全 文 ：林业科学研究　2007, 20 (3) : 328～333
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2007) 0320328206
地被菊间接体细胞胚发生途径的
转基因受体体系的研究
蒋细旺 1, 2 , 张启翔 13
(1. 北京林业大学园林学院 ,国家花卉工程技术研究中心 ,北京　100083; 2. 江汉大学医学与生命科学学院 ,湖北 武汉　430056)
摘要 :采用三步培养法建立了地被菊花品种‘玉人面 ’间接体细胞胚发生途径的转基因受体体系。试验以地被菊花
品种‘玉人面 ’茎段 (节间 )为外植体 ,研究了生长调节剂、光照强度等因子对其间接体细胞胚诱导和分化的影响 ,同
时进行了抗生素敏感性试验。结果表明 :胚性愈伤组织诱导培养基为 MS + KT 2. 0 mg·L - 1 + 2, 42D 2. 0 mg·L - 1 +
NAA 0. 5 mg·L - 1 ,诱导 15 d后 ,将获得的黄绿色致密颗粒状胚性愈伤组织转入胚性愈伤组织分化培养基 MS + KT
2. 0 mg·L - 1 + 2, 42D 1. 0 mg·L - 1 +NAA 0. 5 mg·L - 1中 ,诱导 15 d后再转入 MS + KT 2. 0 mg·L - 1 +NAA 0. 5 mg
·L - 1的分化培养基中培养 20 d,光照强度为 1 000～2 000 lx,胚性愈伤组织诱导率、分化率分别为 95. 3%、92. 7% ,
平均每个外植体分化的芽数为 17. 8个 ,获得的再生芽的稳定性为 99. 5%。抗生素敏感性试验表明 :地被菊花品种
‘玉人面 ’间接体细胞胚发生途径的转基因受体体系中 ,卡那霉素选择压为 20 mg·L - 1 ;头孢霉素在胚性愈伤组织
诱导时的选择压为 300 mg·L - 1 ,在胚性愈伤组织分化培养时选择压为 100 mg·L - 1。
关键词 :地被菊 ;间接体细胞胚发生 ;受体体系 ;抗生素
中图分类号 : S682. 1 文献标识码 : A
收稿日期 : 2007201231
基金项目 : 中国博士后科学基金 (20060390404)、北京市自然科学基金 (6072019)、国家转基因植物研究与产业化专项 ( JY032B228)、武
汉市科技攻关项目
作者简介 : 蒋细旺 (1964—) ,男 ,博士后 ,副教授 ,主要研究方向 :园林植物遗传育种及生物技术. 电话 : 13241438238; Email: xiwangjiang
@163. com3 通讯作者 :张启翔 (1956—) ,男 ,教授 ,博士生导师. 主要研究方向 :园林植物与观赏园艺. 电话 : 62338305; Email: zqx@ bjfu. edu. cn
Stud ies on Tran sgen ic Acceptor System of Ground2Cover
Chrysan them um V ia Ind irect Soma tic Em bryogenesis
J IANG X i2wang1, 2 , ZHANG Q i2xiang1
(1. Department of Landscape Horticulture, National Floriculture Engineering Research Center, Beijing Forestry University,
Beijing　100083, China; 2. College of Medicine and L ife Science, J ianghan University,W uhan　430056, Hubei, China )
Abstract: In this paper transgenic accep tor system s of chrysanthemum cv.‘Yurenmian’via indirect somatic embryogene2
sis were established by three steps cultivation. The authors studied the effects of hormones, illumination intensity on indi2
rect somatic embryogenesis through stem segments ( internodal segments) as exp lants. Results showed that: embryogenic
calli induction medium wasMS + KT 2. 0 mg· L - 1 + 2, 42D 2. 0 mg·L - 1 +NAA 0. 5 mg·L - 1 , 15 days later, yellow
greenish, compact nodular calliwere transferred embryogenic calli differentiation medium MS plus KT 2. 0 mg·L - 1 , 2, 42
D 1. 0 mg·L - 1 and NAA 0. 5 mg·L - 1 for 15 days, and were transferred differentiation medium MS plus KT 2. 0 mg·L - 1
and NAA 0. 5 mg·L - 1 for 20 days. Illumination intensity was 1 000～2 000 lx. The highest rate of embryogenic calli
reached 95. 3% , the highest rate of embryogenic calli differentiation reached 92. 7% , average number of shoots per stem
segment exp lant was 17. 8, and stability of regeneration shoots reached 99. 5%. Experiments of the sensitivity of antibiotics
第 3期 蒋细旺等 :地被菊间接体细胞胚发生途径的转基因受体体系的研究
for transgenic accep tor systems of chrysanthemum cv.‘Yurenmian’via indirect somatic embryogenesis showed: the selec2
tion concentrations of kanamycin was 10 mg·L - 1 , the selection concentrations of cefotaxime was 300 mg·L - 1while em2
bryogenic calli were induced and 100 mg·L - 1 while embryogenic calli differentiation.
