全 文 ：林业科学研究 ２０１２，２５（２）：１５７ １６２
ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ
文章编号：１００１１４９８（２０１２）０２０１５７０６
欧美杨渤丰１号高效组培再生体系建立
崔旭东１，苏晓华１，张冰玉１，褚延广１，黄秦军１，张伟溪１，刘勃洋２
（１．林木遗传育种国家重点实验室，中国林业科学研究院林业研究所，北京 １０００９１；
２．北京林业大学生物科学与技术学院，林木花卉遗传育种教育部重点实验室，北京 １０００８３）
收稿日期：２０１１１２２８
基金项目：林业公益性行业科研专项（２０１００４００４）和“８６３”国家高技术研究发展计划项目（２０１１ＡＡ１００２０１）
作者简介：崔旭东（１９８３—），男，在读博研究生，主要从事林木基因工程育种研究．
通讯作者： Ｅｍａｉ：ｓｕｘｈ＠ｃａｆ．ａｃ．ｃｎ
摘要：与白杨派树种相比，黑杨派树种一直因组培再生困难而限制了其在林木基因工程研究中的应用。本文以欧美
杨优良新品种———渤丰１号为试验材料，以其再生培养基中的植物生长调节剂配比、铜离子浓度、光照强度、卡那霉
素选择压等方面为切入点开展研究，建立了渤丰１号杨高效组培再生体系。使用该再生体系时，外植体的分化率和
生根率均达１００％，叶片的平均分化芽数多达２０个以上，组培苗移植成活率可达９８％，４０ｍｇ·Ｌ－１卡那霉素可以抑
制渤丰１号杨叶片的诱导与分化，２０ｍｇ·Ｌ－１卡那霉素可以抑制渤丰１号杨不定芽的生根；同时发现铜（Ｃｕ）元素是
渤丰１号杨外植体分化再生的一个关键因素，增加Ｃｕ２＋浓度能显著促进不定芽的诱导和分化。
关键词：欧美杨渤丰１号；高效再生体系；铜元素
中图分类号：Ｓ７２２．３ 文献标识码：Ａ
ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆａｎＥｆｉｃｉｅｎｔＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｏｆ
Ｐｏｐｕｌｕｓ×ｅｕｒａｍｅｒｉｃａｎａｃｌ．‘Ｂｏｆｅｎｇ１’
ＣＵＩＸｕｄｏｎｇ１，ＳＵＸｉａｏｈｕａ１，ＺＨＡＮＧＢｉｎｇｙｕ１，ＣＨＵＹａｎｇｕａｎｇ１，ＨＵＡＮＧＱｉｎｊｕｎ１，ＺＨＡＮＧＷｅｉｘｉ１，ＬＩＵＢｏｙａｎｇ２
（１．ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＦｏｒｅｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＴｒｅｅＢｒｅｅｄｉｎｇ，ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９１，Ｃｈｉｎａ；
２．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇｉｎＦｏｒｅｓｔｒｙＴｒｅｅｓＯｒｎａｍｅｎｔａｌＰｌａｎｔｓ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＣｏｌｅｇｅｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ
ａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＢｅｉｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｓｐｅｃｉｅｓｏｆＬｅｕｃｅｓｅｃｔｉｏｎ，ｔｈｅｄｉｆｉｃｕｌｔｙｉｎｐｌａｎｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｆｏｒ
ｔｈｅｓｐｅｃｉｅｓｏｆＡｉｇｅｉｒｏｓｓｅｃｔｉｏｎｉｓａｋｅｙｌｉｍｉｔｉｎｇｆａｃｔｏｒｆｏｒｔｈｅｉｒａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆｆｏｒｅｓｔｔｒｅｅｓ．Ｉｎ
ｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｔｈｅｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈｒｅｇｕｌａｔｏｒｓｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，ｃｏｐｐｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｌｉｇｈｔｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，ａｎｄｔｈｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎｐｒｅｓ
ｓｕｒｅｓｏｆｋａｎａｍｙｃｉｎｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｕｓｉｎｇｌｅａｖｅｓｏｆＰｏｐｕｌｕｓ×ｅｕｒａｍｅｒｉｃａｎａｃｌ．‘Ｂｏｆｅｎｇ１’ａｓｅｘｐｌａｎｔｓ，ａｎｄａ
ｓｔａｂｌｅａｎｄｈｉｇｈｅｆｉｃｉｅｎｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｕｓｉｎｇｔｈｉｓｓｙｓｔｅｍ，ｂｏｔｈｔｈｅｓｈｏｏｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｒａｔｅａｎｄ
ｒｏｏｔｉｎｇｒａｔｅｗｅｒｅｕｐｔｏ１００％，ａｎｄｔｈｅａｖｅｒａｇｅｎｕｍｂｅｒｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｓｈｏｏｔｓｉｎｅａｃｈｌｅａｆｅｘｐｌａｎｔｗａｓｕｐｔｏ２０，
ａｎｄｔｈｅｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｏｆｓｅｅｄｌｉｎｇｓｒｅａｃｈｅｄ９８％．Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｓｅｌｅｃｔｉｏｎｐｒｅｓｓｕｒｅｏｆｋａｎａｍｙｃｉｎｉｎｓｈｏｏｔｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ
ｆｏｒｌｅａｆｅｘｐｌａｎｔｗａｓ４０ｍｇ·Ｌ－１，ａｎｄｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｓｅｌｅｃｔｉｏｎｐｒｅｓｓｕｒｅｏｆｋａｎａｍｙｃｉｎｉｎｒｏｏｔｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔｏｆａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ
ｂｕｄｗａｓ２０ｍｇ·Ｌ－１．ＴｈｅａｕｔｈｏｒｓａｌｓｏｆｏｕｎｄｔｈａｔｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓｂｕｄｓｏｆＰｏｐｕｌｕｓ×ｅｕｒａｍｅｒｉｃａ
ｎａｃｌ．‘Ｂｏｆｅｎｇ１’ｃｏｕｌｄｂｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｐｒｏｍｏｔｅｄｂｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｃｏｐｐｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ａｎｄｔｈｉｓｉｓｔｈｅｆｉｒｓｔｒｅｐｏｒｔａ
ｂｏｕｔｔｈｅｋｅｙｒｏｌｅｏｆｃｏｐｐｅｒ（Ｃｕ）ｉｎｅｘｐｌａｎｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＰｏｐｌａｒｓ．Ｔｈｉｓｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗｉｔｈｈｉｇｈｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
ｗｈｉｃｈｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙｔｈｅａｕｔｈｏｒｓｗａｓａｓｇｏｏｄａｓｔｈａｔｏｆｓｐｅｃｉｅｓｏｆＬｅｕｃｅｓｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄｉｔｐｒｏｖｉｄｅｓａｇｏｏｄｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｃａｌｐｌａｔｆｏｒｍｆｏｒｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆｆｏｒｅｓｔｔｒｅｅｗｈｉｃｈｕｓｅｓｔｈｅｓｐｅｃｉｅｓｏｆＡｉｇｅｉｒｏｓｓｅｃｔｉｏｎａｓｍｏｄｅｌｍａｔｅｒｉａｌｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｏｐｕｌｕｓ×ｅｕｒａｍｅｒｉｃａｎａｃｌ．‘Ｂｏｆｅｎｇ１’；ｈｉｇｈｆｒｅｑｕｅｎｃｙｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ；ｃｏｐｐｅｒ
