全 文 ：林 业科 学研 究 2010, 23( 4) : 626 鶫 628, 封三
Forest Research
文章编号: 1001-1498( 2010) 04-0626-04
长白山区珍稀濒危植物野生玫瑰植株再生体系的建立
杨丽娟1 , 顾地周1 * , 秦 莉2 , 何雪梅1
( 1 . 通化师范学院生物系 , 吉林 通化 134002; 2. 吉林省通化市林场 吉林 通化 134001)
关键词: 玫瑰; 离体培养; 均匀设计
中图分类号: S722.3 文献标识码: A
收稿日期 : 2009-05-08
基金项目 : 吉林省科技厅资助项目 ( 200705C05)
作者简介 : 杨丽娟 ( 1965— ) , 女 , 吉林通化人 , 副教授 , 主要从事长白山区珍稀濒危植物和药用植物的细胞生物学研究 . E-mail: thpgjw
@ 163. com
* 通讯作者 : 顾地周 ( 1973— ) , 男 , 吉林通化人 . gudizhou@ 163 . com
Plant Regeneration System of Rare and Endangered Wild Plant
Rosa rugosa in Mountain Changbai
YANG Li-juan
1
, GU Di-zhou
1
, QIN Li
2
, HE Xue-mei
1
( 1. Department of Biology, Tonghua Normal University, Tonghua 134002, Jilin, China;
2. Forest Farm of Tonghua City, Jilin Province, Tonghua 134001, Jilin, China)
Abstract: The tender stem of Rosa rugosa was used as explant and it suitable medium compositions were screened
through uniform design experiments. The results showed that the tissue culture of Rosa rugosa required different
kinds of culture medium in different phases. The most suitable culture media were as follows: B5 + 6-BA 2. 90 mg·
L
- 1
for shoots regeneration immediately at base of tender stem, the rate of regeneration was 96% ; 1 /2 MS( macro-
elemenyts) + IBA 0. 07 mg·L- 1 for rooting, the rooting rate was more than 98. 5% . Plant regeneration system of
Rosa rugosa had been successfully established.
Key words: Rosa rugosa; in vitro culture; uniform design
玫瑰( Rosa rugosa Thunb. ) 又称玫瑰花, 是蔷薇
科 ( Rosaceae) 蔷薇属( Rosa L. ) 落叶灌木。该种为
国家三级重点保护植物。《中国珍稀濒危保护植物
名录( 第一册) 》中定为濒危种, 《中国物种红色名
录》定为易危种 [ 1 ] , 《吉林省野生动植物保护管理暂
行条例》中定其为省级一类重点保护植物。是待开
发的野生珍稀濒危药用植物, 花、果、根入药, 主治吐
血、痛经、咯血、乳痈、月经不调等症。该种玫瑰具有
喜光, 耐寒, 耐贫瘠, 抗风等特性, 可防止高山苔原带
