全 文 ：林业科学研究　2005, 18 (5) : 585～589
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2005) 0520585205
免疫磁性捕获 EL ISA技术在松材线虫检测中的应用
曹　宇 1 , 李海燕 2 , 马洪周 1 , 胡加付 2 , 杨文博 1 , 王玉 2 , 白　钢 13
(1. 南开大学生命科学学院 ,天津　300071; 2. 国家林业局森林病虫害防治总站 ,辽宁 沈阳　110034)
摘要 :本研究采用种子聚合法合成聚苯乙烯磁性微球 ,并以兔抗松材线虫 IgG致敏 ,制备出能特异性地捕获松材线
虫蛋白抗原的免疫磁性微球。以生物素标记抗体为示踪抗体 ,并结合酶标亲和素检测系统 ,用于疫木样品的分析。
利用该方法对采自不同地区的 3种松树 ,其中松材线虫病木 17株、拟松材线虫病木 5株和健木 3株进行检测。实
验结果表明 ,虽然拟松材线虫病木也呈现了一定的交叉反应 ,但疫木中松材线虫总检出率为 94. 1% ,灵敏度达到
0. 1μg·mL - 1线虫蛋白抗原。研究表明免疫磁性捕获 EL ISA技术可直接捕获木屑中的微量线虫抗原 ,具有简便、快
速、准确等优点 ,是一种实用的松材线虫的快速检疫方法。
关键词 :免疫磁性微球 ;免疫磁性捕获 ; EL ISA;松材线虫
中图分类号 : S763　　　文献标识码 : A
收稿日期 : 2004201217
基金项目 : 国家“十五”重点科技攻关子项目“林业重大病虫害预警及控制技术研究”中的专题
作者简介 : 曹　宇 (1977—) ,男 (回族 ) ,辽宁沈阳人 ,博士研究生 13 通讯作者 : 白　钢 ,南开大学生命科学学院 , Email: gangbai@eyou. com;电话 : 0222235083711
D evelopm en t and Applica tion of Imm unomagnetic Separa tion EL ISA for
Iden tif ica tion of B u rsaphe lenchus xyloph ilus in P inewood
CAO Yu1 , L I Hai2yan2 , MA Hong2zhou1 , HU J ia2fu2 , YANG W en2bo1 , WANG Yu2yan2 , BA I Gang1
(1. College of L ife Science, Nankai University, Tianjin　300071, China; 2. General Station of
Forest PestManagement, State Forestry Adm inistration, Shenyang　110034, L iaoning, China)
Abstract:U sing dispersion polymerization, polystyrene magnetic m icrop sheres as carriers were p repared. By coating with
rabbit anti2B ursaphelenchus xylophilus (BX) IgG, the immunomagnetic m icrospheres ( IMMS) could specifically cap ture
nematode antigen on p inewood samp les. Taking biotinylated Anti2BX rabbit IgG as a tracer antibody, together with horse2
radish peroxidase labeled avidin, an enzyme2linked immuosorbent assay ( EL ISA) on IMMS was developed. Three kinds of
p ine trees harvested from different areas were detected by this method. A lthough there were a few crossed reactivity between
B ursaphelenchus m ucronatus antigen with Anti2BX IgG, the relevance ratio of BX on infected p ine trees was 94. 1% and the
detection lim it could be 0. 1μg·mL - 1 nematode antigen. The result suggested that immunomagnetic separation enzyme2
linked immuosorbent assay ( IMS2EL ISA) could directly cap ture trace nematode antigen on p inewood homogenizations. The
method showed p racticability of the quick quarantine inspection for its speediness, convenience and accuracy.
