全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
林业科学研究　2007, 20 (5) : 722～725
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2007) 0520722204
绿竹咖啡酸 2O2甲基转移酶基因 (COM T)
的克隆及相关分析
李雪平 1 , 高志民 1 , 彭镇华 23 , 岳永德 1 , 高　健 1 , 蔡春菊 1 , 牟少华 1
(1. 国际竹藤网络中心 ,国家林业局竹藤科学与技术重点开放实验室 ,北京　100102; 2. 中国林业科学研究院林业研究所 ,北京　100091)
摘要 :采用 RT2PCR及 RACE方法从绿竹中分离了 COM T基因家族的一个基因 ,命名为 B oCOM T1。B oCOM T1全长
1 377 bp,编码一个 361 aa的蛋白 ,估计分子量为 39 kDa。BoCOMT1与小麦的 TaCOMT、甘蔗的 SoCOMT、玉米的
ZmCOMT和毛白杨的 PtCOMT的氨基酸序列比对结果表明 , BoCOMT1与 TaCOMT的氨基酸同源性最高 ,达到
86. 7% ,系统进化树的分析表明 , BoCOMT1与 TaCOMT亲缘关系较近。RT2PCR结果显示 , B oCOM T1在茎中的表达
量约为叶中的 2倍。
关键词 :绿竹 ;咖啡酸 2O2甲基转移酶 ;克隆
中图分类号 : S795. 5 文献标识码 : A
收稿日期 : 2007204209
基金项目 : 国家林业局 948项目 (200524238, 200424260) ,国际竹藤网络中心青年基金项目 (115)
作者简介 : 李雪平 (1975—) ,女 ,河北任丘人 ,助研 ,博士.3 通讯作者.
C lon ing and Character iza tion of COM T Gene from B am busa oldham ii
L I Xue2ping1 , GAO Zhi2m in1 , PENG Zhen2hua23 , YUE Yong2de1 , GAO J ian1 , CA I Chun2ju1 , MU Shao2hua1
(1. International Center for Bamboo and Rattan, Key Laboratory of Bamboo and Rattan Science and Technology,
State Forestry Adm inistration, Beijing　100102, China; 2. Research Institute of Forestry, CAF, Beijing　100091, China)
Abstract:A gene of COM T fam ily was cloned by RT2PCR and RACE from B am busa oldham ii and named B o2
COM T1. B oCOM T1, with a full length of 1 377 bp, encoded a polypep tide of 361 am ino acids with p redicted mo2
lecular mass of 39 kDa. The results of am ino acid sequence analysis showed thatBoCOMT1 had the highest sim ilari2
ty of 86. 7% with TaCOMT, phylogenetic analysis showed that B oCOM T1 is more related to TaCOMT. The exp res2
sion level of B oCOM T1 in stem is about two times as in leaf.
Key words:B am busa oldham ii; Caffeic acid232O2methyltransferase; Clone
木质素是植物体中仅次于纤维素的一种重要的
芳香族化合物 ,通常占木材干质量的 15% ～36% [ 1 ]。
在造纸工业中 ,除去木质素的化学处理对环境造成了
极大的污染 ,因此 ,目前很重视利用生物技术来降低
木材中的木质素含量及培育木质素含量低的植物新
品种。目前 ,科研人员对于木质素合成调控方面的研
究集中在其合成过程中的各种生物酶上 ,以单个基因
的调控为主 ,也有少数对 2个或多个基因的调控进行
研究 [ 2～4 ]。杨雪萍等 [ 2 ]将 4CL1基因反向导入烟草
中 ,获得了木质素含量较低的转基因植株 ;赵华燕
等 [ 3 ]将 COM T和 CCoAOM T同时反向导入烟草中发
现 ,反义抑制 COM T与 CCoAOM T的表达均使转基因
植株的木质素含量下降 , 2个基因同时被抑制时 ,降低
辐度更大。据不完全统计 ,至今已在杨树等 20余种
