全 文 ：林业科学研究!"#$%!"&"$#$#&- #&*
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!!文章编号!$##$($)*+""#$%##$(##&-(#-
利用 ="$.Q-8基因序列进行害竹飞虱
"半翅目!飞虱科#的分子鉴定
侯晓晖$!"! 陈祥盛$ !
"$,贵州大学昆虫研究所_贵州山地农业病虫害重点实验室!贵州 贵阳!--##"-% ",遵义医学院!贵州 遵义!-&%##%#
收稿日期$ "#$"(#)($
基金项目$ 国家自然科学基金"%$$&#$&%#%贵州省国际科技合作项目"黔科合外8字""#$####-#
作者简介$ 侯晓晖"$*+#,#!女!副教授!主要从事飞虱科昆虫分子系统学研究 ](K3DP$ BWB$*+#$$""h$&%VAFKV
!
通讯作者V
摘要!采用b/<测序技术测定了中国飞虱科 - 属 $# 种 $- 个地理种群的线粒体 $&; @b/<基因长约 )+# SQ 片段的
序列!分析了其序列组成及变异特征 所获序列中!
传距离平均值"分别为 #,"#* 和 #,$%"#次之!而种内不同地理种群间的遗传距离平均值"#,#$%#最低 构建了 $#
种飞虱科昆虫的57和/c分子系统树!结果显示$各属飞虱基本上形成单系群%各种飞虱各自不同地理种群均聚为
一支!构成一单系群!可以很好的区分不同种类的飞虱 上述结果与形态学研究结果非常吻合
关键词!飞虱科%害竹飞虱%$&; @b/<%分子鉴定%小头飞虱属%梯顶飞虱属
中图分类号!;&% 文献标识码!<
S)2,1&27.K,*%/4/17%/)*)4Z7J9)) 527*%+)66,.:"U,J/6%,.7$ Q,26+71/7,#
Z7:,)*S/%)1+)*./72$&$.Q-8P,*,$,B&,*1,:
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?9@EA9>J SIQ3@?DKFCIK>9BFJ 3CJ C>D6BSF@(MFDCDC6K>9BFJ ?E66>?99B399B>DC6@FEQ 3CJ FE96@FEQ 3@>DCJ>Q>CJ>C9
>TFPE9DFC3@IS@3CAB>?VOB>6>CE?3CJ ?Q>AD>?GF@K>J KFCFQBIP>9DA6@FEQ?@>?Q>A9DT>PI! ?F3AAE@3AIDJ>C9DGDA39DFC D?
QF??DSP>9B@FE6B 9B>@>?>3@AB FG?>XE>CA>?VOB>?>@>?EP9?3@>DJ>C9DA3PRD9B 9B39FGKF@QBFPF6IV
;,( <).:$ b>PQB3ADJ3>% S3KSFFQP3C9BFQQ>@?% $&; @b/<% KFP>AEP3@DJ>C9DGDA39DFC% N(H(I$H(% ,#)"K()0$%
飞虱科昆虫是半翅目 "N>KDQ9>@3#头喙亚目
"
一个科!该科昆虫均为植食性!以刺吸式口器吮吸植
物的汁液&夺取植物的营养!使植物营养不良!或至
枯萎!或在吮吸部位出现黄色或黄褐色病斑!有的种
类还能传播植物病毒病*$+ 飞虱科中的很多种类是
重要的农林害虫!全世界专门取食为害竹子的飞虱
共有 "# 属 $#- 种!其中!多数为凹距飞虱族"O@FQD(
JFA>QB3PDCD#的种类!每年都对林业生产造成巨大损
失*$ U%+ 竹子飞虱发生数量大!繁殖速度惊人!已成
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
为竹子上较重要的一类害虫!如叉突竹飞虱"T(L1
J2%0G*(5( K2#)( NE3C6$&bDC6#&橘色竹飞虱"TF)0
)"H"#(&( NE3C6$&OD3C#&台湾竹飞虱"TF&(0O(4$4%0%
"5ED@##&花翅梯顶飞虱 ",#)"K()0$%L()2H(&0G$440%
bDC6#&黄小头飞虱"N(H(I$H( KH(E( bDC6$&NE#&台
湾叶角飞虱"@2#"*0&( &O0O(4$4%0%5ED@#&中华叶角飞