林 业 科 学 研 究 第２５卷
转基因技术已经成为对林木进行遗传改良的重
要手段，而稳定高效的组培再生体系是这一手段的
基本前提。杨树作为林木中的模式物种，其组织培
养的有关研究很早就有报道，１９７１年Ｗｉｎｔｏｎ等［１］用
欧洲山杨的芽培养获得了杨树的组培苗。目前，已
经有几十种杨树通过组织培养成功获得了再生植
株［２－７］，但其中多为白杨派树种。黑杨派树种的组
培再生相对白杨派则较为困难，虽然国内外许多学
者在黑杨组培再生体系建立方面做了许多努力，但
由于种内变异较大，其再生体系仍不如白杨派树
种［８－１２］。因此，目前林木基因工程（基因克隆、重
组、功能解析、转化等）也多以白杨派树种———银腺
杨（８４Ｋ）（Ｐｏｐｕｌｕｓａｌｂａ×Ｐ．ｇｌａｎｄｕｌｏｓａ）、山新杨
（Ｐｏｐｕｌｕｓｄａｖｉｄｉａｎａ×Ｐ．ｂｏｌｅａｎａ）、毛白杨（Ｐｏｐｕｌｕｓ
ｔｏｍｅｎｔｏｓａＣａｒ．）等为操控模式材料［１３－１４］。世界上
栽培的杨树有９０％都属于黑杨派，其中，美洲黑杨
与欧洲黑杨的杂种欧美杨无性系在欧洲、美洲、大洋
洲以及亚洲广为种植，众多的欧美杨优良新品种在
世界各国的木材生产和环境改善中产生着极大的经
济和生态效益。在我国，杨树人工林总面积已达
７５７．２３万ｈｍ２，居世界第１位，其中，黑杨派杨树人
工林占９０％。与其他杨树树种相比，黑杨派树种具
有早期速生、材质好、病虫害少的特点，约１０年左右
就可以产出大径材，这是其他杨树树种所不能实现
的。生产实践已证明：美洲黑杨和各种生态适应型
的欧美杨是我国各地杨树商业化品种的主体［１５－１６］。
随着全球气候变化加剧和我国社会、经济发展加快，
对速生更强、材质更好、病虫害更少以及适合在干
旱、盐碱等立地条件下生长的欧美杨新品种的需求
也日益增加。通过转基因技术可快速、定向对欧美
杨进行遗传改良，在短期内培育出适应气候变化、满
足发展需求的欧美杨新品种。这对稳定并扩大杨树
人工林面积，提高我国森林覆盖率，改善生态环境等
至关重要；但欧美杨组培再生过程中存在较多的平
均分化芽数少、组培苗继代困难等问题，严重制约了
转基因技术在欧美杨遗传改良中的应用，其组培再
生体系亟待突破。
本研究以典型的欧美杨渤丰 １号（Ｐｏｐｕｌｕｓ×
ｅｕｒａｍｅｒｉｃａｎａｃｌ．‘Ｂｏｆｅｎｇ１’）为材料，通过对植物生
长调节剂配比、离子浓度、光照条件等的研究，建立
与白杨派树种相当的高效再生体系，创立以高生产
力黑杨派树种为材料的林木基因工程操控新模式；
同时，为创制更优良的适应气候变化的新型欧美杨
转基因新品种奠定基础，使我国杨树人工林可持续
发展具有强有力的技术保障。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
渤丰１号杨属聚合型杂种欧美杨，母本为美洲
黑杨种内聚合杂种 ６５号杨（Ｐｏｐｕｌｕｓｄｅｌｔｏｉｄｅｓｃｌ．
‘５５／６５’×Ｐ．ｄｅｌｔｏｉｄｅｓｃｌ．‘２ＫＥＮ８’），父本为欧洲
黑杨种内聚合杂种（Ｐ．ｎｉｇｒａ‘Ｂｒｕｍｍｅｎ’×Ｐ．ｎｉｇｒａ
‘Ｐｉｃｃａｒｏｌｏ’）。它由中国林业科学研究院林业研究
所培育，并已获得国家林业局新品种授权及良种审
定。２００９年２月在中国林业科学研究院科研温室
进行渤丰１号杨扦插繁殖。
１．２ 试验方法
１．２．１ 最适分化培养基的选择 取生长健壮的扦
插苗自上而下第３、４个叶片（含叶柄），用１０％的次
氯酸钠溶液灭菌，将灭菌后的叶片切成长宽各约１
ｃｍ的正方形小片，正面朝下平铺于培养基上，叶柄
切成长约１ｃｍ左右的小段，每小段横切４ ６个伤
口置于培养基上。培养基为附加不同浓度的６ＢＡ
（０．８、０．４、０．２ｍｇ·Ｌ－１）和 ＮＡＡ（０．０８、０．０４、０．０２
ｍｇ·Ｌ－１）的ＭＳ培养基（灭菌前ｐＨ值为５．８），每个
组合重复处理３次，每一重复接种１０个外植体。每
