
类化合物已成为针叶树研究领域中的热点问题。萜
类合成酶（ｔｅｒｐｅｎｅｓｙｎｔｈａｓｅｓ，ＴＰＳ）是萜类化合物生
物合成过程中的关键酶之一。研究发现萜类化合物
生物合成有２条分别独立的途径，即甲羟戊酸途径
（ＭＶＡ）和丙酮酸途径（ＤＸＰ）［２３］。这２条合成途径
分别在细胞溶质和细胞质体中形成５Ｃ单位的异戊
烯基二磷酸（ＩＰＰ）和二甲丙烯焦磷酸（ＤＭＡＰＰ），ＩＰＰ
与ＤＭＡＰＰ结合为?牛儿基焦酸（ＧＰＰ），ＧＰＰ去焦酸
后即生成单萜。ＩＰＰ与ＧＰＰ头尾相连则产生法尼基
焦酸（ＦＰＰ）释放出焦
#
酸则可形成倍半萜。ＦＰＰ以
尾尾方式连接，即合成三萜类。ＩＰＰ和 ＦＰＰ相连会
产生?牛儿基?牛儿基焦酸（ＧＧＰＰ），去焦酸后形成
四萜。ＧＧＰＰ可与多个 ＩＰＰ头尾连接合成多萜类产
物［２４］。对不同部位的转录组数据进行Ｐａｔｈｗａｙ富集
性分析发现共有９７个Ｕｎｉｇｅｎｅ可归类于萜类化合物
生物合成途径，共注释到３４个萜类生物合成途径关
键酶基因，片段平均长度８８０．６ｂｐ，其中，ＧＧＰＳ片段
最长，为２１７９．５ｂｐ，在表达水平上，ＲＰＫＭ值前８位
的基因在不同部位的基因表达量显示，在球果中的
萜类化合物基因表达量最少，除 ＨＤＲ外，在茎和花
中的表达量较高（见图７）。
图７ ＲＰＫＭ值前８位的基因在不同部位间的表达水平
３ 结论与讨论
ＨｉＳｅｑ２０００高通量测序数据量大，效率高，适合
于进行松属树种转录组的研究。Ｕｎｉｇｅｎｅｓ及其功能
注释作为计算基因组学的产物，对育种来说就是一
笔宝贵的资源［２５］。本研究采用 ＲＮＡＳｅｑ技术对红
松针叶、茎、花和球果４个部位间的转录组进行比较
研究，将红松不同部位间的差异表达的基因进行了
ＧＯ和Ｐａｔｈｗａｙ信号途径分类，初步明确了各个基因
１０６
林 业 科 学 研 究 第２８卷
编码的蛋白质的功能，为研究基因表达变化与油脂
合成之间及与萜类化合物合成之间的关系奠定了研
究基础，将有助于开展选择育种和基因工程研究。
本研究经过序列拼接，获得４９０１１０６个 ｃｏｎｔｉｇ
片段，通过 Ｔｒｉｎｉｔｙ组装得到４１４７６条 Ｕｎｉｇｅｎｅ。通
过对Ｕｎｉｇｅｎｅ进行功能注释，最终获得有注释信息
的 Ｕｎｉｇｅｎｅｓ有 ２６８４９个，占 全 部 Ｕｎｉｇｅｎｅ的
６４７３％。ＣＯＧ功能分类将获得的功能注释涉及２４
个ＣＯＧ功能类别，ＧＯ富集性分析将注释的 Ｕｎｉｇｅｎｅ
序列分成Ｃｅｌｕｌａｒｃｏｍｐｏｎｅｎｔ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＦｕｎｃｔｉｏｎ、Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｃｅｓｓ３个大类５６个小类。这一结果表明，
采用高通量测序可以应用于红松不同部位间生长发
育过程中表达的重要基因的研究。Ｌｉ等［２６］采用高
通量测序技术进行人参不同部位间的转录组分析，
挖掘皂苷生物合成基因；李铁柱等［２７］完成杜仲果实
与叶片的转录组组装与功能注释。证实高通量测序
应用于研究不同组织间的转录水平的可行性。
Ｃｈｅｎ［２８］等、ＤａｗｎＥＨａｌ等［２９］、Ｎｉｕ等［３０］、王晓峰
等［３１］分别采用高通量测序在针叶树中挪威云杉、美
国黑松、油松、马尾松完成转录组测序，并进行基因
资源的挖掘。
通过红松不同部位间的基因表达对比分析，发
现，球果分别与针叶、嫩茎、花的差异ｕｎｉｇｅｎｅ数量最
多，说明生长发育期的球果存在着丰富的生化进程，
处于基因高表达水平。由差异基因的 ＧＯ分类中，
在细胞组分中的ｃｅｌ（细胞）、ｏｒｇａｎｅｌｅ（细胞器官）等
亚类所占比例较高，分子功能中 ｃａｔａｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ（催
化活性）、ｂｉｎｄｉｎｇ（拼接）两个亚类所占比例较高，生
物过程中 ｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃｅｓ（代谢过程）、ｃｅｌｕｌａｒ