Key words: Ground2Cover Chrysanthemum ( Chrysan them um m orifoliu ) ; indirect somatic embryogenesis; accep tor
system; antibiotics
菊花 (Chrysan them um m orifolium Ramat. )是深受
人们喜爱的传统名花之一 ,约占全世界花卉消费总量
的 23% [ 1 ] ;它既可作盆栽花卉 (盆菊 )、切花花卉 (切
菊 ) ,也是城市园林绿化的地被花卉 (地被菊 ) ,还是重
要的保健饮用花卉 (茶用菊 )。地被菊是北京林业大
学中国工程院院士陈俊愉教授研究 40余年获得的植
株低矮、花叶繁盛、适应性强的品种群 [ 2 ] ,目前在我国
已进行了大面积的繁殖、推广和应用 [ 3, 4 ]。
植物体细胞胚发生 ( somatic embryogenesis)在植
物组织培养中是一种非常普遍的现象 [ 5 ] ,早在 1980
年 , Sharp等 [ 6 ]就把体胚发生方式概括为 2种 :一是
从外植体上直接发生 ,不经过愈伤组织 ,即直接体细
胞胚发生 ;二是经过愈伤组织阶段再分化为体胚 ,即
间接体细胞胚发生。许多研究表明 ,植物体细胞胚
的形成多通过间接途径产生 ,在愈伤组织中某些体
细胞可转化为胚性细胞 ,胚性细胞继续分裂形成多
细胞原胚以及不同发育时期的体细胞胚 ,从而获得
数量更多、再生率更高的体细胞胚和再生植株 [ 7, 8 ]。
体胚除了通过直接或间接方式诱导成苗和作为
分子生物学研究的材料以外 [ 9, 10 ] ,胚状体发育及其
植株再生系统也是最理想的基因转化受体系统。体
细胞胚是由类似合子胚特性的胚性细胞发育而来 ,
这些胚性细胞具有很强的接受外源 DNA的能力 ,是
理想的基因转化感受态细胞 ;而且胚性细胞繁殖量
大 ,同步性好 ,转化后的胚性细胞可顺利发育成胚状
体及完整的转基因植株。大量研究表明 ,体胚发生
多是单细胞起源 ,转化获得的转基因植株嵌合体
少 [ 9, 10 ] ,因此 ,植物体细胞胚发生可作为理想的遗传
转化受体体系 [ 7, 11 ]。
菊花体细胞胚发生的最早报道是 1991年 May
等 [ 12 ]利用菊花品种‘ Iridon’叶片 ,在附加 2, 42D 1. 0
mg·L - 1、6 - BA 0. 2 mg·L - 1、9% ～18%蔗糖的改
良 MS基本培养基上 ,经过暗、光、暗的交替培养 ,获
得了直接体细胞胚发生植株 ;并发现菊花体细胞胚
的产生起源于单细胞 ,获得的再生植株在表型上未
产生变异 ;同时也发现菊花体细胞胚发生有较强基
因型依赖性 ,在 23个品种中有 12个产生了体细胞
胚 ,但只有 5个品种获得了再生植株。 Pavingerova
等 [ 13 ]也从叶片中获得了单细胞起源的体细胞胚 (品
种为‘W hite Snowdon’) , Shinoyama等 [ 9 ]建立了对基
因型无依赖性的简洁而高效的菊花叶片体细胞胚发
生的方法 (品种为‘Shuho2no2chikara’) , Tanaka
等 [ 14 ]和 Mandal等 [ 10 ]均从菊花的管状花中诱导出体
细胞胚 ,洪波等 [ 7 ]利用地被菊花品种‘Fall Color’幼
嫩叶片为外植体 ,诱导出 96%的胚性愈伤组织 ,最
终 93%的供试外植体通过间接胚状体途径获得了
芽的再生 ,但关于再生芽的稳定性未作研究。
近年来 ,本实验室通过器官发生途径筛选出地