植物中克隆出了 100多个不同的基因或 cDNA,包括
CAD、C4H、CCR、COMT、CCoAOMT、PAL、4CL等多个
类别 [ 1 ]。COMT是木质素合成过程中的关键酶之一 ,
在苯丙氨酸途径中 , COMT催化咖啡酸、52羟基松柏醛
和 52羟基松柏醇甲基化分别生成阿魏酸、芥子醛和芥
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第 5期 李雪平等 :绿竹咖啡酸 2O2甲基转移酶基因 (COMT)的克隆及相关分析
子醇 ,参与 S2木质素的合成。COM T已在很多植物中
被分离和鉴定 [ 5, 6 ] ,抑制 COM T基因的表达导致了木
质素含量的下降和成分的改变 [ 7～10 ]。绿竹属丛生竹
类 ,是我国原产的造纸源料竹种之一 ,以此为材料进
行木质素合成调节基因的研究具有重要的现实意义。
本文作者从竹子中克隆了 COM T基因并对其序列进
行了相关分析。
1　材料与方法
1. 1　实验材料
2005年 11月从浙江温州取回绿竹 (B am busa
oldham ii Munro. )插穗 ,长约 60 cm ,扦插在直径为
20 cm塑料盆中 ,培养介质为混合土 (腐殖质土 ∶蛭
石 = 7∶3) ,在国际竹藤网络中心温室中于 25 ℃培
养 ,每天光 /暗培养时间为 16 h /8 h。
1. 2 试剂
Trizol试剂购自 Invitrogen公司 ,逆转录试剂盒
购自 Promega公司 ,引物合成由上海生工生物工程
技术服务有限公司完成 , PCR聚合酶购自 Takara公
司 , RACE试剂盒购自 Clontech公司 ,回收试剂盒购
自上海申能博彩生物科技有限公司 ,测序由北京六
合通经贸有限公司完成。
1. 3　RNA的提取和 cD NA的合成
取绿竹幼嫩的叶片和茎 0. 1 g,液氮研磨 ,转入
Trizol液中提取 ,然后以氯仿去掉蛋白 ,加异丙醇沉
淀 ,以 75%乙醇洗沉淀 1 次 ,最后溶于适量不含
RNA酶的水中 [ 11 ]。然后以总 RNA为模板 ,逆转录
合成 cDNA。
1. 4 简并引物的设计及 PCR产物的克隆
根据玉米 ( Zea m ays L inn. , Q06509 )、水稻
(O ryza sa tiva L inn. , AB122056)和甘蔗 ( Saccharum
off icinarum L inn. , O82054)中 COM T基因的序列 ,利
用 CODEHOP软件设计简并引物。
正向引物 : 5’- CGCCCCGGTGTGCAARTGGYT2
NAC - 3’,
反向引物 : 5’- GATGAACTCGATGGCCCANGCRTT
- 3’, PCR反应体系为 : cDNA ( 0. 04μg·μL - 1 ) 1
μL,正向引物 ( 10μmol·L - 1 ) 1μL,反向引物 ( 10
μmol·L - 1 ) 1 μL, dNTP (各 2. 5 mmol) 3 μL,
2xBuffer 10μL, Taq酶 (5 U·μL - 1 ) 0. 2μL,总体积
为 20μL。反应条件 : 94 ℃ 1 m in, 55 ℃ 1 m in, 72 ℃
1 m in 30 s, 共 35 个循环。将 PCR 产物克隆到
pGEM 2T Easy载体上并测序。
1. 5　RACE扩增
5’RACE引物 : GSP1 5’2GCTCTCCATGAGGAC2
CTTGTCCTGG - 3’
NGSP1 5’2GAGGGCGAGGGCGGCCATGGAGACG - 3’
3’RACE引物: GSP2 5’2CACGGCAGGGTGATCATCGT2
GGAGT - 3’
NGSP2 5’2GGTGGCAAAGAGAGGTACGAGAGGG - 3’
通过巢式 PCR进行 RACE扩增。GSP1 /2与 UPM
配对的第 1轮 PCR反应的条件为 : 94 ℃ 30 s, 72 ℃ 3
m in, 5个循环 ; 94 ℃ 30 s, 70 ℃ 30 s, 72 ℃ 3 min, 5个循
环 ; 94 ℃ 30 s, 68 ℃ 30 s, 72 ℃ 3 min, 25个循环。NG2
SP1 /2与 NUPM配对的第 2轮 PCR反应的条件为 : 94
℃ 30 s, 68 ℃ 30 s, 72 ℃ 3 m in, 25个循环。PCR产物
回收后连接到 pGEM2T Easy载体上测序。
1. 6　氨基酸序列比对与系统进化树的构建
以 BoCOMT1的氨基酸序列为问询对象 ,通过
BLAST程序 ,从 GenBank中挑选出小麦 ( Triticum aes2
tivum L inn. ,AAP23942)、甘蔗、玉米和毛白杨 ( Populus
tom entosa Carr. ,AAF63200)中的 COM T基因序列 ,并
通过 DNASTAR软件 MegA ligen将这 4个基因与 B o2
COM T1基因的氨基酸序列进行多序列比对分析。
1. 7　RT2PCR检测 B oCOM T1基因的组织特异性
表达