的水土流失, 对维护生态平衡, 美化天池环境以及引
种驯化、开发利用于作护坡保土、园林绿化和培育玫
瑰新品种; 对研究该属植物的系统发育与地理分布
也有重要科学价值。玫瑰在长白山区数量非常稀
少, 仅在珲春市敬信乡有零星分布。近年来, 由于旅
游设施及道路的修建等人为因素的干扰, 其生境遭
到严重破坏。又因玫瑰的天然更新能力非常弱, 其
种子成熟度小, 种子繁殖可操作性极差, 插条繁殖生
根率和移栽成活率也极低, 使其开发及利用受到极
大限制。因此, 在保护好现有野生资源的同时, 本研
究以玫瑰新生嫩茎为外植体, 利用植物组织培养方
法, 采用均匀设计法, 以期筛选出玫瑰嫩茎离体培养
各阶段的培养基。目前, 与其同属的其他种植物的
离体培养已有报道, 但关于该种玫瑰植株再生体系
的研究迄今未见。
第 4 期 杨丽娟等: 长白山区珍稀濒危植物野生玫瑰植株再生体系的建立
1 材料与方法
1. 1 外植体材料的处理
2007 年 3 月于吉林省珲春市敬信乡采玫瑰休
眠枝条在实验室内水培促使休眠芽萌发, 待休眠萌
发并长至 2 鶫 3 cm时剪下, 将嫩枝条切割成 2 鶫 3
叶一段, 在超净工作台上用体积分数 75% 酒精涮洗
10 s, 用含质量浓度为 2% 青霉素的次氯酸钠( 质量
浓度为 3% ) 溶液浸泡 6 min, 无菌水冲洗 8 次, 无菌
滤纸吸干表面水分, 切除灭菌剂损伤的部分并切割
成一叶一段后作为外植体备用 [ 2] 。
1. 2 玫瑰嫩茎基部直接再生芽苗诱导培养基的
筛选
以 B5 为基本培养基, 内含蔗糖 20 g·L- 1 , 琼脂
粉 7. 5 g·L - 1 , 再附加不同质量浓度的细胞分裂素
6-BA( 由预试验确定为 2. 50 鶫 3. 10 mg·L - 1 ) 和生
长素 IBA( 由预试验确定为 0. 02 鶫 0. 06 g·L - 1 ) ,
调节 pH值为 5. 6, 外植体在温度 ( 22 ±2) ℃、光照
强度 1 500 lx、光照周期 14 h·d - 1条件下培养, 为了
提高玫瑰再生芽苗的速度和诱导率, 采用均匀设计
法 [ 3 - 4 ] , 每个处理接种茎段数为 10, 重复 3 次, 选用
U10 ( 102 ) 均匀表( 表 1) , 考察 6-BA 和 IBA 不同质量
浓度交叉配比对诱导率的影响。嫩茎培养 50 天统
计诱导率, 筛选最适合玫瑰嫩茎基部再生芽苗的诱
导培养基 [ 4 - 7 ] 。
表 1 玫瑰嫩茎基部直接再生芽苗诱导培养基的
U10 ( 10
2) 因素及水平设计
水平
因素 / ( mg· L - 1 )
6-BA( X1 ) NAA( X2 )
1 2 . 50 0. 02
2 2 . 60 0. 03
3 2 . 70 0. 04
4 2 . 80 0. 05
5 2 . 90 0. 06
6 3 . 00 0. 02
7 3 . 10 0. 03
8 2 . 70 0. 04
9 2 . 60 0. 05
10 2 . 50 0. 06
1. 3 玫瑰再生芽苗生根培养基的筛选
以 1 /2MS( 大量元素) 为培养基, 加入蔗糖 15 g
·L - 1 , 琼脂 7. 0 g·L- 1, 并附加不同浓度的 IAA( 由
预试验确定为 0. 10 鶫 1. 00 mg·L- 1 ) 、IBA( 由预试
验确定为 0. 10 鶫 0. 30 mg·L - 1 ) 和 NAA( 由预试验
确定为 0. 02 鶫 0. 07 mg·L- 1 ) , 调节 pH 值为 5. 6,
将生长健壮的再生芽苗切下接种到培养基中, 在温
度( 23 ±2) ℃、光照强度 1 100 lx、光照周期 8 h·
d
- 1条件下培养。为了提高玫瑰的生根率, 采用均匀
设计法, 每个处理接种茎段数为 10, 重复 3 次, 选用
U1 0( 10
3 ) 均匀表 ( 表 2) , 考察生长素 IAA、IBA 和
NAA 不同质量浓度交叉配比对生根率的影响。再
