全 文 ：第 3 卷 第 2 期
1 9 9 0 年 4 月
林 业 科 学 研 究 V o l. 3
FO R E S T R E S EA R C H A p r
. ,
,
N o
.
2
1 9 9 0
长春花感染泡桐丛枝病原(M LO) 后
过氧化物同功酶的变化 .
田国忠 金开漩 汪跃
(中困林 业科学研究院林业研究所 )
摘要 用 聚丙 烯酞胺凝胶 电泳分析表明 , 长春花植林感染泡桐丛枝病原 (M LO )
后 茎叶中过乳化物同功酶总谱带数呈减 少的趋 势 , 健株最 多产生 n 条酶带 , 通常具
有 6 条典型的 、 稳定的谱带 , 即 I 。、 I 。 、 I d 、 五 、 l d 和 1 。 ; ,肠表现典型的 l 级
症状的病株缺 少低 R f 位 区的 l d 和 1 。 带 。 l d 和 1 。 酶带的有无 、 浓度及活性 与
病株外部症状的严重度成负相 关 。 七叶期前的健株幼 苗茎叶 中也 无 l d 和 皿。 谱带 ,
随着植抹生理年龄 的增 长 , 其活性和浓度逐渐增大。 土 霉素处理病株可 以 提 高 Il d
和 1 . 酶带的活 性和浓度 。
关锐词 泡桐丛枝病原(ML O ) , 长春花 , 过乳化物同功酶 , 聚丙 烯酸 胺 凝胶
电泳
由类菌原体(M LO )引起的泡桐丛枝病是泡桐栽培中的严重问题 。 深入了解病原和寄主之
间的关系 , 探索 M LO 侵染植株后引起的生理生化变化 , 对于病害的早期诊断 和抗病育种工
作具有重要意义 。
过氧化物酶是植物体内广泛存在的一种酶 , 参入多种代谢途径 , 病原物的侵 染造成植株
(包括泡桐 )体内过氧化物同功酶的变化在国内外 已有许多报道 【‘一 吕J。 鉴于病健泡桐的形态和
生理年龄的差异较大 , 因而本试验将探索泡桐丛枝病原侵染长春花后过氧化物同功酶的变化
规律 , 试图明确其变化对病害早期诊断和植株对病原抗性的作用 。
一 、 材料和方法
(一 ) 感染泡桐丛枝病的长春花病株
选 用相同来源的 一长春花 (Vl’。: a : os 。 )种子于三月上旬在25 ℃左右的温室育苗 , 分别用带
菌的南方苑丝子 (C “ : ‘。ta 。: : t , al l’s )将病原(M L O)转接到长春花植株上 , 待表现典型的叶片
黄化 、 从枝和花变小或花变叶症状 , 经切片和 D API 染色后于荧光显微镜下检查证 实 M LO
的存在 1。 , ‘“ {。 山 J’-侵 染期、 接种量和植株本身的差异 , 症状表现有很大的不同 , 可分为下级 :
本文 于 1 9 8 9年 1 月 9 日收到 。
本课题为 中囚林 业科学研究院科学基金项 [l 。
2 期 田 国忠等 : 长春花感染泡桐丛枝病原(M LO )后过氧化物同功酶的变化 1 4 7
I级 顶梢叶片黄化 , 下部生长正常 , 未丛枝 ; 能开花 , 但比正常花小 、 色淡 。
五级 整株叶片黄化 , 未丛枝 , 很少开花 。
皿 级 整株叶片变小 , 黄化 , 丛枝 ; 植株矮化 , 不能开花或花变叶 , 严重时提早死亡 。
(二 ) 过妞化物同功酶的提取
取相同生理年龄的发病长春花顶梢 , 用蒸馏水洗净后擦干 , 称其 重 量 , 于 一 20 ℃冰 箱
中冰冻后 , 加入。。 1 M T ri s一H cl 缓冲液 , 病叶 (重 量 g ) : 0 . I M T ri s一H cl 缓 冲液 (体 积
m l)为 i : i , 研磨匀浆后离心 , 1 4 o o o r / m in , 1 0 m in , 上清液 (酶液 )于 4 ℃下保存备 用 。
(三) 聚丙烯醉胺凝胶电泳和过叙化物同功酶染色及酶谱的扫描
采用不连续垂直板凝胶电泳方法 I” ] , 分离胶浓度为 7 . 5 % , 浓缩胶为 2 . 5 % ; 每孔加样
