全 文 ：收稿日期: 20020912
基金项目: 十五国家攻关项目 西南桦良种选育与高效栽培研究 ( 2002BA515B0204)
作者简介: 刘英 ( 1963 ) ,女,海南临高人,工程师.
通讯作者:曾杰,传真: 02087031622,电话: 87030271, Email: zengj69@ pub. guangzhou. gd. cn.
* 芬兰林业研究所的 Annel i ViheraAarnio 为本研究提供了许多文献资料,特致谢忱!
林业科学研究 ! 2003, 16( 6) : 715~ 719 !
Forest Research
! ! 文章编号: 10011498( 2003) 06071505
西南桦以芽繁芽组培快繁研究*
刘 ! 英1 , 曾炳山1 , 裘珍飞1 , 谌红辉2 , 曾 ! 杰1
( 1中国林业科学研究院热带林业研究所,广东 广州 ! 510520;
2中国林业科学研究院热带林业实验中心,广西 凭祥 ! 532600)
摘要: 以 8个月生苗木上采集的枝条作为外植体,通过激素、大量元素配比等试验,成功地研发出一套
西南桦以芽繁芽组培快繁技术体系。其主要内容包括: 1 选择邻近顶芽带腋芽的茎段作为外植体,
用 HgCl2 消毒 3 min 效果最佳, 诱导成功率达 10% ; 2 其侧芽诱导与增殖培养宜选用低浓度 ( 0 2
mgL- 1) 的 IBA或 NAA; 3 大量元素配比满足 K∀Ca= 1∀004~ 008、K∀Mg= 1∀002~ 0 04、N∀P= 1∀
002~ 003 三个比例关系时, 外植体侧芽能正常萌发生长,并迅速进入增殖状态, 40 d 转接 1 次, 增殖
倍数在 4 倍以上; 4 选用 NAA浓度为 050 mgL- 1的 04MS 培养基进行生根诱导, 生根率达 979%。
关键词: 西南桦;以芽繁芽; 大量元素配比; 组织培养
中图分类号: S7223+ 7! ! ! 文献标识码: A
西南桦( Betula alnoides BuchHamex DDon) 是我国热带及南亚热带地区的速生珍贵用材
树种[ 1, 2] ,天然分布于印度半岛北部、缅甸、印支半岛各国以及我国南部和西南部, 其树干通
直、材质优良、用途广泛, 具有很高的经济价值。近几年来, 西南桦在华南、西南地区推广迅速,
人工造林面积已达数万公顷, 已成为我国热带、南亚热带地区的主要造林树种之一。西南桦的
驯化、栽培研究始于 20世纪 80年代。然而其良种选育从九五才开始,中国林业科学研究院
热带林业研究所相继开展了包含全分布区 14个种源的种源筛选试验和 25个种源约 460个家
系的种源家系联合筛选试验。由于西南桦结实龄需 15 a以上, 因此在进行群体选优的同时,
通过早期测定或直接从天然林中选择优良无性系,运用组培快繁技术生产优良无性系苗木造
林是推广良种、发展高产优质人工林的快捷而有效的途径之一。
国外对桦木属( Betula L. )植物的组培研究较多, 对垂枝桦( Bpendula Roth. )及其变种、变
型的研究尤为广泛[ 3~ 5] ,而且成熟的组培技术已应用到其良种繁育研究中[ 6, 7]。我国开展了白
桦( Bplatyphylla Suks) 的组培研究,并获得成功[ 8, 9] 。国内也有学者开展过西南桦的组培研
究,但尚停留在愈伤组织和胚状体形成的阶段 [ 10]。本研究通过筛选激素、调整培养基大量元
素配比,旨在突破侧芽诱导等关键技术环节, 成功解决西南桦以芽繁芽组培快繁技术, 为西南
桦的良种繁育研究与良种快速推广服务。
1 ! 试验材料与方法
11 ! 试验材料及培养条件
外植体采自热带林业研究所苗圃 8 个月
生超级苗,苗高约50 cm。按枝条的幼嫩程度,
从顶芽向下按 10~ 15 cm 长度剪取 4段,分
段用 01% HgCl2 进行消毒, 消毒方案见表 1。
每个消毒处理至少75瓶以上。培养温度为25
# 2 ∃ ,每日光照10 h, 强度为 2 000 lx。培养
20 d后调查消毒效果。
表 1! 西南桦外植体与消毒时间对消毒成功率的影响
外植体
(区段号)
消毒时间
min
污染率
%
无菌外植体
死亡率% 萌动率%
% 3 870 113 17
% 5 800 200
& 3 880 20 100
& 5 830 150 20
