全 文 ：林 业科 学研 究 2010, 23( 4) : 592 鶫 596
Forest Research
文章编号: 1001-1498( 2010) 04-0592-05
根癌农杆菌介导的反义 VeFAD2 基因对少根根霉的
遗传转化及其影响因子
刘明靖, 李纪元 * , 范正琪, 田 敏, 范妙华
( 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 , 浙江 富阳 311400)
关键词: AtMT; VeFAD2 基因; 遗传转化; 少根根霉
中图分类号: Q786 S722. 3 + 7 文献标识码: A
收稿日期 : 2009-02-25
基金项目 : 浙江省科技厅重大项目 ( 2006 C12030 ; 2005C12003)
作者简介 : 刘明靖 ( 1984— ) , 女 , 贵州凯里人 , 硕士研究生 , 主要从事植物基因工程研究 .
* 通讯作者 : 李纪元 , 研究员 , 博士生导师 . E-mail: jiyuan_li@ 126. com
Genetic Transformation in Rhizopus arrhizus of Antisense VeFAD2
Gene via Agrobacterium tumefaciens-mediated Transformation
and Its Influencing Factors
LIU Ming-jing , LI Ji-yuan , FAN Zheng-qi , TIAN Min , FAN Miao-hua
( Research Institute of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Fuyang 311400, Zhejiang, China)
Abstract: Agrobacteriurn tumefaciens-mediated transformation ( AtMT) method was used to study the genetic
transformation in Rhizopus arrhizus of antisense expression vector pBI121-fad2 of VeFAD2 gene. We studied the key
factors influencing transformation, such as A. tumefaciens strains, bacterial cell volume initially used, co-cultivation
time, effective period and concentration of AS. The results shows that the ideal A. tumefaciens strain is AGL-1, the
optimum bacterial cell volume initially used is 50 - 100 μL and co-culture 24 hours will get the most transformants.
At co-culture period, AS induction is indispensable. It is beneficial to improve transformation ratio by adding to 200
μmol·L - 1 AS at preincubate period and increasing AS concentration to 400 - 600 μmol·L - 1 at co-culture period.
It determined that antisense VeFAD2 gene has been integrated into the genome of R. arrhizus by PCR-
Southern detection.
Key words: AtMT; VeFAD2 gene; genetic transformation; Rhizopus arrhizus
△12 脂肪酸脱饱和酶 ( 又称油酸脱氢酶, 简称
FAD2 ) 是调节生物体内脂肪酸代谢的关键酶之一,