被菊花品种‘玉人面 ’是再生率较高的品种之一 [ 15 ] ,
同时通过前期的转基因研究 ,发现存在较强的基因
型依赖性 ,转化效率也较低 [ 16 ]。因此 ,希望建立高
效的菊花体细胞胚发生再生体系和转基因受体体
系 ,从而克服菊花转基因较强的基因型依赖性 ,提高
转化效率。故本研究借鉴前人研究体胚发生成功的
经验 ,在前期建立了直接体细胞胚再生体系的基础
上 (另文发表 ) ,开展地被菊花体细胞胚间接发生诱
导和调控技术的研究 ,旨在建立稳定的地被菊花间
接体细胞胚发生体系 ,从而建立间接体细胞胚发生
途径的转基因受体体系 ,为下一步进行以体细胞胚
为受体的转基因技术研究打下基础。
1　材料与方法
1. 1　材料
试验材料为地被菊花品种‘玉人面 ’,由北京林
业大学陈俊愉院士提供 ;以 MS为基本培养基 ,试验
激素分别为 2, 42D、62BA ( 62苄基腺嘌呤 )、KT (激动
素 )、NAA (α2萘乙酸 )、IAA (吲哚乙酸 )、IBA (吲哚
丁酸 ) ,单位均为 mg·L - 1。
1. 2　方法
1. 2. 1　茎段 (节间 )外植体的准备 　将温室栽培的
地被菊花品种‘玉人面 ’的带腋芽茎段在自来水下
冲洗干净后 ,先用 70%酒精消毒 30 s,无菌水冲洗 3
次 ,再用 0. 1%升汞消毒 3 m in,用无菌水冲洗 6次 ,
升汞消毒重复 2次 ,接种到 MS + 62BA 1. 0mg·L - 1
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林 　业 　科 　学 　研 　究 第 20卷
+NAA 0. 1 mg·L - 1培养基上 , 5周后每外植体可增
殖 4～6个无菌丛生芽 ,其间和其后用同样培养基继
代。从增殖 20 d左右的幼苗上切取 3～5 mm的茎
段 (节间 )为外植体 ,水平接种在培养基上。每培养
皿 20～30个外植体 ,重复 3次。培养温度为 ( 25 ±
2) ℃,日光灯光源 ,光照 (2 000 lx) 12 h·d - 1 [ 3 ]。
1. 2. 2　茎段外植体间接体细胞胚发生与分化
1. 2. 2. 1　62BA和 2, 42D以及 KT和 2, 42D对茎段
胚性愈伤组织的诱导 　以 MS为基本培养基 ,分别
附加不同浓度的 2, 42D、KT和 62BA组成胚性愈伤
组织诱导培养基。2, 42D浓度分别为 0. 0、0. 5、1. 0、
2. 0、4. 0 mg·L - 1 , KT和 62BA浓度分别为 0. 0、0. 1、
0. 5、1. 0、2. 0 mg·L - 1。对茎段外植体进行诱导培
养 15 d后 ,统计胚性愈伤组织的诱导率。
1. 2. 2. 2　KT、2, 42D与 NAA或 IAA或 IBA对茎段
胚性愈伤组织的诱导 　选择 MS + KT 2. 0 mg·L - 1
+ 2, 42D 2. 0 mg·L - 1培养基分别附加浓度为 0. 1、
0. 5、1. 0、2. 0、4. 0 mg·L - 1的 NAA、IAA、IBA,经 15
d的培养 ,研究三激素对茎段胚性愈伤组织诱导的
影响 ,以适应转基因操作中 ,虽然去除了 2, 42D而仍
需生长素存在的要求。
1. 2. 2. 3　不同培养方式对茎段胚性愈伤组织分化的
影响　外植体在 MS + KT 2. 0 mg·L - 1 + 2, 42D2. 0
mg·L - 1 +NAA 0. 5 mg·L - 1培养基上经 15 d的诱导
培养 ,获得黄绿色致密颗粒状胚性愈伤组织 ,将该胚