７ｄ观察１次，培养２８ｄ后统计外植体的分化情况。
１．２．２ 最适生根培养基的选择 选取生长健壮且
长度大于０．５ｃｍ的不定芽，在不同浓度 ＩＢＡ（０．１、
０．０５、０．０２ｍｇ·Ｌ－１）和 ＮＡＡ（０．０４、０．０２、０．００
ｍｇ·Ｌ－１）组合的１／２ＭＳ培养基上（灭菌前ｐＨ值为
５．８）进行生根培养。每处理 １０个不定芽，３次重
复。每７ｄ观察１次，培养２８ｄ后统计不定芽的生
根情况。
１．２．３ 最适光照强度的确定 选取生长健壮、高度
基本一致的不定芽置于不加卡那霉素的最适生根培
养基中，于１５００、２３００、３１００ｌｘ的不同光照条件下
培养，光周期１６ｈ／８ｈ，培养２８ｄ后统计生根和生长
情况。
１．２．４ 铜元素对外植体分化的影响 将外植体接
种在含不同浓度（０．００００、０．００３２、０．００６４、
０．０１２８、０．０２５６ｍｇ·Ｌ－１）铜元素的最适分化培养
基中，２３００ｌｘ，光周期１６ｈ／８ｈ，培养２８ｄ后统计不
定芽的分化情况。
１．２．５ 最适卡那霉素选择压确定 将叶片接种在
含不同浓度（０、１０、２０、３０、４０、５０ｍｇ·Ｌ－１）卡那霉
８５１
第２期 崔旭东等：欧美杨渤丰１号高效组培再生体系建立
素（Ｋａｎ）的最适分化培养基中，每７ｄ换１次培养
基（防止卡那霉素失效），２８ｄ后统计不定芽的分化
情况，确定抑制叶片不定芽分化的Ｋａｎ选择压。
将长度、粗细等基本一致的不定芽接种在附加
不同浓度（０、１０、２０、３０、４０ｍｇ·Ｌ－１）卡那霉素的最
适生根培养基中，每７ｄ换１次培养基，２８ｄ后统计
不定芽的生根情况，确定抑制不定芽生根的 Ｋａｎ选
择压。
１．２．６ 再生苗的移植 当组培苗根系达１ ３ｃｍ
时，在自然条件下封口炼苗１ ３ｄ，之后将苗小心
取出，然后用清水洗去根部培养基，再将其移植到经
过高压灭菌的草炭土∶珍珠岩为３∶１的基质中，浇透
水，架好塑料棚保湿。７ｄ后，揭去塑料薄膜进行
培养。
１．３ 数据统计
外植体接种２８ｄ后，调查分化或生根情况，各
项评价指标如下：
分化率 ＝外植体个数／接种外植体的总数
×１００％
平均分化芽数 ＝产生的不定芽总数／产生不定
芽的外植体个数
生根率＝生根的外植体个数／接种外植体的总
数×１００％
数据用 Ｅｘｃｅｌ整理，分化率和生根率进行数据
转化后，用ＳＰＳＳ１３．０进行方差分析。
２ 结果与分析
２．１ 最适分化培养基的选择
将经过表面灭菌的渤丰１号杨叶片和叶柄接种
于表１所示的各处理中。７ｄ后，大部分叶片的伤口
处卷曲、突起或陷入培养基中，伤口上布满绿色愈伤
组织，部分叶片直接出现芽点，而叶柄则出现伤口处
膨大，产生淡绿色愈伤组织的现象；１４ｄ后，部分叶
片的愈伤组织分化产生芽点，直接出现的芽点则伸
长到０．２ ０．５ｃｍ，叶柄部分处理的愈伤组织同样
也分化出芽点；接种 ２１ｄ，芽点伸长至 ０．２ １．１
ｃｍ，叶柄的伸长到０．１ ０．５ｃｍ；接种２８ｄ，不定芽
长度可达０．５ １．７ｃｍ，叶柄的长约０．５ １．５ｃｍ，
而未分化产生芽点的部分愈伤组织由致密、绿色变
成蓬松、淡黄色，还有一部分则变为淡红色。统计各
处理分化率和平均分化芽数，结果见表１。
表１ 渤丰１号杨外植体在不同分化培养基上不定芽的诱导及分化情况
处理编号
植物生长调节剂浓度和比例
６ＢＡ／（ｍｇ·Ｌ－１） ＮＡＡ／（ｍｇ·Ｌ－１） ６ＢＡ∶ＮＡＡ
外植体／个
分化率／％
叶片 叶柄
平均分化芽／个
叶片 叶柄
１ ０．８ ０．０８ １０∶１ ３０ ８５ｂ ８９ｃ １２ｃ １４ｂ
２ ０．８ ０．０４ ２０∶１ ３０ ７０ｃ ７７ｄ １０ｃｄ １１ｃｅ
３ ０．８ ０．０２ ４０∶１ ３０ ３０ｅ ４０ｆ ８ｄｅ １０ｃｄ
４ ０．４ ０．０８ ５∶１ ３０ ７５ｃ ８０ｄ １１ｃｄｅ １２ｂｄｅ
５ ０．４ ０．０４ １０∶１ ３０ １００ａ １００ａ ２１ａ １８ａ
６ ０．４ ０．０２ ２０∶１ ３０ ７１ｃ ７９ｄ １０ｃｄ １０ｃｅ
７ ０．２ ０．０８ ２．５∶１ ３０ ４０ｄ ５０ｅ ８ｄｅ １２ｂｃ
８ ０．２ ０．０４ ５∶１ ３０ ８３ｂ ８３ｄ ９ｃｄ １０ｃｅ
９ ０．２ ０．０２ １０∶１ ３０ ８９ｂ ９２ｂ １６ｂ １３ｂｃ
注：表中叶片和叶柄分别单独进行比较，数字后不同字母表示０．０５水平差异显著（Ｐ＜０．０５）。
接种２８ｄ后，渤丰１号杨叶片在６ＢＡ０．４ｍｇ·
Ｌ－１＋ＮＡＡ０．０４ｍｇ·Ｌ－１组合的不定芽分化率和平