Key words: immunomagnetic m icrospheres; immunomagnetic separation; EL ISA; B ursaphelenchus xy loph ilus
松材线虫 (B ursaphelenchus xy loph ilus ( Steiner &
Buhrer) N ickle) (BX)是松树 ( P inus spp1)上的一种
病原生物 , 它以松墨天牛 (M oncham us a lterna tus
Hope)成虫为媒介进行传播 [ 1 ]。我国于 1982年秋
在南京紫金山松林中首次发现该病害 ,至今已经在
十多个省份发现 ,成为我国华东和华南广大地区松
林的灾难性病害 ,对我国国民经济及生态环境造成
十分巨大的损失 [ 2, 3 ]。长期以来 ,我国在松材线虫的
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 18卷
检疫方面基本上停留在抽样 ,线虫分离 ,镜检 ,鉴定
的常规检验上 [ 4 ] ,检定时间长 ,专业性要求高。但往
往由于线虫处于不同发育阶段 ,松材线虫在树体内
的分布和种群数量的不同 ,以及抽样和取样方法的
不同 ,直接影响检验的准确性。因此 ,建立一种快速
准确的检测方法显得十分迫切。目前 ,免疫学检测
技术成为细菌、病毒等植物病原体的主要检测手段 ,
在植物病害诊断上具有十分重要的价值 [ 5 ]。Lawler
等曾采用 EL ISA 和免疫印迹方法鉴定用葡萄孢
(B otry tis cinerea Pers. )培养的松材线虫和拟松材线
虫 [ 6 ] ,并进一步利用抗松材线虫的多克隆抗体检出
了欧洲赤松 ( P inus sy lvestris L inn1)木材表面的微量
松材线虫蛋白质 [ 7 ]。但该方法存在操作时间较长 ,
需要特殊的仪器设备 ,非特异性较明显等缺点 ,严重
影响了免疫学检测技术的推广。
免疫磁性微球 ( Immunomagnetic m icrospheres,
IMMS)是指连接有抗体或抗原的磁性微球 ,它通过
表面的抗体或抗原特异性地与目的物质结合 ,从而
赋予其磁响应性 ,在特定磁场的作用下 ,通过 IMMS
可以发生定向移动 ,从而实现其免疫学捕获和分离
的目的 [ 8, 9 ]。免疫磁性捕获 EL ISA 技术 ( Immu2
nomagnetic Separation Enzyme2L inked Immuosorbent
A ssay, IMS2EL ISA )是将 IMMS技术和酶联免疫吸附
试验结合起来的新兴技术 ,它不仅可以在含有大量
污染物的悬液中有选择地快速捕获目的抗原 ,还可
以通过标记抗体来测定样品中目的抗原的存在 ,目
前已经广泛地用于病原微生物和蛋白质类抗原的检
测 [ 10 ]。本文采用种子聚合法制备聚苯乙烯磁性微
球 ,以兔抗松材线虫 IgG抗体致敏制备 IMMS,并结
合酶标抗体建立免疫学分析方法用于疫木中松材线
虫抗原的检测 ,为疫木的快速检疫提供一种简捷、准
确、实用的检测方法。
1　材料与方法
111　材料
主要试剂 :活化生物素 ( sulfo2NHS2LC2B iotin EZ2
L inkTM , P IERCE,美国 ) ;二乙氨基乙基 (DEAE) 2纤维
素 ;辣根过氧化物酶 (HRP)标记亲和素 ; 3, 3’, 5, 5’2
四甲基联苯胺 ( TMB) ;牛血清白蛋白 (BSA)购自灏洋
生物制品公司 ,其他试剂均为分析纯。
主要仪器 :冷冻干燥机 (Christ, ALPHA 124) ;高
速冷冻离心机 (Beckman, 20RP52D ) ;酶标仪 (B IO2
TECH, ELX800) ;分部收集器、磁力搅拌器、电动搅
拌器、植物粉碎机、超声波清洗机等均为国产仪器。
本实验从采自江苏、安徽、浙江、广东和湖南等
地的 25株黑松 ( P inus thunberg ii Parl. )和 45株马尾
松 ( P. m asson iana Lamb. )样木中筛选出了 7个株系
线虫含量大、纯度高的样品 ,其中松材线虫样木 4
株 ,拟松材线虫 (B ursaphelenchus m ucrona tus Mam iya
et Enda)样木 3株。经常规分离、鉴定、收集线虫后 ,
置 4 ℃保藏 ,作为本实验的标准线虫样品。
选择采自湖北孝感的湖南伞滑刃线虫 (B u rsaph2
