全 文 ：林业科学研究 2009, 22( 2): 226~ 229
Forest Resea rch
文章编号: 100121498( 2009) 0220226204
笃斯越桔离体培养及植株再生体系的建立
顾地周1, 高捍东 2* , 顾美影 1, 朱俊义 1, 姜云天 1
( 1.通化师范学院生物系,吉林 通化 134002; 2. 南京林业大学森林资源与环境学院,江苏南京 210037)
摘要:以笃斯越桔新生嫩芽为外植体, 应用均匀设计法筛选其最适合的基部直接再生芽苗和生根的培养基,结果表
明, 最适合的基部直接再生芽苗诱导培养基为: DR+ 22ip 2. 75 mg# L- 1 + IAA 0. 10mg# L- 1, 诱导率为 99% ;生根培
养基: MS(改良 ) + IAA 1. 00mg# L- 1 + Kt 0. 30mg# L- 1, 生根率达 98% ;以再生植株的茎节为材料进行快繁的结果
表明, 在 25 d的一个培养周期内增殖倍数平均达 40以上, 快繁培养基: MS(改良 ) + IAA 0. 50~ 1. 00 mg# L - 1 + K t
0. 30 mg# L- 1+ GA3 0. 20 mg# L
- 1。建立了笃斯越桔的植株再生和快繁体系。
关键词:笃斯越桔;离体培养;植株再生;均匀设计
中图分类号: S722. 3 文献标识码: A
收稿日期: 2007204230
基金项目: 通化师范学院自然科学基金资助项目 (XS060074 ), 吉林省科技厅资助项目 ( 200705C05 )
作者简介: 顾地周 ( 1973) ),男,吉林通化人,讲师,主要研究方向:长白山区珍稀濒危植物和药用植物研究. E2mai:l gud izhou@ 163. com
* 通讯作者:高捍东,男,教授,博士生导师.
In vitro Cu lture and P lan t Regenera tion System of
Vaccin ium u liginosum
GUDi2zhou1, GAOH an2dong2, GUMei2ying1, ZHU Jun2yi1, J IANG Yun2tian1
( 1. Departmen t of Biology, Tonghua NormalUn ivers ity, Tonghua 134002, Jil in, Ch ina;
2. Co llege of Forest Resources and Env ironmen ,t Nan jing ForestryUn iversity, Nan jing 210037, Jiangsu, Ch ina)
Abstr act: The tender buds ofVaccinium uliginosum were used as exp lants for the experimen.t Un iform Design was
app lied to select the most suitab le med ia for shoots regeneration at base of tender buds and rooting. The resu lts
showed thatDR + 22ip 2. 75mg# L- 1 + IAA 0. 10mg# L- 1 fitted for shoots regeneration at base of tender buds, the
rate of regenera tionwas 99%; MS(mod ified) + IAA 1. 00 mg# L- 1 + K t 0. 30 mg# L- 1 for rooting, the rate of
rootingwas 98%; Stem s each w ith one nodewere cut from regenerated shoots and cu ltured for propagation, and a
402fold proliferation ratewas achievedw ithin 25 days, MS(modified) + IAA 0. 50~ 1. 00mg# L- 1 + K t 0. 30mg#
L
- 1
+ GA3 0. 20 mg# L
- 1
for rapid propagation of plant regenerat ion. P lant Regeneration and Rapid Propagation
system ofVaccinium uliginosum has been successfu lly estab lished.