性愈伤组织按三种方式进行分化培养 ,分别是 :一步
培养法 ,即继续在该培养基上培养 35 d;二步培养法 ,
即胚性愈伤组织转入去除 2, 42D的 MS + KT 2. 0 mg
·L - 1 +NAA 0. 5 mg·L - 1的培养基中培养 35 d;三步
培养法 ,即胚性愈伤组织转入分化培养基 MS + KT
2. 0 mg·L - 1 + 2, 4 - D 1. 0 mg·L - 1 +NAA 0. 5 mg·
L - 1中 ,诱导 15 d后再转入 MS + KT 2. 0 mg·L - 1 +
NAA 0. 5 mg·L - 1的分化培养基中培养 20 d。分别
计算胚性愈伤组织的分化率和平均每外植体分化的
再生芽数 ,比较不同培养方式对茎段胚性愈伤组织分
化、再生的影响 ,确定适宜的分化培养方式。
1. 2. 2. 4　不同光照强度对茎段外植体间接体细胞胚发
生与分化的影响 　在光照强度分别为 0、500、1 000、
2 000、3 000、4 000 lx时 ,利用三步培养法 ,比较不同光
照强度对‘玉人面’间接体细胞胚发生与分化的影响。
1. 2. 3　间接体细胞胚再生植株的获得、移植及稳定
性研究 　当外植体培养 50 d后获得不定芽达 1～2
㎝长时移至 1 /2MS +NAA 0. 1 mg·L - 1的生根培养
基中 [ 3 ] ,诱导生根后得到再生苗。将再生苗驯化后
移植到直径 5～8 cm的小盆中 ,盆中培养基质为混
合均匀的河砂 ∶草炭土 ∶珍珠岩 = 1∶1∶1 (体积比 ) ,
进行正常的室外栽培 ,以扦插繁殖的‘玉人面 ’幼苗
为对照 ,按常规栽培管理 , 6个月后比较株高、冠幅、
叶片长度、花期、开花直径等的差异 ,研究再生植株
的稳定性。
1. 2. 4　抗生素敏感性试验 　根据体细胞胚诱导的结
果 ,利用筛选出的适宜的诱导、分化培养基附加抗生
素如卡那霉素、头孢霉素进行敏感性试验。将在生根
培养基中生长 3周的幼苗的茎段外植体置于附加不
同质量浓度卡那霉素 ( 0、5、10、15、20、40、80 mg·
L - 1 )、头孢霉素 (0、100、200、300、400、500 mg·L - 1 )
的培养基上。培养条件同 1. 2. 1节 , 50 d后观察并统
计不同浓度的卡那霉素、头孢霉素对‘玉人面’间接体
细胞胚诱导、发生的影响 ,确定抗生素的选择压。
2　结果与分析
2. 1　地被菊花品种‘玉人面 ’间接体细胞发生的诱
导和分化
2. 1. 1　KT和 2, 42D对茎段胚性愈伤组织诱导的影
响 　在分别附加不同浓度的 62BA 和 2, 42D 的 MS
培养基中培养 15 d后观察 ,胚性愈伤组织诱导率较
低 ,最大仅为 12. 6% ,出现在 62BA 2. 0 mg·L - 1 +
2, 42D 2. 0 mg·L - 1的组合中 ,其余的或只诱导出非
胚性愈伤组织 ,或诱导出白色不定根 ,甚至部分外植
体褐化 ,故‘玉人面 ’的茎段胚性愈伤组织诱导在 62
BA + 2, 42D的组合中不予考虑 (数据未显示 )。从
表 1可看出 :在 KT + 2, 42D的组合中 ,无 2, 42D、KT
的第 1号培养基 ,无胚性愈伤组织产生 ;当仅有 2, 42
D ,而无 KT时 ,即在第 2、7、12、17号培养基中 ,会通
过器官发生途径诱导大量白色毛状根形成 ,不会产
生胚性愈伤组织 ;当 2, 42D与 KT比值较大 ,即在第
3、8、13、18、19培养基中 ,在切口处有极少量的黄绿