elenchus hunanensis Yin、Fang and Tarjan)和双胃线虫
(D iplogaster sp) ,以及其他植物病原线虫为对照线
虫样品。其中湖南伞滑刃线虫的特征为 :在热杀死
后雌虫虫体向腹面弯曲 ,雄虫呈“J”形 ,较雌虫个体
小 ,在显微镜下与松材线虫极为相似。雌虫口针长
20～26μm,阴道为向前倾斜的管道 ,无阴门盖 ;雄虫
交合刺弓形 ,无盔帽 ,踝状突半圆球形。而双胃线虫
较松材线虫活跃 ,显微镜下易与松材线虫容易区别 ,
口腔内无口针。
1. 2　抗松材线虫 IgG抗体的制备及生物素标记
取适量的上述松材线虫样品经超声波粉碎处
理 ,制备松材线虫抗原溶液 ,取蛋白量为 1 mg·
mL - 1的抗原溶液 1 mL,与等体积的弗氏佐剂混合乳
化后 ,在家兔皮下多点注射进行免疫。每隔两周加
强注射一次 , 8周后收集血清 ,灭活 ,得抗松材线虫
血清 (Anti2BX)。取上述血清 ,经硫胺盐析 , DEAE2
纤维素离子交换层析精制抗体 ,收集 IgG组分 ,透
析 ,冷冻干燥 ,得 Anti2BX IgG纯化抗体 [ 6 ]。
取 Anti2BX IgG 10 mg,溶于 2 mL的 0. 1 mol·
L - 1 NaHCO3 ( pH 值 8. 5 )溶液中 ,滴加 0. 5 mg·
mL - 1活化生物素 2 mL,搅拌 ,室温反应 2 h,加入甘
氨酸 20 mg终止反应。生物素结合抗体用 50%饱和
硫铵沉淀 2次后 ,沉淀物以 2 mL PBS ( 0. 01 mol·
L - 1磷酸缓冲液 , 0. 1 mol·L - 1 NaCl, pH值 7. 2)溶
解 , 4 ℃,透析 ,得生物素标记 IgG抗体 (Anti2BX IgG
biotin) , - 20 ℃冷冻保存备用。
1. 3　生物素亲和素 EL ISA夹心法的建立 ( BAS2
EL ISA)
　　取 5μg·mL - 1 Anti2BX IgG抗体 100μL于酶
标板的各孔中 , 37 ℃放置 3 h,包被酶标板。以 200
μL 封闭液 ( 0. 01 mol·L - 1磷酸缓冲液 , 0. 1 mol·
L - 1 NaCl, 1% BSA , 0. 1% NaN3 , pH值 7. 2) 室温放
置 3 h,封闭酶标板。分别加入用稀释液 (0. 01 mol
·L - 1磷酸缓冲液 , 0. 01 mol·L - 1 EDTANa2 ·2H2 O ,
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第 5期 曹 　宇等 :免疫磁性捕获 EL ISA技术在松材线虫检测中的应用
0. 1% BSA, pH值 7. 4)系列稀释的松材线虫抗原溶
液 100μL,室温反应 2 h后。用 200μL PBST (0. 01
mol·L - 1磷酸缓冲液 , 0. 1 mol·L - 1 NaCl, 0. 1%
Tween 20, pH值 7. 2)清洗 6次 ,再加入 500倍稀释
的 Anti2BX IgG biotin 100 μL,室温反应 2 h。经
PBST清洗后 ,加入 2 000倍稀释的辣根过氧化物酶
(HRP)标记亲和素 100μL,室温反应 30 m in。经
PBST清洗后 ,加入 TMB 底物溶液 ( 0. 1 mg·mL - 1
TMB , 0. 1% H2 O2 , 0. 1 mol·L - 1柠檬酸 , 0. 2 mol·
L - 1 NaH2 PO4 缓冲液 , pH 值 5. 2 ) 100 μL,反应 5
m in,加入 1 mol·L - 1 H2 SO4 50μL终止反应 ,于 450
nm处测定吸光度。
114　免疫磁性微球 ( IMM S)的制备
取 FeCl2 ·4H2 O 6 g溶于 37. 5%聚乙二醇溶液
400 mL中 ,加入 30%的 H2 O2 溶液 300μL,再滴加
NaOH溶液至 pH值 11, 60℃,搅拌反应 4 h,形成棕
黑色磁流体悬浮液。取上述磁流体 1. 0 g于 100 mL
60%乙醇溶液中 ,分别加入过氧化苯甲酰 6 g,苯乙
烯 36 mL,二乙烯基苯 0. 3 mL,在 N气保护下 , 65 ℃
反应 8 h,制备聚苯乙烯磁性微球 [ 7 ]。
取聚苯乙烯磁性微球 2 mL,加入 5 mg·mL - 1
Anti2BX IgG 2 mL, 4 ℃放置 24 h,包被微球。经 PBS