K ey word s: Vaccinium ulig inosum; in vitro culture; plant regenerat ion; Uniform Design
笃斯越桔 (Vaccinium uliginosum Linn. ),又称笃
斯、黑豆树 (大兴安岭 ), 甸果、地果、龙果、蛤塘果
(吉林 )、讷日苏 (蒙古族语 )。笃斯越桔是杜鹃花科
( E ricaceae)越桔属 (Vaccinium L. )落叶小灌木, 5吉
林省野生动植物保护管理暂行条例 6中定为省级一
类重点保护植物。是野生观赏植物和珍稀濒危药用
植物 [ 1- 3] ,主要功能为清热、收敛等。果可生食, 酸
甜可口, 汁液丰富, 做果酒、果醋、果酱、果汁及提取
天然食用色素的原料。被国际粮农组织定为五大健
康食品之一。其分布区甚狭, 长白山区数量非常稀
少,仅在长白山国家级自然保护区内有较大种群分
布 [ 4]。因其常规繁殖有很大难度, 开发和利用受到
第 2期 顾地周等:笃斯越桔离体培养及植株再生体系的建立
极大限制。为了更好地开发利用这一极具经济价值
的野生珍贵资源, 利用植物组织培养技术建立了高
效、遗传稳定的快繁体系。同时,应用均匀设计对培
养基进行筛选, 达到了预期目的。本文结果可能对
其开发和利用有一定的参考意义。目前, 与其同属
其他种植物的组织培养已有报道 [ 5- 7]。但笃斯越桔
的离体培养和植株再生迄今未见。
1 材料与方法
1. 1 外植体材料的处理
3月于长白山北坡海拔 1 300 m针阔混交林下
采笃斯越桔休眠枝条在实验室内水培促使腋芽
萌发。
待腋芽萌发并长至 3~ 5 cm时剪下, 在超净工
作台上用 75%酒精涮洗 30 s,用含 3%青霉素的次
氯酸钠 ( 1% )溶液浸泡 10m in,无菌水冲洗 8次。用
无菌滤纸吸干表面水分,切除被杀菌消毒剂损伤部
分后作为外植体备用 [ 8]。
1. 2 嫩芽基部直接再生芽苗诱导培养基的筛选
以 DR为基本培养基,附加蔗糖 20 g# L- 1, 琼
脂粉 8. 5 g# L- 1, pH值 5. 5,温度 ( 24 ? 2) e , 光照
强度 1 300 lx,光照周期 12 h# d- 1。将经过处理的
外植体接种到附加不同浓度的 22ip和 IAA培养基
上进行基部直接再生芽苗诱导培养。筛选最适宜的
分化培养基及激素浓度配比。统计并计算出芽苗诱
导率。
1. 3 生根培养基的筛选
以改良 MS( 1 /4大量元素、1 /2微量元素、1 /2
铁盐和 1 /3有机成分 )为培养基, 附加不同浓度的
IAA、IBA和 NAA, 同时加入 Kt 0. 30 mg# L- 1 (壮
苗 )。蔗糖 10 g# L- 1,琼脂 8. 00 g# L- 1, pH值 5. 5,
温度 ( 22 ? 2) e ,光照强度 1 000 lx,光照周期 10 h
# d- 1。筛选最适宜的生根培养基。统计并计算出
生根率。
1. 4 再生植株快繁体系的建立
采用节培法进行快繁, 以再生植株的茎节为
材料进行快繁。将生根的苗切割成一叶一段转
接到优化后的培养基中, 同时进行腋芽萌发、伸
长及生根培养。统计并计算出增殖周期和增殖
倍数。
1. 5 数据分析
数据分析与处理采用均匀设计 (Uniform De2
sign)软件。
2 结果与分析
2. 1 DR培养基中不同浓度 22ip和 IAA的交叉配
比对笃斯越桔基部直接再生芽苗的影响
将笃斯越桔嫩茎段和茎尖接种于不同培养基中
进行再生芽苗诱导培养,每个处理数为 30。为了提
高笃斯越桔再生芽苗的速度和诱导率, 采用均匀设
计法,选用 U10 ( 108 )均匀表 (见表 1),考察了细胞分
裂素 22ip和生长素 IAA (由预试验可知浓度范围分
别为 1. 00~ 3. 25、0. 05~ 0. 12 mg# L- 1 )浓度交叉
配比对分化率的影响 (在表和方程中, X1为 22ip浓
度, X2为 IAA浓度, Y为诱导率,结果见表 2)。
表 1 U10 ( 102 )因素及水平设计
水平 因素 / ( mg# L
- 1 )
X1 X2
1 1. 00 0. 05
2 1. 25 0. 06
3 1. 50 0. 07
4 1. 75 0. 08
5 2. 00 0. 09
6 2. 25 0. 10
7 2. 50 0. 11
8 2. 75 0. 12
9 3. 00 0. 11
10 3. 25 0. 12
表 2 U10 ( 102 )均匀设计实验安排及结果
处理号 因素 / ( mg# L- 1 )X1 X2 Y /%
1 1. 00 0. 11 73. 0
2 1. 25 0. 07 80. 5
3 1. 50 0. 12 75. 5
4 1. 75 0. 10 80. 0
5 2. 00 0. 06 87. 5
6 2. 25 0. 11 82. 5
7 2. 50 0. 09 87. 5
8 2. 75 0. 05 95. 0
9 3. 00 0. 12 87. 0