虱"@F%040)( NE3C6$&bDC6#&短头飞虱 "AG$2#?%(
4(O(0539?EKE@3#等*) U++
害竹飞虱种类繁多!近缘类群不易区分!如簇角
飞虱属"T$H")$#( 5ED@#的中华簇角飞虱"TF%04$4%0%
5ED@#&褐额簇角飞虱"TFK2%)0K#"4%2B>C#和爬竹簇
角飞虱"TF(LG$H")(H(L2%2B>C $&O?3D#%小头飞虱
属的黄小头飞虱和四刺小头飞虱 "NF&$&#()(4&*(
lDC $&mB3C6#
*$!-!* U$#+
%此外!同一种类的不同地理种
群外形差异也较大!如爬竹梯顶飞虱",F(LG$H")(1
H(L2%2B>C#&黄小头飞虱*&! $$+ !这些都给实际鉴定
工作带来困难 为了更好的对上述近缘类群及不同
地理种群等进行研究!本文利用相关种类的 $&; @b(
/<基因序列进行序列比对&遗传距离分析和系统发
育重建等工作!以凹距飞虱族中的害竹飞虱为内群&
飞虱 族 中 褐 飞 虱 属 "-0H(G(#E(&( "?9z3P## 为 外
群*$" U$%+ !探讨相关种类的分子系统关系 弄清害竹
飞虱的分类关系!对于探讨飞虱科&凹距飞虱族分类
关系及系统演化具有重要意义!同时也可为实际生
产中害虫的鉴定提供一定的科学依据
$!材料与方法
=V=>供试虫源
供试标本 - 属 $# 种 $- 地理种群为近年作者采
自海南&广东等地的飞虱科&飞虱亚科&凹距飞虱族
和飞虱族的代表种类!标本均保存于无水乙醇
中*$"+ !相关信息见表 $ 实验前将供试飞虱标本外
生殖器解剖并保存于甘油中备查
表 =>本研究中所用的标本
属 种名 采样地点 序列号
簇角飞虱属 中华簇角飞虱 "TF%04$4%0%5ED@# 广东广州华南植物园 N5"%%-*
中华簇角飞虱 "TF%04$4%0%5ED@# 海南尖峰岭 N5"%%+#$
褐额簇角飞虱 "TFK2%)0K#"4%2B>C# 贵州贵阳花溪 N5"%%-+
爬竹簇角飞虱 "TF(LG$H")(H(L2%2B>C >9O?3D# 贵州兴义马岭河 N5"%%&#
梯顶飞虱属 梯顶飞虱 ",FK2H(O(?5ED@# 广东珠海三灶 N5"%%%*
梯顶飞虱 ",FK2H(O(?5ED@# 海南大田 N5"%%*&
爬竹梯顶飞虱 ",F(LG$H")(H(L2%2B>C# 贵州兴义马岭河 N5"%%%
爬竹梯顶飞虱 ",F(LG$H")(H(L2%2B>C# 贵州道真大沙河 N5"%%-
叶角飞虱属 纹翅叶角飞虱"@F&*$"540%H>CC3B# 广东珠海三灶 N5"%%%
台湾叶角飞虱"@F&(0O(4$4%0%5ED@# 广东肇庆七星岩 N5"%%%)
台湾叶角飞虱"@F&(0O(4$4%0%5ED@# 广东广州华南植物园 N5"%%+"
小头飞虱属 黄小头飞虱"NFKH(E( bDC6>9NE# 广东珠海三灶 N5"%%))
黄小头飞虱"NFKH(E( bDC6>9NE# 海南五指山 N5"%%"
四刺小头飞虱"NF&$&#()(4&*( lDC >9mB3C6# 海南大田 N5"%%*-
褐飞虱属 褐飞虱"-FH25$4%";9z3P## 广东珠海三灶 N5"%%)*
=V?>实验方法
$V"V$!基因组b/<的提取!将保存于无水乙醇中
的标本用无菌双蒸水浸泡 % J 以上!实验前用 ;O]
溶液浸泡标本过夜*$)+ !后将供试虫体水分吸干并将
其研磨至无明显组织块!用基因组 b/<抽提试剂盒
提取基因组b/$ " C6-
)
Z
U$
!于U"# ^保存备用
$V"V"!72=扩增及产物回收!72=扩增引物参考
文献*$"+!引物序列为$$&;(7H"-0(822O8OOO
Z!内含 $# KKFP-
Z
U$
O@D?" QN值 +,%#!-# KKFP-ZU$ 42$!#,#$0
O@D9FC r($##!",# KKFP-Z
U$
562P
"
!#," KKFP-Z
U$
J/O7!#," KKFP-Z
U$引物!$,# iO3X 酶以及 $
)
Z
"含 $ " C6b/<#模板溶液 72=反应条件为$*-
^预变性 KDC!之后每个循环包括 *- ^变性 -# ?!
