全 文 ：林业科学研究　2005 ,18 (3) :321～324
Forest Research
　　文章编号 :100121498 (2005) 0320321204
多年生黑麦草核型分析与组织培养再生
植株染色体变异研究
冯　霞1 , 孙振元1 3 , 刘建锋1 , 彭镇华1 , 杜小娟2
(11 中国林业科学研究院林业研究所 ,国家林业局林木培育重点实验室 ,北京　100091 ;21 北京西山实验林场 ,北京　100093)
摘要 :对多年生黑麦草核型及组织培养再生植株细胞染色体变异进行了观察研究。结果表明 :多年生黑麦草为二倍
体 ,属中等染色体 ,由中部着丝点染色体和亚中部着丝点染色体组成 ,属“1A”型 ,其核型公式为 2n = 2x = 14 = 2sm +
12m(2SAT) 。组培再生苗根尖细胞有 40 %发生了染色体数目变异 ,其中以非整倍体变异居多 ;同时存在一定数量的
染色体倒位、断裂、凝聚、双着丝点等染色体结构变异及染色体桥、落后染色体、染色体不均等分裂等染色体有丝分
裂异常现象。
关键词 :多年生黑麦草 ;核型分析 ;染色体变异 ;再生植株
中图分类号 :S68814 　　　文献标识码 :A
收稿日期 : 2004210210
基金项目 : 国家转基因植物研究与产业化专项 (J220022B2006)
作者简介 : 冯霞 (1976 —) ,女 ,云南人 ,博士研究生.3 通讯作者 : Email :Sunzy @caf . ac. cn
Studies on the Karyotype and Chromosome Variation of
Regenerated Perennial Ryegrass
FENG Xia1 , SUN Zhen2yuan1 3 , LIU Jian2feng1 , PENG Zhen2hua1 , DU Xiao2juan2
(1. Research Institute of Forestry , CAF ; Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation , State Forestry Administration ,
Beijing 　100091 ,China ;2. Beijing Xishan Experimental Forestry Farm ,Beijing 　100093 , China)
Abstract : The chromosome karyotypes and the chromosome variation of regenerated plants of perennial ryegrass(Lolium perenne L. )
were studied. The results showed that perennial ryegrass was diploid and composed of metacentric chromosomes and submetacentric
chromosomes and belonged to ”1A”type. Its karyotypical formula was 2n = 2x = 14 = 2sm + 12m(2SAT) . It was also found that the
chromosome amount changes happened in 40 % of regenerated plants cells and there were also obvious chromosome structure varia2
tions (fragment ,dicentrics ,condensation and transposed ring etc. ) , mitotic aberrations (lagging chromosome , bridges) as well as
numerical alterations (including haploid ,aneuploid and polyploid etc. ) in some cells of regenerated plants.
Key words : perennial ryegrass ; karyotype analysis ;chromosome variation ;regenerated plant
多年生黑麦草 (Lolium perenne L. )是禾本科黑麦
草属草本植物 ,具有叶片质地细、柔软、叶色绿 ,成坪