提取叶和茎的总 RNA,然后逆转录成 cDNA。
以 cDNA为模板 ,用 actin引物进行 PCR反应 ,将模
板用量调成一致。改用 B oCOM T1基因的引物 ,用一
致的模板量再进行 PCR反应 ,所用引物为 :
正向引物 : 5’2ATGGGTTCCACCGCCGCCGAC - 3’
反向引物 : 5’2CTACTTGATGAACTCGATGGCCC - 3’
PCR反应条件 : 94 ℃ 1 m in, 65 ℃ 1 m in, 72 ℃
2 m in,循环数为 30个。
2　结果与分析
2. 1　B oCOM T1基因的克隆
通过简并引物 PCR获得了一个约 750 bp的片
段 ,与预期的基因片段大小一致 ,回收后与 T载体连
接进行测序 ,测序结果通过 BLAST程序在 GenBank
中进行对比。结果表明其 3’和 5’端都不完整 ,因此
根据它的序列设计 3’和 5’端 RACE引物 ,进行巢式
PCR,分别得到 1个片段 (图 1)。将这 2个片段测序
后与通过简并引物扩增获得的片段拼接 ,去掉重叠
部分 ,得到一个全长为 1 377 bp 的基因序列。在
GenBank中的注册号为 EF495248。
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林 　业 　科 　学 　研 　究 第 20卷
图 1　3’RACE和 5’RACE电泳分析图
2. 2　B oCOM T1基因的序列分析
B oCOM T1基因序列如图 2 所示。基因全长
1 377 bp,包含一个 1 083 bp 的读码框 ,编码一个
361 aa的蛋白 ,分子量约为 39 kDa,推测的等电点为
51228。B oCOM T1的读码框中 ( G + C)的含量较高 ,
为 65. 84% ,这是禾本科单子叶植物基因序列的
特点 [ 10 ]。
图 2　B oCOM T1的核酸序列及其推导出的氨基酸序列 (加框部分为 RACE引物 )
2. 3　氨基酸序列比较与系统进化树分析
B oCOM T1基因与其它 4个 COM T基因的氨基酸
序列比对分析发现 , BoCOMT1与 TaCOMT的氨基酸
同源性最高 ,达到 86. 7% ,而与 PtCOMT的氨基酸同
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第 5期 李雪平等 :绿竹咖啡酸 2O2甲基转移酶基因 (COMT)的克隆及相关分析
源性最低 ,为 62. 5%。从整个氨基酸序列来看 , 5’端
的保守性较 3’端要低一些。从图 3看出 , B oCOM T1
与禾本科的 COM T基因亲缘关系较近 ,而与杨柳科的
亲缘关系较远 ,这符合它在分类学上的地位。
图 3　B oCOM T1与其它植物的 COM T
基因氨基酸序列的系统进化树分析
2. 4 B oCOM T1基因的组织表达特异性分析
从绿竹的叶和茎中分别提取总 RNA,逆转录成
cDNA,用于 RT2PCR扩增。以 cDNA为模板 ,用 actin
引物进行 PCR反应 ,将模板用量调成一致 ,茎和叶
的 cDNA用量分别为 1μL和 4μL。在 cDNA模板
用量一致的基础上 ,以 B oCOM T1的引物再进行 RT2
PCR,结果如图 4所示 , B oCOM T1在茎中的表达量较
叶中高 ,大约是叶的 2倍。
图 4　B oCOM T1在不同组织中的表达特性
3　结论
COMT是植物木质素合成过程中一个重要的甲
基转移酶。研究已表明 ,抑制 COM T基因的表达能
改善转基因植株中木质素的组成或含量。在转基因
烟草中 , COM T基因的抑制表达导致木质素下降了
35% [ 7 ]。作者从竹子中克隆到了 COM T基因 ,无论
从核酸水平还是氨基酸水平来看 , B oCOM T1与已知
的禾本科植物中的 COM T基因有很高的同源性 ,而
这些基因都不同程度地参与了木质素生物合成的调
控 ,这说明 B oCOM T1基因也可能参与了竹子木质素
的生物合成过程 ,为研究竹子木质素的生物合成调
控提供了可能。
B oCOM T1基因在叶和茎中都有表达 ,且茎中的
表达量要高于叶片。与叶片相比 ,茎需要更多的木
质素来维持机械强度。从这个意义上说 , B oCOM T1
基因在茎中的表达量高 ,这进一步说明了其参与木
质素合成的可能性。基因表达与植物的发育期密切
相关 ,同一基因在不同的发育期表达量有显著差异 ,
魏建华等 [ 12 ]发现毛白杨 COM T基因的表达有明显
的季节性 ,在晚材形成时有峰量表达 ,这与 COM T基
因的功能是一致的。据此推测 , B oCOM T1基因在不
同季节的表达量可能有很大变化 ,这有待进一步的
研究来证明。
总之 ,本文研究证明 , B oCOM T1基因可能是竹
子 COM T基因家族中的一个成员 ,且有可能参与了
竹木质素的生物合成过程 ,但其作用底物或具体的
功能尚不明确 ,有待深入研究。
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