它催化油酸 18∶1( △9) 脱氢形成亚油酸 18∶2( △9,
12) , 在碳链中引入第 2 个双键 [ 1 ] 。本实验室已从木
本油料树种千年桐 ( Vernicia montana Lour. ) 发育中
的种子中克隆到 VeFAD2 基因, 为提高产油真菌少根
根霉( Rhizopus arrhizus Fischer) 的油酸含量, 作者将
VeFAD2 基因的反义表达载体 pBI121-fad2 导入少根
根霉中, 期望通过分子生物学手段调控真菌的脂肪
酸代谢, 改良其脂肪酸组成, 以满足生物柴油对植物
源油脂中单不饱和脂肪酸的要求 [ 2 - 4 ] 。
根癌农杆菌介导法 ( Agrobacterium tumefaciens-
mediated transformation, AtMT) 较之 PEG-CaCl2 法、醋
酸锂法、电击法、基因枪法等传统的遗传转化方法,
具有操作简便、遗传稳定、转化率高、重复性好等优
点 [ 5 - 8 ] 。自 1995 年 Bundock[ 5 ] 等成功利用根癌农杆
第 4 期 刘明靖等: 根癌农杆菌介导的反义 VeFAD2 基因对少根根霉的遗传转化及其影响因子
菌转化酵母以来, 已有包括丝状真菌泡盛曲霉 ( As-
pergillus awamori Nakazawa) 在内的 60 多种真菌通过
该方法实现了遗传转化 [ 9] 。虽然 AtMT转化的过程
基本相同, 但针对不同的真菌, 其转化条件却不尽相
同。众多研究表明, 影响转化的因素很多, 如农杆菌
菌株类型、真菌与农杆菌的细胞浓度、选择标记、乙
酰丁香酮 ( Acetosyringone, AS) 作用时期与作用浓
度、共培养时间、共培养温度、培养基 pH 值等都能
影响转化的成败及转化率 [ 7 , 10 - 11 ] 。本文通过对影响
转化效率的几个关键因子进行研究, 优化转化条件,
初步建立了一套经由根癌农杆菌介导的木本植物基
因在丝状真菌少根根霉中实现遗传转化的体系, 同
时也为将该体系应用于其它产油真菌的遗传转化提
供参考。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
1. 1. 1 菌株和质粒 VeFAD2 基因( 全长 1 152 bp)
的反义表达载体 pBI121-fad2 由本实验室构建, 该质
粒携带标记基因 NPTⅡ, 对卡那霉素具有抗性; 根癌
农杆菌 菌株 EHA105、AGL-1 ( 均 含 质粒 pBI121-
fad2) 为本实验室保存; 少根根霉购自中国科学院微
生物研究所。
1. 1. 2 试剂和引物 质粒提取试剂盒购自 AXY-
GEN 公司; Southern 杂交试 剂盒 DIG High Prime
DNA Labeling and Detection Starter KitⅡ购自 Roche
公司; 卡那霉素、利福平、头孢呋辛钠和乙酰丁香酮
( AS) 购自上海生工公司; 限制性内切酶 BamHⅠ和
XbalⅠ购自宝生物( 大连 ) 有限公司; PCR 试剂购自
TAKARA 公司, 其它化学试剂均为国产分析纯。
VeFAD2 基 因 上 游 引 物: gAgCTggTggCCgAAT-
gTCT, 下游引物: CTCgTAACAAggTCAAACCTC, 由上
海生工公司合成。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 农杆菌的活化及预培养 从 LB 平板上挑取
根癌农杆菌单克隆菌落接种于 LB 液体培养基中
( 含 50 μg·mL - 1卡那霉素, 50 μg·mL - 1利福平) ,
180 r·min - 1 , 28 ℃培养过夜, 离心收集菌体, 用等
体积的 IM 诱导培养液重悬菌体, 继续摇瓶预培养
4 鶫 5 h至 OD600为 0. 6 左右。
1. 2. 2 真菌孢子悬液的制备 用无菌蒸馏水从培
养 5 鶫 7 d 的 PDA 斜面培养基上洗下少根根霉的孢
子, 3 层擦镜纸过滤, 用适量蒸馏水稀释至 OD600 为
0. 45 左右( 血球计数板计数, 孢子浓度约为 1. 0 ×
10
7 个·mL - 1 ) 。
1. 2. 3 共培养 分别吸取 50、100、150、200、300 μL