速度快等特性[1 ] ,是一种优良的草坪草。核型分析
是远缘杂交育种和染色体工程的理论基础 ,组织培
养是新品种培育的重要生物技术手段。Terrell[2 ]报
道体细胞染色体数为 2n = 2x = 14 ,但未对其核型进
行分析 ,组织培养再生植株染色体变异的研究也未
见报道。本文对多年生黑麦草的核型及组织培养条
件对再生植株染色体变异的影响进行了研究 ,试图
为利用离体培养技术与其它生物技术相结合的方
法 ,创造新的种质资源 ,最终为实现新品种培育的目
标提供理论依据。
1 　材料与方法
111 　材料培养
11111 　实生苗 　将多年生黑麦草栽培品种“德比
(Derby)”种子置于培养皿 ,27 ℃恒温条件下催芽 ,种
子开始萌动后置于 4 ℃冰箱中低温处理 12 h ,然后
在 27 ℃下培养 24 h。
11112 　组织培养再生苗 　以多年生黑麦草成熟胚
为外植体 ,按冯霞等[3 ]组织培养方法 2 次继代后再
分化获得再生植株。
112 　取材及处理
(1)实生苗 　将长约 115 cm 的实生苗新生健壮
根浸于 01004 mol·L - 1的 8 - 羟基喹啉溶液与对二氯
苯饱和溶液的 1 :1 混合液中 ,室温下避光预处理 115
h ;用清水冲洗后置于卡诺固定液中固定 24 h ;用清
水充分冲洗后转入 1 mol·L - 1HCl 中 ,61 ℃水浴解离
15 min ;水洗后于 4 %硫酸铁铵溶液中媒染 4 h ,水洗
后在 015 %的苏木精溶液中染色 2～4 h ;经 450 g·
kg - 1醋酸进行分色和软化后压片。
(2)组织培养再生苗 　取组培再生苗长度约为
2 cm 的新生健壮根 ,处理方法同上。
113 　核型分析与染色体观察
(1)核型分析 　随机选取 5 株实生苗 ,于相同部
位截取根尖 ,每个根尖选取 10 个细胞进行染色体数
目鉴定并进行核型分析。核型按 Levan[4 ]的分类法
和李懋学等[5 ]植物染色体标准化的规定分析 ,核型
分类根据 Stebbins[6 ]的核型分类标准 ,染色体大小的
划分参照 Lima2De2Faria[7 ]的染色体场理论 ,核型不
对称系数参照 Arano[8 ]公式 ,观察与照相均采用 Le2
ica 显微镜及其照相系统。
(2)组培苗染色体变异观察 　随机选取 15 株再
生植株 (来自同一成熟胚的 2 次继代培养) 根尖 ,每
个根尖选取 10 个细胞进行观察和相关数据统计。
以实生苗为对照同时观察。
2 　结果与分析
211 　核型分析
对核型参数 (表 1)和核型及核型模式图 (图 1)分
析表明 :多年生黑麦草的核型公式为 :2n = 2x = 14 =
2sm + 12m(2SAT) 。染色体组绝对全长为 27177μm ,绝
对长度变化范围为 2196～4184μm ,其中 12 条属小染
色体 ,2 条为中等染色体 ;相对长度变化范围为 1017～
2015μm ,最长染色体与最短染色体相对长度比为
1166 ;平均长短臂比为 1156 ;无臂比 > 2 的染色体 ;核
型分类为 1A ;核型不对称系数为 60178 ;第 5 条染色体
为随体染色体 ,其随体为椭圆形。
表 1 　多年生黑麦草的核型参数
染色体编号
相对长度
(短臂 + 长臂 = 总长度) /μm
臂比值 着丝点类型
11) 7126 + 13120 = 2015 1181 sm1)
6146 + 9166 = 1611 1149 m
2 7101 + 9165 = 1617 1138 m
3 5130 + 7162 = 1219 1144 m
4 5159 + 8164 = 1412 1155 m
52) 4165 + 8137 = 1310 1180 sm2)
6 5148 + 6191 = 1214 1126 m
7 3188 + 6177 = 1017 1174 m
　　注 :1)杂合染色体对 ;2)具随体的染色体(随体长度未计算在内) 。
箭头所示为具随体的染色体
图 1 　多年生黑麦草染色体核型图及模式图
223 林 　业 　科 　学 　研 　究 第 18 卷
212 　组织培养再生植株根尖染色体数目变异
再生植株及实生苗的倍性水平分析结果表明 :
二者所有植株的二倍体细胞均占绝大多数 (6016 %
～8810 %) ,为二倍体类型植株 ;但实生苗根尖细胞
染色体数目发生变异的比率占 12 % ,变异类型有亚
单倍体、单倍体、超二倍体。组织培养再生苗根尖
细胞染色体数目发生变异的比率为 40 % ,比实生苗
变异高 28 个百分点 ,变异类型除了有亚单倍体、单