-# ^退火 $ KDC!" ^延伸 $ KDC!%- 个循环!" ^
延伸 $# KDC 72=产物用 $,#0的琼脂糖凝胶电泳
进行检测其片段大小&纯度及含量
$V"V%!72=产物的回收及克隆!通过琼脂糖凝胶电
&&
第 $ 期 侯晓晖等$利用 $&; @b/<基因序列进行害竹飞虱"半翅目$飞虱科#的分子鉴定
泳检测后!对扩增效果良好且足量的 72=产物采用
i/.l($#柱式胶回收试剂盒进行回收纯化!U"# ^保
存备用或继续实验 72=回收产物与75b$+(O载体
连接!$& ^保存 % B 以上!再用热激法转化进 bN-
$
感受态细菌中!蓝白斑筛选出阳性克隆后扩增备用
$V"V)!阳性克隆质粒提取及测序!阳性克隆菌质
粒由北京天根公司的质粒小提试剂盒提取!测序由
大连宝生物工程有限公司完成 测序仪为
bI>
+
O>@KDC39F@T%V$ 2IAP>;>XE>CADC64D9"
LDF?I?9>K?#!测序引物为通用引物
=VA>数据分析
本研究测定了飞虱科 - 属 $# 种 $- 地理种群的
$&; @b/<序列 "表 $#!用2PE?93Pr"V# 对其序列进
行比对!其参数设置为默认参数*$-+ 通过分析软件
5]8<)V#
*$&+分析各物种间 $&; @b/<基因的碱基组
成&变异位点&简约信息位点和遗传距离等 系统发
育分析以褐飞虱为外群*$" U$%+ !利用 5]8<)V# 软件
中邻接法"/>D6BSF@(MFDCDC6K>9BFJ!/c#和最大简约法
"53WDKEKQ3@?DKFCI!57#重建分子系统树!并通过
LFF9?9@3Q$ ###次自举检验系统树中各结点的置信值
"!结果与分析
?V=>碱基组成及序列变异
利用5]8<)V# 软件对本研究中相关种类的
K9b/<$&; @b/<序列进行统计分析!结果表明$共
有 )+# 个位点"包括 83Q#!其中!<&O&8&2含量分
别为 %,$0&)#,)0&$),)0&+,$0!
变异位点 $*# 个!其中!简约信息位点 $- 个!自裔
位点 %" 个!约占总序列的 %*,& 0 本研究所获序
列已登录8>CL3C:!序列号见表 $
?V?>遗传距离分析
利用5]8<),# 软件统计飞虱科 - 属 $# 种 $-
地理种群的 $&; @b/<序列间遗传距离!结果"表 "#
表明$外群和内群"即褐飞虱属与梯顶飞虱属&簇角
飞虱属&叶角飞虱属&小头飞虱属#间的遗传距离为
#,"+%"褐飞虱与爬竹梯顶飞虱 bm#到 #,%&%"褐飞
虱与中华簇角飞虱N/#%内群各属"即梯顶飞虱属&
簇角飞虱属&叶角飞虱属和小头飞虱属#间的遗传距
离为 #,$&""纹翅叶角飞虱与爬竹梯顶飞虱 bm#到
#,"&)"台湾叶角飞虱 ml与黄小头飞虱 N/#%在内
群各属不同种间!遗传距离为 #,#-"爬竹簇角飞虱
与褐额簇角飞虱#到 #,$*&"梯顶飞虱 N/与爬竹梯
顶飞虱bm#%在内群各属同种不同地理种群间!遗传
距离为 #,##""梯顶飞虱 8b和 N/&中华簇角飞虱
8b和N/&台湾叶角飞虱 ml和 8m#到 #,#%-"爬竹
梯顶飞虱rg和bm#
表 ?>=Y 种飞虱 ="$.Q-8基因序列的遗传距离
飞虱种类 $ " % ) - & + * $# $$ $" $% $)
$ 褐额簇角飞虱
" 中华簇角飞虱"8b# #,$"$
% 中华簇角飞虱"N/# #,$") #,##"
) 爬竹簇角飞虱 #,#- #,$") #,$""
- 梯顶飞虱"8b# #,"$% #,"$ #,""# #,$*)
& 梯顶飞虱"N/# #,"$& #,""# #,"$ #,$*$ #,##"
爬竹梯顶飞虱"rg# #,$$ #,"# #,"$# #,"## #,$++ #,$*$
+ 爬竹梯顶飞虱"bm# #,$&* #,$*+ #,"#$ #,"#% #,$*% #,$*& #,#%-
* 纹翅叶角飞虱 #,$&& #,$+" #,$+- #,$&* #,""" #,""- #,$&+ #,$&"
$# 台湾叶角飞虱"ml# #,"#& #,"$# #,"$% #,"#- #,"$* #,""" #,$+* #,$+# #,$$#
$$ 台湾叶角飞虱"8m# #,"#$ #,"#& #,"#* #,"#$ #,"$) #,"$ #,$+- #,$& #,$# #,##"
$" 黄小头飞虱"8b# #,$ #,")# #,")% #,$++ #,")& #,"-# #,$* #,$ #,"$) #,")* #,"))
$% 黄小头飞虱"N/# #,$*# #,")* #,"-" #,$* #,"-# #,"-% #,$* #,$++ #,""& #,"&) #,"-* #,#""
$) 四刺小头飞虱 #,$+& #,"%) #,"% #,$*+ #,"%+ #,")$ #,$& #,$+# #,"#* #,"%- #,"%# #,# #,#+"
$- 褐飞虱 #,%"- #,%&# #,%&% #,%-" #,%## #,%#% #,"++ #,"+% #,%$+ #,%$+ #,%$" #,%$" #,%$) #,"+-
从本文的遗传距离分析结果看!外群与内群的
遗传距离平均为 #,%$!内群各属间的遗传距离平
均为 #,"#*!内群各属内的遗传距离平均为 #,$%"!