生芽苗茎段培养 35 天统计生根率, 筛选最适合玫瑰
组培苗生根的培养基。
表 2 玫瑰再生芽苗生根培养基的 U10( 10
3 ) 因素及水平设计
水平
因素 / ( mg· L - 1 )
IAA ( X1 ) IBA( X2 ) NAA( X3 )
1 0 . 10 0. 10 0. 02
2 0 . 20 0. 15 0. 03
3 0 . 30 0. 20 0. 04
4 0 . 40 0. 25 0. 05
5 0 . 50 0. 30 0. 06
6 0 . 60 0. 30 0. 07
7 0 . 70 0. 25 0. 05
8 0 . 80 0. 20 0. 04
9 0 . 90 0. 15 0. 03
10 1 . 00 0. 10 0. 02
1.4 数据处理与分析
采用均匀设计法进行初步规律设计性试验, 数据
分析处理应用均匀设计软件( Uniform Design 3. 0V) 。
2 结果与分析
2.1 B5 培养基中不同质量浓度 6-BA 和 IBA 配比
对玫瑰嫩茎基部直接再生芽苗的影响
由表 3 试验结果可得回归方程 Y = - 56. 1 +
46. 8X1 , 经计算, 复相关系数 R = 0. 901 7, 剩余标准
差 s = 4. 89, 检验值 Ft = 34. 81, 临界值 F( 0 . 01 , 1, 8 ) =
11. 26, Ft > F( 0. 01 , 1, 8 ) , 表明回归方程有意义。对 X1
方程项进行显著性检验可知: X1 方程项对 Y影响均
显著。根据回归方程求出 Y 的最优组合为: X1 =
3. 10, 在此组合基础上求得最优解: y = 88. 2, 此解为
回归方程的解析解, 需按公式 Y = y ±uα· s( 其中 uα
为正态分布的双侧分位数, s 为剩余标准差 ) 计算出
优化值区间估计为 Y = 88. 2 ±16. 4, 即 71. 8% 鶫
104. 6% 。通过表 3 试验结果和回归方程可知, IBA
对诱导率 Y值的影响不显著, 6-BA 超过 3. 00 mg·
L - 1时芽苗诱导率下降, 6-BA 在 2. 90 鶫 3. 00 mg·
L
- 1之间有较高的芽苗诱导率, 又以 6-BA 为2. 90、
2. 91、2. 92、2. 93、2. 94、2. 95、2. 96、2. 97、2. 98、
2. 99、3. 00 和 3. 10 mg·L - 1 , 不添加 IBA 的情况下
做了 12 个处理的试验, 重复 3 次, 发现 6-BA 在 2. 90
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林 业 科 学 研 究 第 23 卷
mg·L - 1时芽苗诱导率最高。因此, 将玫瑰嫩茎接
种到附加 6-BA 2. 90 mg·L - 1的 B5 培养基上进行再
生芽苗诱导培养, 培养 18 天, 基部产生颗粒状突起;
继续培养至 28 天, 颗粒状突起变为锥形突起并逐渐
伸长为芽苗( 图 1a) ; 培养至 45 天, 可诱导出大量芽
苗形成丛生芽团, 再生芽苗可生长至 1. 30 cm 以上,
且苗壮而整齐( 图 1b) , 芽苗诱导率达 96% 以上, 在
估计区间内, 且比表 3 中 10 个处理的诱导率均高。
因此, 玫瑰嫩茎直接再生芽苗的最佳诱导培养基为:
B5 + 6-BA 2. 90 mg·L - 1。
表 3 玫瑰嫩茎基部直接再生芽苗诱导培养基的
U10( 10
2) 均匀设计试验安排与结果
处理号
因素 / ( mg·L - 1 )
X1 X2
诱导率
Y /%
1 2. 50 0. 03 59. 0
2 2. 60 0. 04 64. 5
3 2. 70 0. 06 71. 0
4 2. 80 0. 02 78. 5
5 2. 90 0. 03 88. 0
6 3. 00 0. 05 83. 0