色胚性愈伤组织产生 ,但被切口处产生的较多白色
毛状根所覆盖 ;在第 4、5、6号培养基中 ,可形成绿色
疏松水渍状胚性愈伤组织 ;在第 9、14、15、20、21号
培养基中 ,形成黄白色松软胚性愈伤组织 ;在第 10、
11、16号培养基中 ,形成黄绿色致密颗粒状胚性愈
伤组织。结合胚性愈伤组织诱导率 ,发现地被菊花
品种‘玉人面 ’茎段胚性愈伤组织诱导较适宜的培
养基是 MS + KT 2. 0 mg·L - 1 + 2, 42D 2. 0 mg·L - 1 ,
其胚性愈伤组织的诱导率为 84. 6%。在该诱导培
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第 3期 蒋细旺等 :地被菊间接体细胞胚发生途径的转基因受体体系的研究
养基中 ,培养 5～7 d后 ,茎段外植体两侧开始膨大
呈哑铃形 ,形成浅黄绿色、较硬愈伤组织 , 15 d后在
体视显微镜下观察哑铃状愈伤组织形成颗粒状的胚
性愈伤组织。另外 ,将绿色疏松水渍状胚性愈伤组
织、黄白色松软胚性愈伤组织、黄绿色致密颗粒状胚
性愈伤组织进行比较 ,前 2种细胞分裂快 ,生长量
大 ,后期分化成体胚的比例低 ,故黄绿色致密颗粒状
胚性愈伤组织是较好的胚性愈伤组织。
表 1　2, 42D和 KT对茎段胚性愈伤组织诱导的影响
培养基编号 2, 42D浓度 / (mg·L - 1 ) KT浓度 / (mg·L - 1 ) 胚性愈伤组织诱导率 /% 愈伤组织颜色和特征
1 (CK) 0. 0 0. 0 0. 0 ±0. 0 绿色 ,非胚性愈伤组织
2 0. 5 0. 0 0. 0 ±0. 0 绿色 ,非胚性愈伤组织
3 0. 5 0. 1 3. 1 ±0. 2 极少量黄绿色胚性愈伤组织 ,产生较多的白色毛状根
4 0. 5 0. 5 28. 4 ±2. 3 绿色疏松水渍状胚性愈伤组织
5 0. 5 1. 0 44. 7 ±1. 1 b 绿色疏松水渍状胚性愈伤组织
6 0. 5 2. 0 32. 2 ±3. 5 绿色疏松水渍状胚性愈伤组织
7 1. 0 0. 0 0. 0 ±0. 0 绿色 ,非胚性愈伤组织
8 1. 0 0. 1 6. 2 ±0. 5 极少量黄绿色胚性愈伤组织 ,产生较多的白色毛状根
9 1. 0 0. 5 52. 7 ±5. 3 黄白色松软胚性愈伤组织 ,形成少量白色毛状根
10 1. 0 1. 0 66. 4 ±6. 2 黄绿色致密颗粒状胚性愈伤组织
11 1. 0 2. 0 69. 5 ±6. 9 黄绿色致密颗粒状胚性愈伤组织
12 2. 0 0. 0 0. 0 ±0. 0 绿色 ,非胚性愈伤组织
13 2. 0 0. 1 4. 8 ±0. 4 极少量黄绿色胚性愈伤组织 ,产生较多的白色毛状根
14 2. 0 0. 5 31. 3 ±3. 1 黄白色松软胚性愈伤组织 ,形成少量白色毛状根
15 2. 0 1. 0 51. 6 ±4. 2 黄白色松软胚性愈伤组织
16 2. 0 2. 0 84. 6 ±7. 7 黄绿色致密颗粒状胚性愈伤组织
17 4. 0 0. 0 0. 0 ±0. 0 绿色 ,非胚性愈伤组织
18 4. 0 0. 1 3. 3 ±0. 2 极少量黄绿色胚性愈伤组织 ,产生较多的白色毛状根
19 4. 0 0. 5 4. 6 ±0. 4 极少量黄绿色胚性愈伤组织 ,产生较多的白色毛状根
20 4. 0 1. 0 24. 6 ±1. 4 黄白色松软胚性愈伤组织
21 4. 0 2. 0 26. 3 ±2. 6 黄白色松软胚性愈伤组织