均分化芽数均表现为最高，分别为 １００％和 ２１个
（图１、２），显著高于其他组合，叶柄的情况与叶片相
同。因此，渤丰１号杨叶片外植体最佳不定芽诱导
培养基为：ＭＳ＋６ＢＡ０．４ｍｇ·Ｌ－１＋ＮＡＡ０．０４ｍｇ
·Ｌ－１。试验结果表明：外植体类型不同不定芽分化
的情况也不同，渤丰１号杨叶柄的诱导及分化比叶
片容易，但平均分化芽数比叶片的低。
２．２ 最适生根培养基的选择
将生长健壮的渤丰１号杨不定芽接种到表２所
设计的各种 １／２ＭＳ培养基中，结果表明：在处理 ５
中，不定芽的生根率最高，达到１００％，根短且粗壮、
分支较多、基本没有愈伤组织产生（图３），由表２还
可看出：单独使用ＩＢＡ基本可以避免愈伤组织的产
生，但生成的根既细又长，且数量较少，基本没有次
级根产生。为了保证移植的成活率，需加入适量的
ＮＡＡ，以促进根的增粗和次级根的发生，试验结果表
明：ＩＢＡ与ＮＡＡ的比例在２．５∶１．０，且其含量分别为
ＩＢＡ０．０５ｍｇ·Ｌ－１、ＮＡＡ０．０２ｍｇ·Ｌ－１时，渤丰１号
杨不定芽的生根效果最好。
９５１
林 业 科 学 研 究 第２５卷
图１ 叶片不定芽分化（将培养皿倒过来所拍的照片）
图２ 叶片不定芽的伸长
２．３ 光照强度对渤丰１号杨组培苗生长的影响
将３０个渤丰１号杨的不定芽接种在添加０．０５
图３ 不定芽生根情况
ｍｇ·Ｌ－１ＩＢＡ和０．０２ｍｇ·Ｌ－１ＮＡＡ的１／２ＭＳ培养
基中，分别置于不同光强的培养箱中，光周期１６ｈ／
８ｈ，培养３０ｄ，结果见表３。较弱的光强有利于渤丰
１号杨幼苗的长高，但植株较为纤细，且叶片较小
（图４ａ）；在光强为３１００ｌｘ时，幼苗最矮，叶片较
大，但底部叶片易衰老发黄（图４ｂ）；只有在光强为
２３００ｌｘ时，幼苗最健壮，茎秆较粗，叶片较为伸展，
且底部基本无发黄叶片（图４ｃ）。在不同光强下渤
丰１号杨的不定芽均能生根，但在１５００ｌｘ光强下，
幼苗根纤细且长，次级根少；在３１００ｌｘ光强下，根
粗短且少；而在２３００ｌｘ光强下，根粗壮，且次级根
多。因此，可见光强为２３００ｌｘ较为适合渤丰１号杨
组培苗的生长发育。
表２ 渤丰１号杨不定芽在不同生根培养基上的生根情况
处理编号
植物生长调节剂浓度和比例
ＩＢＡ／（ｍｇ·Ｌ－１） ＮＡＡ／（ｍｇ·Ｌ－１） ＩＢＡ∶ＮＡＡ
不定芽／个 生根率／％ 根系生长状况
１ ０．１０ ０．０４ ２．５∶１ ３０ ９０ｂ 根粗且多，愈伤组织多
２ ０．１０ ０．０２ ５∶１ ３０ ８５ｂｃ 根粗，愈伤组织少
３ ０．１０ ０．００ — ３０ ５４ｅ 根较细，无愈伤组织
４ ０．０５ ０．０４ １．２５∶１ ３０ ７８ｄｃ 根粗，较多，愈伤组织多
５ ０．０５ ０．０２ ２．５∶１ ３０ １００ａ 根粗，次级根多，基本无愈伤组织
６ ０．０５ ０．００ — ３０ ７５ｄ 根细长，较少，无愈伤组织
７ ０．０２ ０．０４ ０．５∶１ ３０ ５５ｅ 根细长，愈伤组织多
８ ０．０２ ０．０２ １∶１ ３０ ７０ｄ 根细长，愈伤组织少
９ ０．０２ ０．００ — ３０ ５０ｅ 根细而少，无愈伤组织
注：表中数字后不同的字母表示０．０５水平差异显著（Ｐ＜０．０５）。
表３ 不同光照强度对渤丰１号杨组培苗生长的影响
处理编号 光照强度／ｌｘ 不定芽／个 １０ｄ后平均株高／ｃｍ ２０ｄ后平均株高／ｃｍ ３０ｄ后平均株高／ｃｍ 生根率／％
１ １５００ ３０ ２．５ａ ４．８ａ ７．４ａ １００ａ
２ ２３００ ３０ ２．５ａ ４．４ａ ６．５ａ １００ａ
３ ３１００ ３０ １．７ｂ ３．４ｂ ５．１ｂ １００ａ
注：数字后不同的字母表示０．０５水平差异显著（Ｐ＜０．０５）。
０６１
第２期 崔旭东等：欧美杨渤丰１号高效组培再生体系建立
图４ 不同光强对组培苗生长的影响
２．４ 不同浓度铜元素对渤丰１号杨外植体分化的
影响
将经表面灭菌的渤丰１号杨叶片接种于含不同
浓度铜元素且添加了０．４ｍｇ·Ｌ－１６ＢＡ和０．０４ｍｇ
·Ｌ－１ＮＡＡ的 ＭＳ培养基上，培养２８ｄ后的结果见
表４。表４表明：增加铜元素的浓度能有效地提高叶
片的分化率，在铜元素浓度为０．０１２８ｍｇ·Ｌ－１时，
渤丰１号杨叶片的不定芽分化率达１００％，平均分化
芽数１８个，是提高浓度前的２．６倍；但当铜元素浓
度增加到一定水平，就会对不定芽的分化起抑制作
用。可见，铜元素浓度在０．０１２８ｍｇ·Ｌ－１左右能明
显促进渤丰１号杨不定芽的分化。
表４ 不同浓度铜元素对渤丰１号杨外植体分化的影响