清洗后 ,加入封闭液封闭 ,制备成抗体致敏的免疫磁
性微球 , 4 ℃保存备用。
115　免疫磁性捕获 EL ISA( IM S2EL ISA)检测松
材线虫抗原
　　分别取阴性对照 (空白溶液 )及待测样品各 1 mL
于 1. 5 mL离心管中 ,再分别加入 15μL抗体致敏的
免疫磁性微球 , 37 ℃振荡反应 1 h。以磁铁的磁场聚
集固定微球 ,弃去反应液 ,用 PBST反复清洗 3次。
加入 500倍稀释的 Anti2BX IgG biotin 1 mL, 37 ℃,
继续振荡反应 1 h。清洗后再加入 2 000倍稀释的
酶标亲和素 1 mL,室温反应 30 m in。清洗后加入新
配制的 TMB底物 1 mL,反应 5 m in,加入 1 mol·L - 1
H2 SO4 终止反应 ,观察颜色变化 ,并于 450 nm处测
定其吸光度。
2　结果与分析
211　BAS2EL ISA夹心法的特异性考察
以 Anti2BX IgG为固相抗体 ,以 Anti2BX IgG bio2
tin结合 HRP标记亲和素为示踪物。如图 1所示 ,在
0. 1～10μg·mL - 1浓度范围内 ,线虫蛋白浓度与
HRP的结合酶活性呈现良好的相关性 ,检测灵敏度
为 0. 1μg·mL - 1。7株线虫样品检测结果表明 , 4
株松材线虫样品的线虫蛋白含量在 250～510μg·
mL - 1之间 ,但拟松材线虫样品也呈现了一定的交叉
反应 ,线虫蛋白含量为 28～185μg·mL - 1 (表 1)。
而松木上其它腐生的线虫 ,如双胃线虫和湖南伞滑
刃线虫以及其他植物病原线虫则交叉反应很小 ,说
明该方法对松材线虫线虫有一定的专属性。
图 1　线虫蛋白的 EL ISA夹心法测定标准曲线
表 1　采用 EL ISA夹心法确定线虫样品中松材线虫抗原的含量
样号 线虫种类 采集地 寄主 含量 / (μg·mL - 1 )
1 松材线虫 浙江宁波 黑 松 33. 32
2 松材线虫 江苏南京 黑 松 25. 63
3 松材线虫 江苏南京 马尾松 24. 84
4 松材线虫 江苏南京 马尾松 51. 1
5 拟松材线虫 安徽黄山 马尾松 18. 56
6 拟松材线虫 浙江绍兴 马尾松 7. 97
7 拟松材线虫 浙江绍兴 马尾松 2. 8
8 双胃线虫 湖北孝感 马尾松 0. 1
9 湖南伞滑刃线虫 湖北孝感 马尾松 0. 1
10 大豆孢囊线虫 ND
11 花生根结线虫 ND
　　ND: 采用 BAS - EL ISA无法确定
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林 　业 　科 　学 　研 　究 第 18卷
212　免疫磁性捕获 EL ISA的检测限
如图 2所示 ,种子聚合方法制备的聚苯乙烯磁性
微球其粒径为 50～100μm。经 Anti2BX IgG包被聚苯
乙烯磁性微球 ,致敏后通过 Lowry法测定未结合的
IgG浓度 ,由此推算聚苯乙烯磁性微球的抗体致敏量
为每毫升微球可吸附 0. 533 mg Anti2BX IgG抗体。
图 2　聚苯乙烯磁性微球照片
A:扫描电镜照片 ( ×1 000倍 ) ; B:光镜照片 ( ×400倍 )
以免疫磁性微球 ( IMMS)为固相载体 ,分别加入
0. 05、0. 1、0. 5、1. 0、10μg·mL - 1松材线虫蛋白抗
原 ,依据上述 IMS2EL ISA法考察松材线虫蛋白抗原
的检测限 ,每个浓度重复考察 3次 ,结果取平均值。
如图 3所示 ,与阴性对照相比其 P /N值分别为 0. 7、
2. 0、9. 0、13. 4、24. 8,最低检测限为 0. 1μg·mL - 1。
213　疫木中松材线虫抗原的检测
分别将于 2002年采自安徽、浙江、江苏、江西、
图 3　 IMS2EL ISA法检测限的考察
四川和天津等松材线虫疫区和非疫区不同类型的
25株松树样木 ,用贝尔曼漏斗法进行线虫分离 ,根
据形态学分类方法进行常规检验 ,确认松材线虫疫
木 17株 (黑松 6株 ,马尾松 11株 ) ,拟松材线虫病死
木或濒死木 5株 (均为马尾松 ) ,无任何线虫的健木
3 株 (黑松 2 株 , 雪松 ( Ced rus deodara ( Roxb. )
Loud. ) 1株 )。分别多点钻取上述样木木屑 ,各取
1 g于 8 mL PBS中 ,超声波振荡后 ,取混悬液分别采
用 BAS2EL ISA 和 IMS2EL ISA 法对样木中线虫抗原