2. 1. 2　MS + KT 2. 0 mg·L - 1 + 2, 42D 2. 0 mg·L - 1
培养基中分别附加不同浓度的 NAA、IAA、IBA对茎
段胚性愈伤组织诱导的影响 　在 MS + KT 2. 0 mg·
L - 1 + 2, 42D2. 0 mg· L - 1的培养基中 ,分别附加不
同浓度的 NAA、IAA、IBA ,培养 15 d后发现 IAA、IBA
诱导胚性愈伤组织的能力均低于 40% (数据未显
示 ) ,因此不予考虑。对于 NAA ,当浓度为 0. 5 mg·
L - 1时 ,胚性愈伤组织诱导率最大 (表 2) ,达 95. 3% ,
且产生的是黄绿色致密颗粒状胚性愈伤组织。可
见 ,MS + KT 2. 0 mg·L - 1 + 2, 42D2. 0 mg·L - 1 +
NAA 0. 5 mg·L - 1是地被菊花品种‘玉人面 ’茎段胚
性愈伤组织诱导的适宜培养基。
表 2　M S培养基中 2, 42D、KT、NAA对茎
段胚性愈伤组织诱导的影响
代号 MS培养基激素组成 胚性愈伤组织诱导率 /%
1 KT 2. 0 + 2, 42D 2. 0 84. 6 ±7. 7 b
2 KT 2. 0 + 2, 42D 2. 0 +NAA 0. 1 79. 4 ±6. 4 b
3 KT 2. 0 + 2, 42D 2. 0 +NAA 0. 5 95. 3 ±8. 5 a
4 KT 2. 0 + 2, 42D 2. 0 +NAA 1. 0 83. 1 ±6. 2 b
5 KT 2. 0 + 2, 42D 2. 0 +NAA 2. 0 49. 8 ±3. 9 c
6 KT 2. 0 + 2, 42D 2. 0 +NAA 4. 0 47. 1 ±2. 9 c
　　注 :表中数据为平均值 ±标准误 ;同一栏中不同英文字母表示数
据间差异显著 ( P = 0. 01)。各种激素的单位均为 mg·L - 1
2. 1. 3　不同培养方式对菊花胚性愈伤组织分化
的影响 　从表 3可看出 :由 M S + KT 2. 0 m g·L - 1
+ 2 , 4 2D 2. 0 m g·L - 1 + NAA 0. 5 m g·L - 1培养
基诱导的胚性愈伤组织 ,按三步培养法进行分化
培养较好 ,这是因为胚性愈伤组织在 2 , 4 2D浓度
减半的分化培养基中培养 15 d后 ,诱导了体胚的
形成 ,在体视显微镜下观察可清晰地分为球形
胚、鱼雷形胚、心形胚、子叶胚 , 1个茎段外植体诱
导的体胚数最高的为 24个 (数据未显示 ) 。诱导
出体胚的外植体转入无 2 , 4 2D的分化培养基 M S
+ KT 2. 0 m g·L - 1 + NAA 0. 5 m g·L - 1中培养 20
d后 ,能顺利地获得再生芽 ,从而进一步验证了
“诱导脱分化后必须及时降低或去掉 2 , 4 2D ,胚性
细胞才能正常发育 ”的观点 [ 8 ] 。
表 3　不同培养方式对胚性愈伤组织分化的影响
培养类型 胚性愈伤组织分化率 /%
平均每外植体分化
的芽数 /个
茎段诱导的最多
体胚数 /个
一步培养法 57. 5 ±5. 1 c 9. 6 ±0. 8 c 11. 8 ±0. 9 c
二步培养法 87. 5 ±7. 2 b 13. 1 ±1. 6 b 17. 5 ±1. 8 b
三步培养法 92. 7 ±8. 1 a 17. 8 ±1. 9 a 24. 0 ±2. 1 a
　　注 :表中数据为平均值 ±标准误 ;同一栏中不同英文字母表示数
据间差异显著 ( P = 0. 01)。
133