的根癌农杆菌菌液与 200 μL 少根根霉孢子悬液混
合, 再取 10 μL混合液与 100 μL IM 培养液混合均
匀后, 涂布在铺有微孔滤膜的 IM 固体培养基( 含一
定浓度的 AS) 上, 28 ℃暗培养一段时间。
1. 2. 4 转化子的筛选 将滤膜转移至选择培养基
SMⅠ平板上( 含 350 μg·mL - 1卡那霉素筛选剂, 150
μg·mL - 1头孢呋辛钠抑菌剂 ) , 28 ℃暗培养 24 h
后, 随机挑取抗性菌丝转接到含更高浓度筛选剂的
选择培养基 SMⅡ上 ( 含 450 μg·mL- 1 卡那霉素,
150 μg·mL- 1头孢呋辛钠) , 还能继续生长的视为
阳性转化子。每处理随机挑取 10 处抗性菌丝, 设 5
次重复, 统计转化子数目, 计算转化率。
1. 2. 5 转化子的 PCR-Southern 杂交鉴定 采用氯
化苄法 [ 1 2] 提取阳性转化子基因组 DNA。VeFAD2 基
因 PCR 反应条件为: 94 ℃预变性 4 min, 94 ℃变性
30 s, 58 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 1. 5 min, 30 个循环,
72 ℃再延伸 10 min。
随机选取 5 个经 PCR 初步鉴定为阳性的转化
子, 提取基因组 DNA 做进一步的 PCR-Southern 杂交
检测。用于标记探针的模板为质粒 pBI121-fad2 上
VeFAD2 基因的 BamHⅠ和 XbalⅠ双酶切片段, 探针
的标记和杂交按试剂盒上提供的方法进行。
1. 2. 6 各影响因子的试验设计 选用 EHA105 和
AGL-1 2 种农杆菌菌株; 农杆菌初始菌液量分别为
50、100、150、200、300 μL; 不同的共培养时间 ( 12、
24、36、48 h) ; 在农杆菌预培养时期设置未加入和加
入 200 μmol·L - 1 AS 2 个处理; 共培养时期加入不
同浓度的 AS( 0、200、400、600、800 μmol·L - 1 ) 。
2 结果与分析
2.1 少根根霉转化子的获得及鉴定
将少根根霉分生孢子和根癌农杆菌的混合液
涂布到 IM 诱导培养基上共培养 24 h 后 , 滤膜上即
有些许细弱菌丝生成 , 将其转移到 SMⅠ选择培养
基继续培养 24 h, 便可看到大量絮状或绒毛状的白
色菌丝出现, 这些菌丝呈丛生状或片状分布于平板
上 , 并未形成独立的单一菌落。随机挑取这些抗性
菌丝转接至含更高浓度卡那霉素的 SMⅡ选择培养
基上时 , 仍能继续正常生长的, 可初步认定为转
化子。
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林 业 科 学 研 究 第 23 卷
随机选取 5 个转化子, 以质粒 pBI121-fad2 为阳
性对照, 以野生型少根根霉菌株为阴性对照, 分别提
取基因组 DNA 进行 PCR 扩增, 检测结果见图 1。由
图 1 可见: 有 4 个样品扩增出 VeFAD2 基因的特异性
片段, 初步表明转化成功; 而未扩增出条带的样品则
有可能是存在于抗性菌落中的假阳性转化子。
从经过 PCR 初步鉴定呈阳性且生长良好的转
化子中随机挑选 5 个转化子菌落, 以质粒 pBI121-
fad2 为阳性对照, 以野生型木霉菌株做阴性对照,
1% 琼脂糖凝胶电泳检测结果见图 2 - a。接着再用
此凝胶与标记好的探针杂交, 图 2 - b 为杂交后所获
影像。图 2 显示: 5 个转化子均有与阳性对照相同
的杂交信号出现, 而阴性对照未出现杂交信号, 这说
明目的基因已整合到少根根霉的基因组中。
M: DNA2 000 分子量标准 ; 1: 质粒 pBI121-fad2( 阳性对照 ) ;
2: 野生型少根根霉 ( 阴性对照 ) ; 3 鶫 7: 转化子
图 1 转化子 VeFAD2 基因的 PCR 鉴定
M: DNA2 000 分子量标准 ; 1 : 质粒 pBI121 -fad2; 2: 野生型少根根霉 ; 3 鶫 7: 转化子
图 2 转化子 VeFAD2 基因的 PCR 检测 ( a) 及 PCR 产物的 Southern杂交鉴定 ( b)
2. 2 农杆菌菌株对转化的影响