处理
编号
铜元素浓度
／（ｍｇ·Ｌ－１）
叶片数
／个
分化率
／％
平均分
化芽／个
１ ０．００００ ３０ １０ｄ １ｄ
２ ０．００２３ ３０ ３０ｃ ４ｃ
３ ０．００６４ ３０ ７６ｂ ７ｂ
４ ０．０１２８ ３０ １００ａ １８ａ
５ ０．０２５６ ３０ ９５ａ １６ａ
注：数字后不同字母表示０．０５水平差异显著（Ｐ＜０．０５）。
２．５ 最适卡那霉素选择压筛选
配制含有不同浓度卡那霉素（Ｋａｎ）的最适分
化培养基和生根培养基，分别接种３０个渤丰１号杨
的叶片外植体和生长健壮的不定芽，培养２８ｄ后对
结果进行统计。表５表明：４０ｍｇ·Ｌ－１卡那霉素抑
制渤丰１号杨叶片的诱导与分化，２０ｍｇ·Ｌ－１卡那
霉素抑制渤丰１号杨不定芽的生根。
２．６ 渤丰１号杨组培苗的温室移植
选取根系发达，生长健壮的无菌苗，用镊子将培
养基捣碎，小心将苗取出，用自来水冲掉根上残留的
培养基，再移植到装有营养基质的小盆中，最后，将
其放入事先搭好的塑料棚内，保持温度２５℃、湿度
９０％左右，定期浇水。７ １０ｄ后，揭去塑料薄膜，
正常管理，成活率可达９８％左右。
表５ 不同浓度卡那霉素（Ｋａｎ）对渤丰１号杨叶片分化率及
不定芽生根率的影响
处理
编号
Ｋａｎ浓度
／（ｍｇ·Ｌ－１）
外植体
／个
分化率
／％
生根率
／％
１ ０ ３０ １００ １００
２ １０ ３０ ７６ ２３
３ ２０ ３０ ５２ ９
４ ３０ ３０ ３６ ０
５ ４０ ３０ ７ ０
６ ５０ ３０ ０ ０
３ 结论与讨论
３．１ 以黑杨派树种为材料的高效再生体系建立
能否成为林木基因工程研究的模式材料关键在
于所选材料是否拥有高效的组培再生体系。渤丰１
号杨再生体系的建立，实现了欧美杨外植体的高效
再生，渤丰１号杨叶片的平均分化芽数可达２１个，
组培苗可顺利继代培养，是目前黑杨派树种中最佳
体系之一；而 Ｃｏｌｅｍａｎ等［３］、陈正华［１７］、王斌等［１８］、
王红蕾［１９］报道的白杨派叶片的平均分化芽数仅５
１２个。这为研究者以生产实践中占主体地位的黑
杨派树种为材料进行基因克隆、转化以及基因在林
木中的功能解析和应用等提供了前提，越来越多的
林木基因工程研究将会选择以黑杨派树种为模式材
料，这将为通过转基因技术培育出适应性和商品化
更强的杨树新品种奠定坚实的基础。
１６１
林 业 科 学 研 究 第２５卷
３．２ 铜元素可促进杨树不定芽的诱导与分化
铜元素是植物正常生长发育必需的微量元素，
作为许多酶的主要成分或辅助因子，其在植物的生
长过程中是必不可少的。许多研究表明：ＭＳ基本培
养基中微量元素的含量对植物组织培养有明显影
响，不同植物或品种对微量元素配比的要求有较大
差异。Ｐｕｒｎｈａｕｓｅｒ［２０］通过对小麦再生体系的研究发
现，培养基中铜元素含量为０．６４ｍｇ·Ｌ－１时，比原
始ＭＳ培养基（铜元素含量０．００６４ｍｇ·Ｌ－１）的植
株再生率提高了８倍。杨跃生等［２１］通过在分化培
养基上添加各种微量元素的试验发现，只有铜元素
具有明显的促进水稻愈伤组织植株再生的作用。还
有研究表明：铜元素对大麦的胚性愈伤再生率以及
巴西橡胶树组培切苗的生根等都有促进作用［２２－２５］。
本研究证明：比原始 ＭＳ培养基铜元素含量高１倍
的浓度（０．０１２８ｍｇ·Ｌ－１）能有效促进杨树不定芽
的诱导和分化，平均分化芽数提高了２．６倍，这在国
内外还未见有类似报道。推测铜元素可能作为保持
各种酶活性的有效物质与培养基中植物生长调节
剂、营养元素相互作用，并与外植体内源植物生长调
节剂相互影响，进而激发杨树外植体细胞或愈伤组
织中与再生能力有关基因的表达，最终促进不定芽
的诱导与分化；但是，还需进一步的试验以确定铜元
素对杨树外植体分化的影响程度和具体机制，以便
更好地利用铜元素来促进杨树组织培养获得更多的
突破，为后续的杨树基因工程研究提供基本条件。
参考文献：
［１］ＷｉｎｔｏｎＬ．ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＰｒｏｐａｇａｔｉｏｎｏｆＥｕｒｏｐｅａｎＡｓｐｅｎ［Ｊ］．Ｆｏｒ
ｅｓｔＳｃｉｅｎｃｅ，１９７１，１７（３）：３４８－３５０
［２］ＡｈｕｊａＭＲ．Ｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄｒａｐｉｄｃｌｏｎａｌｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ
ｏｆａｓｐｅｎ［Ｊ］．ＳｉｌｖａｅＧｅｎｅｔ，１９８３，３２（３－４）：１３１－１３５
［３］ＣｏｌｅｍａｎＧＤ，ＥｒｎｓｔＳＧ．ＩｎｖｉｔｒｏｓｈｏｏｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＰｏｐｕｌｕｓｄｅｌ
ｔｏｉｄｅｓ：ｅｆｅｃｔｏｆｃｙｔｏｋｉｎｉｎａｎｄｇｅｎｏｔｙｐｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌＰｅｐ，１９８９，
８（８）：４５９－４６２
［４］ＶｉｎｏｃｕｒＢ，ＣａｒｍｉＴ，ＡｌｔｍａｎＡ，ｅｔａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄｂｕｄｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｉｎａｓｐｅｎ（ＰｏｐｕｌｕｓｔｒｅｍｕｌａＬ．）ｒｏｏｔｓｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｌｉｑｕｉｄｍｅｄｉａ［Ｊ］．
ＰｌａｎｔＣｅｌＲｅｐ，２０００，１９（１２）：１１４６－１１５４
［５］ＷａｎｇＨＭ，ＬｉｕＨＭ，ＷａｎｇＷＪ，ｅｔａｌ．ＥｆｅｃｔｓｏｆＴｈｉｄｉａｚｕｒｏｎ，ｂａｓ
ａｌｍｅｄｉｕｍａｎｄｌｉｇｈｔｑｕａｌｉｔｙｏｎａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓｓｈｏｏｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｆｒｏｍｉｎ
ｖｉｔｒｏｃｕｌｔｕｒｅｄｓｔｅｍｏｆＰｏｐｕｌｕｓａｌｂａ×Ｐ．ｂｅｒｏｌｉｎｅｎｓｉｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ
ＦｏｒｅｓｔｒｙＲｅｓｅａｒｃｈ，２００８，１９（３）：２５７－２５９
［６］ＢｏｓｅｌａＭＪ．Ｅｆｅｃｔｓｏｆβｌａｃｔａｍａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，ａｕｘｉｎｓ，ａｎｄｃｙｔｏｋｉｎｉｎｓｏｎ
ｓｈｏｏｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｆｒｏｍｃａｌｕｓｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆｔｗｏｈｙｂｒｉｄａｓｐｅｎｓ，Ｐｏｐｕｌｕｓ
ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ×Ｐ．ｔｒｅｍｕｌａａｎｄＰ．ｘｃａｎｅｓｃｅｎｓ×Ｐ．ｇｒａｄｉｄｅｎｔａｔａ［Ｊ］．
Ｐｌａｎｔｃｅｌ，ｔｉｓｓｕｅａｎｄｏｒｇａｎｃｕｌｔｕｒｅ，２００９，９８（３）：２４９－２６１
［７］ＹｅｖｔｕｓｈｅｎｋｏＤＰ，ＭｉｓｒａＳ．ＥｆｉｃｉｅｎｔＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒ
ｍａｔｉｏｎｏｆｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｈｙｂｒｉｄｐｏｐｌａｒＰｏｐｕｌｕｓｎｉｇｒａＬ．×Ｐ．ｍａｘｉｍｏｗ
ｉｃｚｉＡ．Ｈｅｎｒｙ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌＲｅｐ，２０１０，２９（３）：２１１
!
２２１
［８］陈彩霞，沈 昕，王宁，等．派间杂种１１０杨再生系统的建立
［Ｊ］．林业科学研究，２００７，２０（２）：２８７－２９１
［９］张 蕾，苏晓华，张冰玉，等．京２杨组培条件的优化及再生体系
建立［Ｊ］．林业科学研究，２００７，２０（６）：７８７－７９３
［１０］ＧａｒｙＤＣ，ＳｔｅｐｈｅｎＧＥ．ＩｎｖｉｔｒｏｓｈｏｏｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＰｏｐｕｌｕｓｄｅｌ
ｔｏｉｄｅｓ：ｅｆｅｃｔｏｆｃｙｔｏｋｉｎｉｎａｎｄｇｅｎｏｔｙｐｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌＲｅｐ，１９８９，
８（８）：４５９
!