∋ 5 945 55
∋ 7 907 93
( 7 950 50
( 9 900 100
! ! 注:培养 20 d后的观察结果。
12 ! 试验设计
121 ! 侧芽诱导试验 ! 激素试验设置 6个处理,在 34 MS ( Murashige & Skoog, 1962;大量元素
含量为MS的 34)培养基中分别加入 6苄基腺嘌呤( 6BA) 2个水平( 10、20 mg)L- 1 ) 与02 mg
)L- 1的 2, 4二氯苯氧乙酸( 2, 4D)、萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸( IBA)的组合,以不加入激素为对
照(表 2)。大量元素配比试验以MS( K∀Ca= 1∀015、K∀Mg= 1∀008; 均为摩尔比, 下同) 为对
照,保持试验培养基 12MS NH4NO3、1MS KH2PO4 以及 Ca∀Mg= 1∀2恒定,设置 K∀Ca= 1∀002、
004、006、008、010、012、014、016, K∀Mg= 1∀001、002、003、004、005、006、007、008
等8个处理筛选最佳大量元素配比。
激素和大量元素配比试验的每个处理重复 40瓶以上,根据腋芽萌发、生长以及叶色等指
标划分 5个等级, 评定各处理的好坏。5个等级的具体标准为: 1 萌发、蹲苗、生长不良; 2萌
发、生长、生长不良, 不能成苗; 3萌发、生长、长势弱、有黄叶,难成苗或质差; 4 萌发、生长弱、
叶绿,可少数成苗; 5 萌发、生长、长势旺, 90%以上成苗。
122 ! 生根诱导试验 ! 以 04MS培养基 (注: 大量元素为 MS培养基的 04倍,其余成分保持
不变) 作为生根诱导的基本培养基, 设置 IBA ( 10 mg)L- 1 )、NAA ( 050 mg)L- 1 )、NAA ( 025
mg)L- 1 )三个处理,以空白 (不加入任何激素) 为对照,采用单因素试验设计。剪取增殖培养
基中长度为15~ 20 cm 的芽苗进行生根诱导。根据生根率、基部愈伤率、生根条数以及生长
状况等指标评定各处理的生根效果,从而筛选出最佳的生根培养基配方。
13 ! 移植与管理
生根诱导成功后培养至根长2~ 5 cm 时即进行移植, 按照常规组培移植苗的培育方法进
行管理,调查其移植成活率。
2 ! 结果与分析
21 ! 外植体的选择与消毒
西南桦枝细毛多,客观上存在着需要长时间消毒而又不耐药杀的矛盾,消毒难度大。从表
1看出, 4种外植体的消毒污染率均超过80%。应用 HgCl2 将枝条 III、IV区段消毒5~ 9 min,无
菌外植体均被杀死。将枝条 I、II区段消毒 3~ 5 min,尽管污染率随着消毒时间的减少而增大,
但无菌外植体的死亡率降低, 诱导成功率升高。可见, 选择枝条 II 区段作为外植体, 应用
HgCl2 消毒3 min的效果最佳,诱导成功率高达 100%。
716 林 ! 业 ! 科 ! 学 ! 研 ! 究 第16卷
22 ! 激素对侧芽诱导的影响
从6BA与 2, 4D、IBA、NAA各种组合的侧芽诱导结果可知 (表 2) ,西南桦对生长素反应敏
感,在 6BA与 2, 4D组合的培养基上,外植体基部容易产生大量愈伤组织, 褐化严重,侧芽无法
抽高生长,很快死亡;而在 6BA分别与 NAA、IBA组合的培养基上,尽管外植体基部也产生愈伤
组织, 出现轻微褐化现象,但侧芽能萌发并抽高生长,因此, NAA、IBA可作为西南桦组培快繁
的适用生长素。
表 2! 激素对侧芽诱导的影响
培养
基号
大量
元素
6BA 2, 4D NAA IBA
mg)L- 1 外植体反应情况
1 34MS 10 02 产生大量愈伤组织、顶芽变黄、侧芽不抽高生长,很快死亡。
2 34MS 10 02 愈伤组织相对较少,顶芽抽高生长达 05 cm,能展叶。
3 34MS 10 02 基本同上。
4 34MS 20 02 产生大量愈伤组织、侧芽萌发白色,无法生长,很快死亡。
5 34MS 20 02 愈伤组织相对较少,顶芽抽高生长及展叶,侧芽萌发抽高生长达 05 cm。
6 34MS 20 02 基本同上
7 34MS 愈伤组织相对较少。侧芽萌发但不抽高生长。
图 1! K、Ca、Mg配比对侧芽诱导的影响