ｐｒｏｃｅｓｓ（细胞过程）所占比例较高，而球果的高表达
水平说明，差异基因的 ＧＯ分类中主要体现为球果
中含有大量快速生长相关的基因。不同部位差异
Ｕｎｉｇｅｎｅ的ｐａｔｈｗａｙ注释分析结果与 ＧＯ功能分析注
释结果相识。
红松无论作为用材林，还是作为食品以及化工
用品都具有较高的发展前景，目前对红松种仁中脂
肪酸成分研究较多，表明，松仁脂肪酸成分中以不饱
和脂肪酸为主，王振宇等［３２］张振［３３］等采用气质联
用法检测了经超临界法提取的松仁油，不饱和脂肪
酸的含量在９０％以上，其主要成分为油酸、亚油酸、
α亚麻酸和棕榈酸，其中亚油酸和 α亚麻酸的含量
最高。脂酰酰基载体蛋白硫酯酶（ａｃｙｌａｃｙｌｃａｒｉｅｒ
ｐｒｏｔｅｉｎｔｈｉｏｅｓｔｅｒａｓｅ，Ｆａｔ）是脂肪酸从头合成途径中
的关键酶，其主要功能是将脂酰基ＡＣＰ水解成游离
脂肪酸和ＡＣＰ，从而终止脂肪酸从头合成途径中脂
肪酸链的延长［３４］。由于底物不同，Ｆａｔ又被分为 Ｆａ
ｔＡ和ＦａｔＢ两大家族，它们共同控制着植物体中饱
和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例［３５］。△９硬脂酰
ＡＣＰ脱氢酶（ｓｔｅａｒｏｙｌＡＣＰｄｅｓａｔｕｒａｓｅ，ＳＡＤ）在植物质
体中，以硬脂酰 ＡＣＰ（ｓｔｅａｒｏｙｌＡＣＰ，Ｃ１８ＡＣＰ）为底
物，生成顺式不饱和双键的油酰基 ＡＣＰ（△９Ｃ１８∶１
ＡＣＰ）接着在硫酯酶的作用下解离，转运至内质网进
行三酰甘油的组装或再延长以及去饱和等过程，因
此，ＳＡＤ是植物脂肪酸合成通路中一个重要的分支
点，是不饱和脂肪酸合成中不可缺少的关键酶，直接
决定饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例［３６－３７］，这对
调节油料植物种子中脂肪酸组成具有重要意义。在
表达水平上，以ＦａｔＢ和ＳＡＤ最高，同时，两个基因均
在球果中表达量最高。
植物体内许多萜烯成分的分布通常具有种属、
器官、组织和生长发育阶段的特异性，表明了萜类合
成酶（ＴＰＳ）存在表达和调控的时空特异性。目前，
在针叶树中已报道了７０多种 ＴＰＳ，已报道的针叶树
ＴＰＳ主要集中在松科（Ｐｉｎａｃｅａｅ）植物中［２３］。对萜类
合成酶的深入研究，可以使我们通过 ＤＮＡ重组技
术来改造萜类合成细胞中的代谢途径，以提高萜类
最终产量或在不含萜类的生物中合成萜类［３８］。红
松转录组数据库的建立，获得了大量的转录本信息，
可用于基因的克隆、表达谱分析、发现新基因、ＱＴＬ
定位等多种用途，红松的研究多以定向培育、生长性
状、化学成分分析等研究为主，其分子生物学研究进
展较为缓慢，而红松转录组数据库的建立，为分子生
物学的研究提供了重要的基础和依据；为红松次生
代谢产物的生物合成与代谢调控提供了候选的基因
资源，为红松活性成分含量指标和优良农艺性状改
良奠定基础。
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ｃｏｎｔｏｒｔａ）ａｎｄｊａｃｋｐｉｎｅ（Ｐｉｎｕｓｂａｎｋｓｉａｎａ）［Ｊ］．ＢＭＣＰｌａｎｔＢｉｏｌｏ
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［３０］ＳｈｉＨｕｉＮｉｕ，ＺｈｅＸｉｎＬｉ，ＨｕＷｅｉＹｕａｎ，ｅｔａｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎｏｆＰｉｎｕｓｔａｂｕｌｉｆｏｒｍｉｓａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｓｉｎｔｈｅ
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［３１］王晓锋，何卫龙，蔡卫佳，等．马尾松转录组测序和分析［Ｊ］．分
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