10 3. 25 0. 08 92. 0
嫩茎段培养至 60天统计诱导率,数据经均匀设
计软件处理,得回归方程 Y= 81. 3+ 7. 20X1 - 138X2,
样本容量N = 10, 显著性水平 A= 0. 01, 复相关系数
R= 0. 995 0, 检验值 F t = 349. 3, 临界值 F ( 0. 01, 2, 7) =
9. 547, F t > F ( 0. 01, 2, 7 ),显著,回归方程有意义。对方程
项进行显著性检验可知:各方程项对 Y值影响均显
著。根据回归方程求出 Y的最优组合为:X1 = 3. 25,
X2 = 0. 05,在此组合基础上求得最优解: y = 97. 8,此解
为回归方程的解析解,按公式 Y = y ? LA # s计算出
227
林 业 科 学 研 究 第 22卷
优化值区间估计为 Y = 97. 8( ? 2. 77),即 95. 03% ~
100. 57%。通过表 2发现, 当 22ip的浓度超过 2. 75
mg# L- 1时诱导率下降 (说明过高的 22ip浓度对基部
直接再生芽苗起抑制作用 );当 IAA浓度超过 0. 11mg
# L- 1时嫩芽基部产生愈伤组织, 可能是 22ip和 IAA
共同作用的结果。为确保笃斯越桔经组培快繁后的
遗传稳定性, 不采取愈伤组织再分化产生芽苗的方
式,经过对比发现 IAA浓度为 0. 10mg# L- 1时苗的长
势最好且基部无愈伤组织产生,芽苗均为基部直接再
生。以免 22ip浓度在 2. 75~ 3. 00mg# L- 1之间出现
高诱导率, 又以 IAA浓度 0. 10 mg# L- 1, 22ip浓度
2. 75、2. 76、2. 77、2. 78~ 3. 00mg# L- 1做了 26个梯度
试验,结果发现诱导率均在 85%以下。因此, 对优化
值进行改良,即 22ip 2. 75 mg# L- 1和 IAA 0. 10mg#
L- 1,再进行验证试验 (重复数为 30),培养 35天,发现
基部有锥形突起,继续培养至 60天锥形突起伸长为
芽苗,培养至 75天再生苗可长到 2. 00 cm以上,且苗
壮而整齐 (图 1a), 诱导率达 99%, 在估计区间范围
内,且比所有实验 Y值都大,说明实验结果是正确的。
因此,笃斯越桔嫩芽基部直接再生芽苗的最佳培养基
为: DR + 22ip 2. 75mg# L- 1 + IAA 0. 10mg# L- 1。
2. 2 改良M S培养基中不同生长素浓度的交叉配
比对笃斯越桔组培苗生根的影响
由预试验可知, 采用改良 MS并附加生长素
IAA、IBA和 NAA, 由单一因子试验可知:浓度均控
制在 0. 10~ 1. 00 mg# L- 1之间, 超过 1. 0 mg# L- 1
幼苗基部膨胀或产生愈伤瘤, 继续培养根从膨胀部
或愈伤瘤上发出,这样的苗在移栽时,根随愈伤瘤从
苗基部脱落,移栽成活率几乎为零, 可能是根与苗茎
的纤维疏导组织连接不完整所致, 在培养基中附加
Kt 0. 30 mg# L- 1生根苗较未附加的粗壮。为了提
高笃斯越桔的生根率,采用均匀设计法,每个处理数
为 50,选用 U10 ( 103 )均匀表 (见表 3),同时考察了生
长素 IAA、IBA和 NAA浓度交叉配比对生根率的影
响 (在表和方程中, X1为 IAA浓度, X2为 IBA浓度,
X3为 NAA浓度, Y为生根率,结果见表 4)。
采取逐步回归分析法, 数据经均匀设计软件处
理,得回归方程 Y= 41. 5+ 56. 9X1 - 3. 0X2 - 8. 41X3,
样本容量 N = 10, 显著性水平 A= 0. 01,复相关系数
R= 0. 913 8,检验值 F t = 10. 12, 临界值 F ( 0. 01, 3, 6) =
9. 780, F t > F ( 0. 01, 3, 6) ,回归方程显著。对各方程项进
行显著性检验: 检验值 F ( 2) = 6. 173e- 2, 临界值
F ( 0. 01, 1, 6) = 13. 75, F ( 2) [ F ( 0. 01, 1, 6) , 此方程项不显著,
表 3 U10 ( 103 )因素及水平设计
水平 因素 / ( mg# L
- 1 )
X1 X2 X3
1 0. 10 0. 10 0. 10
2 0. 20 0. 20 0. 20
3 0. 30 0. 30 0. 30
4 0. 40 0. 40 0. 40
5 0. 50 0. 50 0. 50
6 0. 60 0. 60 0. 60
7 0. 70 0. 70 0. 70
8 0. 80 0. 80 0. 80
9 0. 90 0. 90 0. 90
10 1. 00 1. 00 1. 00
表 4 U10 ( 103 )均匀设计实验安排及结果
处理号 因素 / ( mg# L
- 1 )
X 1 X2 X3
Y /%
1 0. 10 0. 50 0. 70 30. 0