分别利用 2 种农杆菌菌株 EHA105 和 AGL-1 对
丝状真菌少根根霉进行转化。转化条件: 农杆菌初
始菌液量 50 μL, 预培养时加入 200 μmol·L - 1 的
AS, 共培养时 AS 浓度 200 μmol·L- 1, 共培养时间
24 h。2 种处理均筛选出了阳性转化子, 转化率达到
68% 鶫 82% ( 图 3 ) 。结 果 表 明: 农 杆 菌 菌 株
EHA105 和 AGL-1 都适用于少根根霉的转化, 且
AGL-1 的转化率高于 EHA105。
图 3 农杆菌菌株对转化的影响
2.3 农杆菌初始菌液量对转化的影响
农杆菌经活化培养到对数生长期 ( OD660 为 0. 6
左右) , 分别吸取 50、100、150、200、300 μL的农杆菌
初始菌液量与 200 μL 制备好的少根根霉孢子悬液
( 107 个·mL - 1 ) 混合。转化条件: 农杆菌菌株 AGL-
1, 预培养时加入 200 μmol·L - 1的 AS, 共培养时 AS
浓度 200 μmol·L - 1 , 共培养时间 24 h。
转化结果 ( 图 4) 表明: 当农杆菌初始菌液量在
50 μL和 100 μL 时, 转化率在 80% 左右; 随着菌液
量的增加, 转化率逐渐下降。作者在试验中发现, 以
200 μL初始菌液量的处理, IM平板上有农杆菌菌落
形成, 极大抑制了真菌的生长; 而当菌液量增加到
300 μL 时, 农杆菌过度生长引起严重污染, 导致真
菌几乎无法生长。因此, 本试验理想的农杆菌初始
菌液量是 50 鶫 100 μL。
2.4 共培养时间对转化的影响
本研究设计不同的共培养时间 ( 12、24、36、48
h) , 通过考察少根根霉在 IM 诱导培养基上的生长
情况及其在 SM 筛选平板上生成抗性菌落的情况,
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第 4 期 刘明靖等: 根癌农杆菌介导的反义 VeFAD2 基因对少根根霉的遗传转化及其影响因子
图 4 农杆菌初始菌液量对转化的影响
并随机挑取抗性菌落进行 PCR 扩增, 检测假阳性
率, 探讨共培养的最佳时间。试验的转化条件: 农杆
菌菌株 AGL-1, 农杆菌初始菌液量 50 μL, 预培养时
加入 200 μmol·L - 1 的 AS, 共培养时 AS 浓度 200
μmol·L - 1。
由表 1 可以看出: 共培养时间越长, 少根根霉在
IM 诱导培养基上生长越旺盛, 将其转移到 SM 筛选
平板上后生成的抗性菌落也越多; 然而 PCR 扩增表
明: 在这些抗性菌落中, 出现假阳性的概率也大幅升
高, 特别是共培养 48 h 的处理, 产生的大量抗性菌
落中, 假阳性率高达 86. 6% 。比较而言, 共培养时
间为 24 h 较为适宜, 既能获得抗性菌落, 又降低了
假阳性率。
表 1 不同共培养时间对转化的影响
共培养
时间 /h
真菌生长情况
抗性
菌落
假阳性率
/%
12 未见生长 无 -
24 肉眼可辨少量细弱菌丝 有 6. 6
36 白色菌丝较密较长 较多 60. 0
48 菌丝浓密纤长 , 有黑色孢子生成 多 86. 6
2.5 乙酰丁香酮( AS) 加入与否与作用浓度对转化
的影响
研究在农杆菌预培养时期加入 AS( 200 μmol·
L- 1 ) 与否以及共培养阶段不同的 AS 浓度对转化的
影响。转化条件: 农杆菌菌株 EHA105, 农杆菌初始
菌液量 50 μL, 共培养时间 24 h, 结果见图 5。分析
表明: 对于农杆菌菌株 EHA105, 在预培养时期加入
200 μmol·L - 1的 AS, 有利于提高转化效率; 在共培
养阶段不能缺少 AS 的诱导; 共培养时期适宜的 AS
浓度为 400 μmol·L- 1及以上。
3 小结与讨论
本文采用根癌农杆菌介导法, 实现了目的基因
VeFAD2 对产油真菌少根根霉的遗传转化, 获得了阳
图 5 AS加入与否与作用浓度对转化的影响
性转化子。对影响遗传转化的几个关键因子的研究
表明: 采用农杆菌菌株 AGL-1, 农杆菌初始菌液量 50
鶫 100 μL, 共培养时间 24 h, 在预培养时期加入 200
μmol·L- 1AS、共培养时期的 AS 浓度增加至 400 鶫