４６２
［１１］ＣｈａｔｕｒｖｅｄｉＨＣ，ＳｈａｒｍａＡＫ，ＡｇｈａＢＱ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ
ｃｌｏｎｅｄｔｒｅｅｓｏｆＰｏｐｕｌｕｓｄｅｌｔｏｉｄｅｓｔｈｒｏｕｇｈｉｎｖｉｔｒｏｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆ
ｓｈｏｏｔｓｆｒｏｍｌｅａｆ，ｓｔｅｍａｎｄｒｏｏｔｅｘｐｌａｎｔｓａｎｄｔｈｅｉｒｆｉｅｌｄｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ
［Ｊ］．ＩｎｄｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，３（２）：２０３－２０８
［１２］ＭｉｎｇｏｚｚｉＭ，ＭｏｎｔｅｌｏＰ，ＭｅｒｋｌｅＳ．Ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓｓｈｏｏｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｆｒｏｍｌｅａｆｅｘｐｌａｎｔｓｏｆｅａｓｔｅｒｎｃｏｔｏｎｗｏｏｄ（Ｐｏｐｕｌｕｓｄｅｌｔｏｉｄｅｓ）ｃｕｌ
ｔｕｒｅｄｕｎｄｅｒｐｈｏｔｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＴｒｅｅＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，
２００９，２９（３）：３３３－３４３
［１３］苏晓华，张冰玉，黄秦军，等．我国林木基因工程研究进展及关
键领域［Ｊ］．林业科学，２００３，３９（５）：１１１－１１８
［１４］苏晓华，张冰玉，黄秦军，等．杨树基因工程育种［Ｍ］．北京：科
学出版社，２００９
［１５］马常耕．我国杨树育种中的若干问题商榷［Ｊ］．青海农林科技，
２００４（Ｂ０３）：１－８
［１６］苏晓华，丁昌俊，马常耕．我国杨树育种的研究进展及对策
［Ｊ］．林业科学研究，２０１０，２３（１）：３１－３７
［１７］陈正华．木本植物组织培养及其应用［Ｍ］．北京：高等教育出
版社，１９８６
［１８］王 斌，李百炼，张金凤，等．杂种白杨离体再生体系的建立
［Ｊ］．西北植物学报，２００９，２９（４）：７０４－７１０
［１９］王红蕾．山新杨高效组培再生体系的建立［Ｊ］．北方园艺，２０１０
（１３）：１７４－１７５
［２０］ＰｕｒｎｈａｕｓｅｒＬ．Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｓｈｏｏｔａｎｄｒｏｏｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｉｎｗｈｅａｔ，
Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍｃａｌｕｓｃｕｌｔｕｒｅｓｂｙｃｏｐｐｅｒ［Ｊ］．ＣｅｒｅａｌＲｅｓ．Ｃｏｍ
ｍｕｎ，１９９１，１９：４１９－４２３
［２１］杨跃生，筒玉瑜，郑 迎．铜在水稻愈伤组织培养再生植株中
的促进作用［Ｊ］．中国水稻科学，１９９９，１３（２）：９５－９８
［２２］李会勇，尹 钧，刘 雷．Ｃｕ２＋浓度对啤酒大麦幼胚组织培养
与植株再生的影响［Ｊ］．麦类作物学报，２００３，２３（２）：２７－２９
［２３］王树昌，于晓玲，赵平娟．Ｃｕ离子对巴西橡胶树组织培养的影
响［Ｊ］．热带农业工程，２０１０，３４（６）：２８－３０
［２４］ＰｕｒｎｈａｕｓｅｒＬ，Ｇｙｕｌａｉ．Ｅｆｅｃｔｏｆｃｏｐｐｅｒｏｎｓｈｏｏｔａｎｄｒｏｏｔｒｅｇｅｎｅｒａ
ｔｉｏｎｉｎｗｈｅａｔ，ｔｒｉｔｉｃａｌｅ，ｒａｐｅａｎｄｔｏｂａｃｃｏｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌ，ＴｉｓｓｕｅａｎｄＯｒｇａｎＣｕｌｔｕｒｅ，１９９３，３５：１３１－１３９
［２５］ＪａｉｎＰ，ＫａｃｈｈｗａｈａＳ，ＫｏｔｈａｒｉＳＬ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄｍｉｃｒｏｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ
ｐｒｏｔｏｃｏｌａｎｄｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｉｎｂｉｏｍａｓｓａｎｄｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｃｏｎｔｅｎｔｉｎ
Ｓｔｅｖｉａｒｅｂａｕｄｉａｎａ（Ｂｅｒｔ．）Ｂｅｒｔｏｎｉｂｙｕｓｉｎｇｈｉｇｈｃｏｐｐｅｒｌｅｖｅｌｓｉｎ
ｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ［Ｊ］．ＳｃｉｅｎｔｉａＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ，２００９，１１９（３）：
３１５－３１９
２６１