倍体和超二倍体之外 ,还有亚二倍体 ,并出现了四倍
体及超四倍体类型 ,变异类型多样化 (表 2) 。
表 2 　再生植株与实生苗根尖染色体数目变异比较
材料类型
染色体数
< 7
亚单倍体
7(n)
单倍体
8～13
亚二倍体
14
二倍体
14～27 28 > 28
超二倍体
总计
实生苗
细胞数 1 3 0 44 2 0 50
百分率/ % 210 610 010 8810 410 010 100
再生植株
细胞数 3 3 13 91 32 4 4 150
百分率/ % 210 210 816 6016 2113 217 217 100
213 　组织培养再生植株染色体的结构变异
从图版 2 可知 ,组织培养再生植株染色体数目
变异除比率较大、类型多样外 ,染色体的结构也出现
了多种类型的变异 ,如染色体断片、染色体凝聚、染
色体倒位等 ;细胞有丝分裂异常现象也很丰富 ,如染
色体桥、染色体不均等落后染色体等。
图 2 　组织培养再生植株染色体的结构变异
　　　　说明 :箭头所示为染色体结构变异与有丝分裂异常。a 代表端着丝点染色体 ;b 为染色体断片 ;c 为染色体落后 ;d 为染色体凝聚 ;
e 为双着丝点染色体 ;f为染色体桥 ;g为染色体倒位。图中标识为10μm。11 2n = 14二倍体 ,染色体断片及端着丝点染色体 ;
21 2n = 6亚单倍体 ;31 2n = 7单倍体 ;41 2n = 8亚二倍体 ;51 2n = 15超二倍体 ,落后染色体 ;61多倍体 ;71染色体断片 ,染色体
凝聚 ,双着丝点染色体 ;81 染色体不均等分裂 ;91 染色体单桥 ;101 染色体多桥。
323第 3 期 冯霞等 :多年生黑麦草核型分析与组织培养再生植株染色体变异研究
3 　结论与讨论
(1) 核型分析发现多年生黑麦草品种‘德比’第 1
对染色体杂合性明显 ,其中包括一个 sm 染色体和一
个稍小的 m染色体。这种罕见的现象也存在于铁线
莲属 ( Clematis L1) 中[9 ,10] ,但出现这种现象的原因尚
不清楚。笔者认为可能是由于多年生黑麦草是一种
自交不亲合的专性杂交植物[11] ,在长期的杂交繁殖过
程中 ,当同源染色体配对时分别保留了父母本的各一
条染色体 ,从而出现同源染色体的杂合现象。
(2) 根据 Stebbins[6]的核型分类标准 ,多年生黑麦
草属对称的 1A 型 ,与禾本科其它属的植物相比[12] ,多
年生黑麦草比稻属 ( Oryza L. ) 原始 ,而与小麦属
( Triticum L. ) 、黑麦属( Secale L. ) 、大麦属( Hordeum L. ) 、
狗尾草属 ( Setaria Beauv)及狼尾草属 ( Pennisetum Rich)
等属的大多数种的进化程度相近 ,这可为研究多年生
黑麦草的起源、进化以及育种提供参考。Levitzky[13]和
Stebbins[6]均认为 :在被子植物中 ,核型进化的基本趋势
是由对称向不对称发展的。系统演化处于比较古老或
原始的植物 ,大多具有较对称的核型 ,不对称的核型则
主要见于衍生的、特化的以及进化的植物类群中。
(3)许多研究证明 ,组织培养再生植株中存在有
广泛地变异 ,如大麦 ( Hordeum vulgare L. ) 、马铃薯
( Solanum tuberosum L. ) 、刚毛绵鸡尾 ( Haworthia setata
Haw. )等植物组织再生植株中染色体数目发生了整
倍性及非整倍性变化 ,刚毛绵鸡尾的再生植株中还
有染色体倒位、易位、缺失等染色体结构变异的细
胞 ,而且在再生植株的减数分裂中染色体行为异
常[14 ,15 ] 。有学者[9～21 ]指出继代次数和培养时间均
会对愈伤组织及再生植株染色体变异的频率产生影
响。一般来说随着继代次数增多、培养时间延长 ,愈
伤组织染色体变异率加大 ,但愈伤组织分化出再生
植株的能力却持续增强至一定程度后才会降低。因
此研究继代次数及培养时间在什么样的范围内即能
获得较高的愈伤组织变异率又不影响其再生能力很
有意义。本研究观察到多年生黑麦草的组培再生植
株中也有大量单倍体、多倍体及非整倍体细胞 ,染色
体数目变异率也高于实生苗 28 个百分点 ,这一结果
验证了前人[15～18 ]认为组织培养可以诱导和提高体
细胞无性系变异的观点 ,也为利用组织培养方法进
行多年生黑麦草的种质资源创新提供了理论依据。
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423 林 　业 　科 　学 　研 　究 第 18 卷