23 ! 大量元素配比对侧芽诱导的影响
以MS 培养基中大量元素含量为
对照, 在 保 持 试 验培 养 基 12MS
NH4NO3、1MS KH2PO4 以及 Ca∀Mg= 1∀2
恒定的前提下, 调整 K与 Ca以及 K与
Mg的比例(图 1)。当K∀Ca= 1∀004~
008、K∀Mg= 1∀002~ 004时, 侧芽均
能萌发并正常抽高生长成苗, 而当两种
比例超出上述区间时, 芽苗则生长不
良,出现蹲苗现象而无法进入正常的增
殖状态,甚至死亡。
在达到上述合理 K、Ca、Mg 比例时, N与 P 的比例恰好为 1∀004。此时尽管能够增殖,但
生长缓慢,增殖倍数仍低。在保证 K、Ca、Mg 合理配比的前提下, 进一步调整 N、P 的比例。结
果发现,N∀P= 1∀002~ 004时均能正常生长和增殖,以 N∀P= 1∀003 时效果最佳, N∀P= 1∀
002的效果亦远远优于N∀P= 1∀004。总而言之, 西南桦在 K∀Ca∀Mg= 1∀004~ 008∀002~
004, N∀P= 1∀002~ 003时,侧芽能够正常萌发,生长速度加快, 迅速进入增殖状态。初代 40
d转接 1次,继代 30 d转接 1次,增殖倍数达 4倍以上, 芽苗绿且粗壮, 无黄叶及无效苗产生。
若2个月转接,芽苗也未出现缺素现象,因此, 运用上述大量元素配比进行侧芽诱导,能够迅速
获得大量芽苗, 达到工厂化生产的要求。
24 ! 生根诱导
试验结果表明 (表 3、4) : 西南桦增殖苗极易生根, 无生长素的对照培养基生根率达
785% ;西南桦对生长素极其敏感,加入少量生长素, 不仅始根期提早5 d,出根整齐, 生根率
717第 6 期 刘英等:西南桦以芽繁芽组培快繁研究
高, 而且生根条数增多。当 NAA 达到
050 mg)L- 1时, 生根率显著高于对照,
生根条数和基部愈伤组织产生率极显著
地高于对照。可见, 应用 NAA浓度 050
mg)L- 1的 04 MS 培养基诱导西南桦生
根的效果较好。
25 ! 移植管理
生根诱导培养 2 个星期后, 生根高
峰期基本上已过, 大部分芽苗已生根。
此时应及时更换培养环境进行炼苗, 提
高芽苗木质化程度, 准备移植。具体做
表 3! 生根诱导观测值的方差分析
观测
指标
变异
来源 自由度
离差
平方和 均方 均方比 F 005 F 001
生根率
培养基 3 0052 9 0017 6 334 293 454
误差 29 0152 9 0005 3
总和 32 0205 8
生根数
培养基 3 2313 3 0771 1 845 293 454
误差 29 2645 0 0091 2
总和 32 4958 3
基部愈
伤组织
培养基 3 11211 6 3737 2 3218 293 454
误差 29 30367 7 0116 1
总和 32 14579 3
! ! 注:百分率数据经过对数变换后再进行方差分析。
法如下: 以一层 90%的遮阴网遮荫, 光
照强度约 5 000~ 9 000 lx 的条件下, 炼
苗15 d后即可进行移植。以砂土为介
质,移前用 11 000 的高锰酸钾溶液消
毒,移后注意保湿通风。按照常规组培
移植苗培育方法进行水肥管理和杂菌控
制, 1 个月后, 移植成活率高达 95%
以上。
表 4 ! 生根诱导观测值的 Duncan多重比较
培养基 生根率% 生根数条 基部愈伤组织%
% 919 ab 40 ab 964 a
& 979 a 60 a 1000 a
∋ 901 ab 44 ab 915 a
( 785 b 30 b 86 b
! ! 注:同列字母相同表示 005水平差异不显著, 不同表示差异
显著。
3 ! 结论与讨论
( 1)桦木属植物枝细毛多,其茎段外植体消毒成功率低。Jones et al [3] 在对垂枝桦进行组
培快繁时, 其茎段外植体消毒、诱导成功率仅为 22%。对于西南桦而言, 宜选择邻近顶芽带侧
芽的茎段作为外植体,用HgCl2 消毒 3 min能达到最佳消毒效果, 但诱导成功率亦仅 10%。
( 2)由于西南桦茎段对生长素敏感,少量的生长素即能使其产生大量的愈伤组织, 因此其
侧芽诱导与增殖培养宜选用低浓度( 02 mg)L- 1 ) 的 IBA或 NAA。
(3)合理的大量元素配比是成功快繁西南桦的技术关键。在广泛使用的 MS 或 34MS培