7 3. 10 0. 06 80. 0
8 2. 70 0. 02 70. 0
9 2. 60 0. 04 64. 5
10 2. 50 0. 05 56. 0
2.2 1/2MS培养基中不同质量浓度生长素配比对
玫瑰再生芽苗生根的影响
根据表 4 试验结果可得回归方程 Y = 108 -
144X2 , 经计算, 复相关系数 R =0. 965 1, 剩余标准差
s = 3. 09, 检验值 Ft = 108. 7, 临界值 F( 0 . 01, 1 , 8) =
11. 26, Ft > F( 0. 01 , 1, 8 ) , 显著, 说明回归方程有意义。
对 X2 方程项进行显著性检验可知: X2 方程项对 Y
影响均显著。根据回归方程求出 Y 的最优组合为:
X2 = 0. 10, 在此组合基础上求得最优解: y = 93. 6, 同
理, 按公式 Y = y ±uα· s 计算出优化值区间估计为
Y =93. 6 ±10. 4, 即 83. 2% 鶫 104. 0% 。通过表 4 试
验结果和回归分析结果可知, 仅 IBA 对生根率 Y 值
影响显著, 又因 IBA 与生根率 Y呈负相关, 猜测 IBA
在 0. 10 mg·L - 1以下有较高的生根率, 又以 IBA 为
0. 10、0. 09、0. 08、0. 07、0. 06、0. 05、0. 04、0. 03、
0. 02、0. 01、0. 00 mg·L- 1做了 11 个处理的试验, 重
复 3 次, 发现 IBA 在 0. 07 mg·L - 1 时再生芽苗茎段
生根率最高。即待嫩茎基部分化产生的再生芽苗长
至 1. 50 cm时, 将生长健壮的苗切下, 将其接种到附
加 IBA 0. 07 mg·L - 1 的 1 /2MS 培养基中, 培养 14
天发现茎段基部切口或近切口的茎部有独立的颗粒
出现, 继续培养至 21 天, 颗粒经由锥形状逐渐伸长
为根, 培养至 30 天, 有 3 鶫 5 条不定根 ( 图 1c) , 根
长可达 1. 00 cm以上, 苗高达 2. 00 cm以上, 根和苗
的形态、发育均正常, 生根率达 98. 5% 以上。在估
计区间内, 且比表 4 所列 10 个处理的生根率均高。
可见, 玫瑰组培苗的最佳生根培养基为: 1 /2MS +
IBA 0. 07 mg·L - 1。
表 4 玫瑰再生芽苗生根培养基的 U10 ( 103)
均匀设计试验安排与结果
处理号
因素 / ( mg·L - 1 )
X1 X2 X3
诱导率
Y /%
1 0. 10 0. 30 0. 05 65. 0
2 0. 20 0. 10 0. 04 93. 0
3 0. 30 0. 25 0. 02 77. 0
4 0. 40 0. 15 0. 07 86. 0
5 0. 50 0. 20 0. 03 81. 0
6 0. 60 0. 20 0. 03 80. 5
7 0. 70 0. 15 0. 06 88. 0
8 0. 80 0. 25 0. 02 72. 0
9 0. 90 0. 10 0. 04 90. 5
10 1. 00 0. 30 0. 05 59. 0
待生根的苗长至 2. 50 cm时, 从培养瓶中取出
试管苗, 在含有 5 mg·L - 1 高锰酸钾溶液中洗去苗
上残留的琼脂, 然后植入经 100 倍多菌灵消毒过的
腐烂松针、泥炭土和细河砂 ( 1∶2∶1) 混合的基质中,
用薄膜覆盖以保湿保温, 湿度保持在 80% , 温度控
制在 ( 20 ±2) ℃, 每天自然光照 9 h, 3 天后通风换
气, 7 天后揭膜, 每天适时喷洒清水 2 次, 成活率达
95% 以上。
a. 嫩茎基部直接再生芽苗的诱导培养 ; b. 嫩茎基部直接再生的芽苗 ; c. 生根培养 ; d. 移栽
图 1 玫瑰离体培养各阶段的培养物形态
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