进行检测 ,每个样品重复测定 3次 ,结果取平均值 ,
见表 2。
表 2　BAS2EL ISA和 IM S2EL ISA对松树样木中松材线虫抗原的检测结果
样号 采样地点 寄主 线虫种类
BAS2EL ISA
蛋白含量 / (μg·g - 1 )
IMS2EL ISA
( P /N值 ) 感染状况
1 浙江 平 湖 黑松 松材线虫 9. 6 6. 9 + +
2 浙江 宁 波 44. 4 20. 7 + + + +
3 江苏 林科院 20. 4 10. 8 + +
4 安徽 和 县 35. 6 14. 4 + +
5 安徽 马鞍山 15. 6 13. 7 + +
6 安徽 马鞍山 5. 7 8. 5 + +
7 浙江 宁 波 马尾松 松材线虫 14. 4 11. 3 + +
8 江苏 铁心桥 20. 0 12. 7 + +
9 江苏 林科院 22. 8 14. 1 + +
10 安徽 巢 湖 33. 6 18. 5 + + +
11 安徽 巢 湖 29. 2 9. 2 + +
12 安徽 当 涂 10. 0 3. 6 +
13 安徽 当 涂 ND 2. 2 + / -
14 安徽 当 涂 6. 8 7. 5 + +
15 安徽 当 涂 9. 6 5. 7 +
16 安徽 当 涂 18. 1 7. 2 + +
17 安徽 和 县 34. 4 18. 6 + + +
18 浙江 宁 波 马尾松 拟松材线虫 5. 6 8. 7 + +
19 浙江 绍 兴 65. 6 23. 4 + + + +
20 安徽 黄 山 7. 8 5. 1 +
21 江西 九 江 17. 6 6. 5 + +
22 四川 邻 水 ND 2. 6 + / -
23 安徽 马鞍山 黑松 无线虫 ND 1. 0 -
24 浙江 平 湖 (健康木 ) ND 1. 3 -
25 天津 南 开 雪松 ND 0. 7 -
　　注 : + + + + ; + + + ; + + ; + ; + / -和 - :分别表示信噪比 P /N > 20; > 15; > 6; > 3; > 2和 < 2。
ND:采用 BAS - EL ISA无法确定
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第 5期 曹 　宇等 :免疫磁性捕获 EL ISA技术在松材线虫检测中的应用
　　感染松材线虫的 6株黑松的检出率为 100% , 11
株马尾松的检出率为 90. 9%。感染拟松材线虫的 5
株马尾松有 4株被检出 ,而 3株健木均未被检出。
结果表明 ,虽然松材线虫与拟松材线虫存在一定的
交叉反应性 ,但采用 IMS2EL ISA 法检定的结果与
BAS2EL ISA法完全一致 ,疫木的感染程度与线虫抗
原的含量呈一定的相关性。由于取样部位和取样时
间不同导致线虫含量有一定的变化 ,也许松材线虫
寄主对松材线虫的抗性等原因使 EL ISA的实验结果
与形态学鉴定存在着一定的差异 , IMS2EL ISA法对
松材线虫感染疫木的总检出率为 94. 1% ,这一点还
有待进一步研究。
3讨论
免疫磁性捕获 EL ISA技术 ( IMS2EL ISA )将免疫
磁性微球 ( IMMS)的捕获技术与 EL ISA检测技术相
结合 ,对于常规 EL ISA灵敏限以下无法检测到的抗
原也可获得较高的检出率 ,因此日益受到人们的关
注 [ 13 ]。本研究采用种子聚合法合成聚苯乙烯磁性
微球 ,并以 Anti2BX IgG致敏制备出松材线虫检测用
免疫磁性微球。该微球可以直接从疫木的混悬液中
特异性的捕获和浓集线虫抗原 ,并通过生物素标记
抗体结合酶标亲和素建立 IMS2EL ISA法 ,用于疫木
样品中松材线虫蛋白抗原的检测 ,其灵敏度可以达
到 0. 1μg·mL - 1线虫蛋白抗原。与传统的检测技
术相比 ,该方法检测准确率高 ,操作简单 ,不需要借
助仪器设备 ,可以在短时间内对大量的疫木进行现
场检测 ,便于普及推广 ,是一种实用的松材线虫快速
检疫新方法。
另外 ,本实验由于没有得到能够区分松材线虫
和拟松材线虫的特异性抗体 ,该方法对两种线虫存
在一定的交叉反应。目前 ,我们实验室正在筛选松
材线虫的特征性抗原 ,并制备该种蛋白抗原的特异
性抗体 ,这将为松材线虫病害的进一步研究提供有
效的保证。
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