养基上,无法诱导侧芽正常生长与增殖。重新调整大量元素配比,使 K∀Ca= 1∀004~ 008、K∀
Mg= 1∀002~ 004、N∀P= 1∀002~ 003才得以突破这一难关,增殖倍数达到 4倍以上,获得大
量快繁芽苗。尽管西南桦的侧芽诱导与初代增殖对基本培养基的要求特别严格,然而进入多
代增殖培养后的芽苗, 重新回到 MS 等常规培养基中培养, 对各种基本培养基反应差异不明
显,均能旺盛生长。
(4)西南桦增殖苗容易生根, 选用 NAA浓度为 050 mg)L- 1的 04MS 培养基进行生根诱
导,生根率达 979%。在适宜的光照条件下炼苗, 提高芽苗木质化程度,移植后按照常规组培
苗管理方法进行管理,移植成活率高达 95%。
( 5)本研究成功地采用以芽繁芽途径进行西南桦组培快繁,避免了愈伤组织再生途径可能
导致的遗传不稳定性,更适于种苗工厂化快繁。
718 林 ! 业 ! 科 ! 学 ! 研 ! 究 第16卷
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In vitro Propagation of Betula alnoides by Shoot Proliferation
LIU Ying1 , ZENG Bingshan 1 , QIU Zhenf ei1 , CHEN Honghui2 , ZENG Jie1
( 1Research Inst itute of Tropical Forestry, CAF, Guangzhou ! 510520, Guangdong, China;
2Experimental Center of Tropical Forestry, CAF, Pingxiang ! 532600, Guangxi, China)
Abstract: Using branches collected from eightmonthold seedlings, a rapid propagation protocol by shoot prolif
eration was developed for Betula alnoides by adjusting the plant growth regulators and ratios of macroelements.
The main results were as follows: 1. Dipping in solution of 11 000 HgCl2 for 3 minutes was the best way for
disinfection of branch explants and up to 10% branches were successfully induced to grow shoot; 2. To prevent
branch explants from producing too much callus, only low concentration of auxins, for instance, 02 mg)L- 1
IBA or NAA, could be supplemented; 3. Ratio of macroelements was crucial for shoot germinat ion and prolifer
ation, the range of their rat ios by mol concentration were K∀Ca = 1∀004~ 008, K∀Mg= 1∀002~ 004, N
∀P= 1∀002~ 003; 404 MS supplemented with 05 mg)L1 NAA was suitable for rooting, the rooting rate
reached 97. 9% ; and 5. The survival rate of outplanting in nursery was up to 95% .
Key words: Betula alnoides; ratio of macroelements; shoot proliferation; tissue culture
719第 6 期 刘英等:西南桦以芽繁芽组培快繁研究