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 20卷
2. 1. 4　不同光照强度对间接体细胞胚发生的影响
　从表 4可看出 :不同光照强度导致分化率和再生
芽数的差异极显著。当进行暗培养时 ,没有胚性愈
伤组织和再生芽产生 ,即不能完成间接体细胞胚的
发生和分化 ;当光照强度为 500 lx时 ,胚性愈伤组织
表 4　不同光照强度对‘玉人面 ’间接体
细胞胚发生与分化的影响
光照强度 / lx 胚性愈伤组织分化率 /%
平均每外植体
分化的芽数 /个
0 0. 0 ±0. 0 d 0. 0 ±0. 0 d
500 73. 5 ±7. 2 b 12. 1 ±1. 6 b
1 000 91. 3 ±7. 6 a 16. 1 ±1. 6 a
2 000 92. 7 ±8. 1 a 17. 8 ±1. 9 a
3 000 57. 5 ±5. 1 c 9. 6 ±0. 8 c
4 000 46. 3 ±4. 2 c 8. 1 ±0. 7 c
　　注 :表中数据为平均值 ±标准误 ;同一栏中不同英文字母表示数
据间差异显著 ( P = 0. 01)。
能正常分化 ,分化率为 73. 5% ,平均每外植体分化
的芽数为 12. 1个 ;当光照强度为 1 000～2 000 lx
时 ,胚性愈伤组织能正常分化 ,且分化率最高为
92. 7% ,平均每外植体分化的芽数最高达 17. 8个 ,
从而使茎段外植体能通过间接体细胞胚发生途径再
生和成苗 ;当光照强度超过 3 000 lx时 ,茎段外植体
易褐化 ,不能顺利完成间接体细胞胚的发生和分化。
2. 2　间接体细胞胚发生途径再生植株的稳定性
经过间接体细胞胚发生途径 ,共获得盆栽‘玉人
面 ’826株 ,其中 ,有 4株间接体细胞胚再生植株与
对照 (‘玉人面 ’扦插繁殖幼苗 )相比 ,在株高、冠幅、
叶片长度上存在显著差异 ,而在花期、开花直径上则
无差异 (表 5)。经过间接体细胞胚发生途径获得的
‘玉人面 ’再生苗的稳定性为 99. 5%。
表 5　间接体细胞胚发生获得的‘玉人面 ’再生植株的稳定性
类型 植株高度 / cm 冠幅 / cm 叶片长度 / cm 花期 / d 开花直径 / cm
对照 42. 7 ±4. 1 a 25. 1 ±1. 3 a 6. 4 ±0. 6 a 15. 6 ±1. 5 a 4. 8 ±0. 4 a
变异 1 47. 5 ±4. 2 b 29. 8 ±1. 3 b 8. 5 ±0. 6 b 16. 4 ±1. 3 a 4. 6 ±0. 3 a
变异 2 48. 3 ±4. 7 b 30. 4 ±2. 4 b 8. 7 ±0. 5 b 15. 8 ±1. 2 a 4. 7 ±0. 4 a
变异 3 47. 8 ±3. 6 b 29. 6 ±1. 2 b 8. 9 ±0. 7 b 15. 7 ±1. 1 a 4. 9 ±0. 5 a
变异 4 49. 6 ±4. 8 b 29. 9 ±2. 6 b 9. 1 ±0. 8 b 16. 1 ±1. 1 a 4. 8 ±0. 3 a
　　注 :表中数据为平均值 ±标准误 ;同一栏中不同英文字母表示数据间差异显著 ( P = 0. 05)。
2. 3　抗生素敏感性测定
2. 3. 1　卡那霉素选择压的确定 　由表 6可看出 :
‘玉人面 ’间接体细胞胚发生对卡那霉素比较敏感 ,
胚性愈伤组织的分化率在不同浓度的卡那霉素间存
在极显著差异。卡那霉素浓度在 15 mg·L - 1时 ,对