600 μmol·L - 1可获得较高的转化率。
农杆菌的侵染、T-DNA 的转移和整合需要一定
的时间, 因此控制适宜的共培养时间是转化成功的
关键。时间过短, 农杆菌尚未完成侵染过程; 时间过
长, 真菌过度生长会减弱筛选剂的筛选效果, 产生假
阳性抗性菌落的概率升高, 不利于转化子的获得。
少根根霉属于丝状真菌, 有粗而长的分枝状菌丝, 菌
落呈絮状或绒毛状, 相互重叠或连成一片。因此, 在
抗性克隆中, 可能存在一定比例的假阳性转化子, 这
也是图 1 中有一个样品未扩增出目的条带的原因;
然而, 本研究发现, 通过控制转化条件, 如缩短共培
养时间至 24 h 以及使用含更高浓度抗生素的平板
复筛, 可将假阳性率降到一个较低的水平。
根癌农杆菌将 T-DNA 转移进真菌细胞主要是
依赖于 Ti 质粒上一系列 Vir 基因的表达。一方面,
不同菌系的根癌农杆菌菌株毒力差异很大; 另一方
面, 某些酚类物质, 如乙酰丁香酮 ( AS) 可以诱导 Vir
毒蛋白的产生 [ 1 3] 。本研究发现, 在其它转化条件相
同的情况下, 农杆菌菌株 AGL-1 对少根根霉的转化
只需在共培养时期加入 200 μmol·L - 1 的 AS 即可
达到 82% 的转化率, 而 EHA105 菌株要想达到此水
平, 需要增加 AS 浓度至前者的 3 鶫 4 倍。这可能是
由于菌 株 AGL-1 本身 的侵 染 能力 ( 毒 力 ) 强于
EHA105, 较低的 AS 浓度即可激活 Vir 基因的表达。
Campoy 等 [ 14 ] 利用农杆菌菌株 AGL-1 转化紫红曲霉
( Monascus purpureus Went. ) , 其 转 化 效 率 比 用
LBA1100 高出 2 鶫 4 倍, 高兴喜等 [ 15] 进行了农杆菌
菌株 AGL-1 和 LBA4404 对 木 霉 菌 ( Trichoderma
spp. ) 的遗传转化实验, 其中菌株 AGL-1 能够转化
木霉, 而 LBA4404 转化失败。综合 AtMT法转化丝
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林 业 科 学 研 究 第 23 卷
状真菌的相关报道, AGL-1 是较常用的一种农杆菌
菌株, 且在转化中普遍取得了较好的效果, 本研究也
印证了这一点。对于在农杆菌预培养时期加入 AS
的作用效果文献说法不一。龙朝钦等 [ 16] 在研究烟
曲霉( A. fumigatus Fres. ) 转化条件时发现, 预培养
时加入 AS 与否对烟曲霉的转化效率影响不大; 而在
尖孢镰刀菌( Fusarium oxysporum Schl. ) 和稻瘟病菌
( Magnaporthe grisea Sacc. ) 的转化中, 研究者认为增
加 AS 预处理, 可以提高转化效率 [ 17 ] 。本研究结果
显示, 在对农杆菌菌株 EHA105 进行预培养时加入
200 μmol·L - 1的 AS 可获得较多的转化子, 而在共
培养时不能缺少 AS 的诱导, 并且随着 AS 浓度加
大, 转化子增多。
在丝状真菌的转化中, 对转化受体的细胞浓度
和农杆菌的浓度都有一定的要求, 而且两者之间的
比例 关 系 也 影 响 着 转 化 效 率。高 兴 喜 等 [ 15] 、
Zeilinger
[ 18 ] 、de Groot等 [ 19 ] 的研究均表明, 当木霉孢
子浓度为 107 个·mL - 1 时, 能获得较高的转化率。
因此, 本研究也将受体真菌的细胞浓度控制在这个
数值左右。高兴喜等 [ 15 ] 分别取不同体积处于对数
生长期( OD6 60约为 0. 62) 的农杆菌菌液与 100 μL木
霉菌分生孢子( 107 个·mL - 1 ) 混合培养, 结果表明,
适宜的农杆菌初始菌液量是 100 鶫 200 μL。本研究
认为适宜的农杆菌初始菌液量为 50 鶫 100 μL, 农杆
菌浓度过高会抑制真菌的生长, 引起严重污染, 不利
于转化子的获得。本研究下一步工作是对获得的少
根根霉阳性转化子进行脂肪酸组分分析以及优良转
基因菌株的筛选和中试。
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