而种内不同地理种群间的遗传距离平均为 #,#$%
&
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
如前所述!不同阶元飞虱标本间的遗传距离基本可
以区分开来!尤其是种内和种间&内群和外群完全可
以区分开来!即可以通过计算遗传距离明确区分上
述种类
?@A>分子系统树
根据测序的结果!以褐飞虱属代表种"褐飞虱#
为外群!采用最大简约法"57# 和邻接法"/c# 分别
构建了 $# 种飞虱的分子系统树!得到基本一致的拓
扑结构"图 $&"#!LFF9?9@3Q $ ### 次检验系统树各支
均得到较高的支持率 内群的各属各自构成单系
"梯顶飞虱属除外#!其中!簇角飞虱属与叶角飞虱
属先聚为一支!再与梯顶飞虱属和"或#小头飞虱属
相聚%各属内部聚为一支的置信值高达 *+0"梯顶
飞虱属除外#!而属间相聚的置信值则普遍较低
图 $!飞虱科 $# 种昆虫/c分子系统树"图中数字为自举检验置信值 $ ### 次#
图 "!飞虱科 $# 种昆虫57分子系统树"图中数字为自举检验置信值 $ ### 次#
%!讨论
AV=>种上阶元亲缘关系
如前所述!不同属的飞虱基于外形基本可以区
分出来!但是同属不同种类的飞虱!尤其是近缘类群
仅仅基于外形就很难区分*$!-!* U$#+
从本文的遗传距离分析结果看!内群各属间和
各属内为同一阶元内部不同种飞虱之间的比较!二
者遗传距离平均值"分别为 #,"#* 和 #,$%"#与叶文
斌等*$"+结论相符!通过计算遗传距离可以基本区分
属间和属内的种类
由图 $&" 可知$首先!各属飞虱间支序图分支节
点的置信值较低!不能以此来评判亲缘关系的远近%
其次!各属飞虱基本上各自构成一单系群!唯独梯顶
飞虱属 " 种"梯顶飞虱和爬竹梯顶飞虱没有聚为一
支!这可能与梯顶飞虱既取食杂草又取食竹子而爬
+&
第 $ 期 侯晓晖等$利用 $&; @b/<基因序列进行害竹飞虱"半翅目$飞虱科#的分子鉴定
竹梯顶飞虱仅取食竹子有关
AV?>种下阶元亲缘关系
飞虱科中同种但不同地理种群的飞虱有些没有
任何差别"如台湾叶角飞虱&中华簇角飞虱和梯顶飞
虱#!有些则在外形上差异较大"如小头飞虱和爬竹
梯顶飞虱# *&! $$+ !只有通过解剖外生殖器才能得出
结论
从本文的遗传距离分析结果看!种内不同地理
种群间的遗传距离平均值"#,#$%#远远低于不同种
类"属内#之间的遗传距离平均值"#,$%$#!故通过
计算遗传距离可以初步判断是否为同一种类 另
外!由表 " 可知!台湾叶角飞虱&中华簇角飞虱和梯
顶飞虱各自不同地理种群的遗传距离为 #,##"!而
小头飞虱和爬竹梯顶飞虱各自的不同地理种群的遗
传距离分别为 #,#"" 和 #,#%-!显然后者不同地理种
群之间的区别远大于前者!这一结论与形态学研究
相吻合*&! $$+
由图 $&" 可知$同种飞虱各自不同地理种群尽
管遗传距离相差较大!但仍然可以聚为一支!即构成
一单系群!故根据支序图可以很好的区分不同种类
飞虱!进而支持形态学的结论*&! $$+
综上所述!本文分析结果完全支持传统分类学
的观点!与陈祥盛等*- U&+ &秦道正等*$#+ &侯晓晖
等*$$+的观点一致!这为今后更多的引入分子手段与
传统分类相结合共同解决经典分类无法解决的问题
探明道路
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9@DWABFDA>*c+V/EAP>DA
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3@I8>C>9DA?
P>@LDFPF6I3CJ ]TFPE9DFC! "##! ")$ $-*& U$-**
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