胚性愈伤组织的发生和分化有明显的影响 ,而在 20
mg·L - 1时 ,则表现出显著的抑制作用 ,故以该浓度
作为菊花间接体细胞胚发生途径的转基因受体体系
的卡那霉素选择压力 ;同时观察到 ,以生根培养基中
生长 3周的幼苗茎段为外植体的不同发育阶段影响
到卡那霉素选择压的确定。
2. 3. 2　头孢霉素敏感性测定 　由表 6可看出 :不同
浓度的头孢霉素对胚性愈伤组织的诱导和分化有不
同程度的影响。头孢霉素浓度在 300 mg·L - 1时 ,
即可达到较好的抑菌效果 ,虽能抑制农杆菌的生长 ,
但又影响外植体的正常分化和生长 ,故在胚性愈伤
组织分化培养时 ,头孢霉素的选择压降低为 100 mg
·L - 1。
表 6　卡那霉素、头孢霉素对‘玉人面 ’间接体细胞胚发生的影响
卡那霉素
浓度 /
(mg·L - 1 )
胚性愈伤组织
分化率 /% 外植体生长情况
头孢霉素
浓度 /
(mg·L - 1 )
体胚发
生率 /% 外植体生长情况
0 (CK) 92. 7 ±8. 1 a 生长正常 0 (CK) 92. 7 ±8. 1 a 生长正常
5 71. 8 ±6. 2 b 胚性愈伤组织生长受影响 ,呈黄褐色 100 86. 8 ±6. 8 b 滋生农杆菌几乎覆盖外植体 ,短期无影响
10 63. 1 ±5. 7 b 胚性愈伤组织生长受影响 ,部分外植体褐化 200 53. 6 ±4. 2 b 少数农杆菌滋生
15 33. 6 ±2. 7 c 生长停滞 ,表面湿润 ,呈褐色 300 15. 3 ±0. 9 c 无农杆菌滋生
20 13. 8 ±1. 6 d 绝大部分呈褐色、水渍状 400 7. 5 ±0. 5 d 无农杆菌滋生 ,但体胚发生率严重下降
40 5. 8 ±0. 8 e 褐色、水渍状 ,几乎全部褐色死亡 500 5. 1 ±0. 3 d 外植体褐化严重 ,难分化成苗
80 4. 6 ±0. 7 e 不生长 ,几乎全部褐色死亡
　　注 :表中数据为平均值 ±标准误 ;同列中不同英文字母表示数据间差异显著 ( P = 0. 01)。
233
第 3期 蒋细旺等 :地被菊间接体细胞胚发生途径的转基因受体体系的研究
3　结论
以地被菊花品种‘玉人面 ’茎段为外植体 ,接种
到胚性愈伤组织诱导培养基 MS + KT 2. 0 mg·L - 1
+ 2, 42D 2. 0 mg·L - 1 +NAA 0. 5 mg·L - 1中诱导 15
d,获得黄绿色致密颗粒状胚性愈伤组织后转入分化
培养基 MS + KT 2. 0 mg·L - 1 + 2, 4 - D 1. 0 mg·
L - 1 +NAA 0. 5 mg·L - 1中 ,诱导 15 d后再转入 MS
+ KT 2. 0 mg·L - 1 +NAA 0. 5 mg·L - 1的分化培养
基中培养 20 d,即三步培养法 ,在光照强度为 1 000
～2 000 lx时 ,成功地实现了间接体细胞胚的发生与
植株再生 ,胚性愈伤组织诱导率为 95. 3% ,分化率
为 92. 7% ,平均每外植体分化的芽数为 17. 8个 ,获
得的再生芽的稳定性为 99. 5%。抗生素敏感性测定
表明 ,在地被菊花品种‘玉人面 ’间接体细胞胚发生
途径的转基因受体体系中 , 卡那霉素选择压为 20
mg·L - 1 ;头孢霉素在胚性愈伤组织诱导时的选择
压为 300 mg·L - 1 ,在胚性愈伤组织分化培养时的
选择压为 100 mg·L - 1。
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