2 0. 20 1. 00 0. 30 45. 0
3 0. 30 0. 40 1. 00 53. 0
4 0. 40 0. 90 0. 60 58. 0
5 0. 50 0. 30 0. 20 66. 5
6 0. 60 0. 80 0. 90 72. 0
7 0. 70 0. 20 0. 50 88. 5
8 0. 80 0. 70 0. 10 92. 0
9 0. 90 0. 10 0. 80 80. 0
10 1. 00 0. 60 0. 40 79. 5
需要剔除;剔除不显著方程项再建回归方程 Y= 38. 7
+ 58. 0X1 - 7. 58X3, 复相关系数 R = 0. 919 2,检验值
F t = 17. 50, 临界值 F ( 0. 01, 2, 7 ) = 9. 547, F t > F ( 0. 01, 2, 7) ,
回归方程显著。再对新建各方程项进行显著性检验
可知: 检验值 F ( 2 ) = 0. 535 6, 临界值 F ( 0. 01, 1, 7) =
12. 25, F ( 2) [ F ( 0. 01, 1, 7) , 此方程项不显著, 需要剔除;
同理, 剔除不显著方程项第三次建立回归方程的 Y=
33. 7+ 59. 5X1,复相关系数 R = 0. 905 9,检验值 F t =
36. 59, 临界值 F ( 0. 01, 1, 8) = 11. 26, F t > F ( 0. 01, 1, 8) , 回归
方程显著, 对方程项进行显著性检验可知:检验值
F ( 1) = 36. 59, 临界值 F ( 0. 01, 1, 8) = 11. 26, F ( 1) >
F ( 0. 01, 1, 8) , 此方程项显著。根据回归方程求出 Y的最
优组合为: X1 = 1. 0,在此组合基础上求得最优解: y =
93. 2,按公式 Y = y ? LA# s计算出优化值区间估计
为 Y= 93. 2( ? 30. 0),即 63. 2% ~ 123. 2%。以最优组
合做验证试验,将生长健壮的丛生苗切下,然后将其
移入附加 IAA 1. 00 mg# L- 1的改良MS培养基中,培
养 20天开始生根, 35天后幼苗基部或茎部直接发出
3~ 5条不定根, 45天后苗高可达 3. 0 cm以上,有的
产生了侧根, 根和苗的形态、发育均正常 (图 1b), 生
根率达 98%。在估计区间范围内,且比所有实验 Y值
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第 2期 顾地周等:笃斯越桔离体培养及植株再生体系的建立
都大,说明实验结果是正确的。可见,笃斯越桔最佳
生根培养基为: MS(改良 ) + IAA 1. 00 mg# L- 1 + K t
0. 30mg# L- 1。
2. 3 再生植株快繁体系的建立
采取节培法进行快繁 [ 9- 10] , 以再生植株的茎节
为材料进行快繁。待生根的苗伸长至 5. 00 cm以上
时,在超净工作台上打开培养瓶留一叶剪下苗干, 将
其切割成一叶一段转接到附加 0. 20 mg# L- 1 GA3
(有利于茎段腋芽的迅速萌发和伸长 )的生根培养基
中进行节伸长及生根培养。 25天为 1个继代增殖周
期,每瓶增殖倍数平均达 40以上 (图 1c)。随着继代
次数的增加可适当降低生长素 IAA浓度 (以免激素积
累 ),继代次数达 10次后, IAA浓度可降至 0. 50mg#
L- 1因此,笃斯越桔继代增殖培养基为MS(改良 ) +
IAA 0. 50~ 1. 00 mg# L- 1 + Kt 0. 30 mg# L- 1 + GA3
0. 20mg# L- 1。
a. 芽苗直接再生; b. 生根培养; c. 节增殖培养
图 1 笃斯越桔离体培养及植株再生各阶段的培养物形态
3 结论
实验证明, 培养基 DR + 22ip 2. 75mg# L- 1 +
IAA 0. 10mg# L- 1对笃斯越桔嫩芽基部直接再生芽
苗的诱导效果最好, 笃斯越桔离体培养采取新生嫩
芽基部直接再生方式,遗传稳定性好,速度快、分化
率高。培养基MS(改良 ) + IAA 1. 00 mg# L- 1 + K t
0. 30mg# L- 1较适合于笃斯越桔的生根, 在培养基
中附加 0. 30mg# L- 1的 K,t生根苗较未附加的粗壮
且长势好。快繁采取节培法, 以再生植株的茎节为
材料进行快繁,在生根培养基的基础上进行优化, 附
加 0. 20 mg# L- 1的 GA3有利于茎段腋芽的迅速萌
发和伸长,从而缩短了继代增殖周期,提高了增殖倍
数。方法简捷,经济实用, 可操作性强, 达到了再生
植株快繁的目标, 可用于笃斯越桔工厂化育苗。同
时,应用均匀设计处理、分析数据和再试验大大缩短
了培养基配方的摸索周期, 为今后长白山野生越桔
的工厂化育苗提供可行性依据。
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