3 0 ~ 5 0 p l
, 加样后电泳 , 稳流3 0 m A , 电泳时间约为 4 ~ s h 。
过氧化物同功酶染色采用吴少伯的抗坏血酸一联苯胺法 L‘“; , 至酶带清晰后 , 倾出染色液 ,
用蒸馏水漂洗后观察分析 。
酶带置于津岛 U V 一1 90 双波长凝胶扫描仪上扫描 , 扫描波长60 0 n m , 参比波长 4 0 n m 。
(四 ) 抗菌案洽疗试验 〔‘“〕及处理后过叙化物同功酶谱的分析
选取相同生理年龄的病株和健株对照 , 病株表现为 l 级症状 , 从花盆中倾出后小心冲去
土壤 , 将根浸泡于2 0 m l土霉素水溶液中 , 浓度为 1。。卜g / m ! , 浸泡 20 h , 用水漂洗后重新
植于花盆中 , 对照以蒸馏水浸泡。 置25 ℃左右充足光照和合适的水肥条件下生长。
处理后20 天 , 记载病情变化 , 并取样进行过氧化物同功酶分析 。
二 、 试验结果
(一 ) 病健株过叙化物同功醉谱的差异
健康长春花茎叶最多出现n 条谱带 , 根据其特点可分为 I 、 亚和 皿 区域 。 工区为高 R f值
区 , 因受各种因素的影响而变化 , 故称可变区 , 共有 5 条带 (工。、 工b 、 工。 、 工d 和 I 。) ; 五
区为中 R f值区 , 只有一条带且变化小 , 故称稳定区 ; 工 区为低 R f值 区 , 又称为易变区 , 共
有 5 条带 (1 。、 皿 、、 班 。 、 l d 和 皿 。)。 多次重复取样电泳结果显示 , 健株稳定的 谱 带 共 有
6 条 , 即 工b 、 工。 、 I d 、 五 、 皿 d 和 兀 . , 其中以 工、、 亚和 Jl d 、 皿 。 4 条谱 带 颜 色最深 , 活
性最强 , 且 l d 和 l 。 两带常因浓度和活性强而合并为一条带。 以病级 兀与健 株 酶 带比 较 ,
病株缺少 1 区的所有谱带 , 其中兀 d 和 1 。 两条酶带最为典型 , 兀区与健株无明显 差 异 , 工
区的谱带变化与病原 (ML O )侵染也无明显的相关性 。 图 1 可以肯定, 泡桐丛枝病病原 ML O
侵染长春花植株后 , 对低 R f值区的同功酶带影响最大 , 在 l[ 区健株有时会比病株多 出现一
至三条微弱的染色带(皿 . 、 皿、和 l 。)。 由于其活性和浓度低 , 很难说明在病株中这几 条 带
的消失与 M LO 的侵染有任何相关性。
(二 ) 症状类型与过权化物同功醉的关系
图 2 可以看出 , 酶带 皿 d 、 兀 。 的浓度和活性与症状严重度呈明显的负相 关 性 , 即 发病
越严重颜色越浅 , 至病级 1 时则检测不到 。 I 区和 卫区酶带这种相关性不显著 。
用过氧化物同功酶谱比较病株上的黄化顶梢和绿色顶梢(尚未表现症状 ) , 结果为两者的
酶带 班d 和 1 。的活性和浓度均低于健康对照 , 但黄化顶梢的又低于绿色顶梢的 (图 3 )。
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: .犷‘ 围口 姗色深
乎严‘。
皿 区
e d e ba e d e b a
人
图 1 病健长春花植株茎 叶过 氧化物 同功酶谱
人 . 健株可产 生的酶带最 多 B . 健 株典型酶谱
C
. 表现 典型 l 级症状的病株醉 谱
二灿、沙口加健株 病级注 病级 1 病级皿
图 2 不 同症状类型的发病长春花 植株顶 梢茎叶过氧化物同功醉扫描曲线 (箭头所指 为 Il d 和 皿 。位 置)
接 种 时 期 , 、 叶 期 {生长
1。。d
l
生长3。。d
级娜妈
’才‘ : : . , : 。 : _
/ 以- 户扔 筑儿健株 病掩绿斑村 病操公化怜
表 1 不同生长期传染长春花
植株发病率
发病株率
图 3 病株上 黄化枝和未黄化枝的过氧化物同功
酶谱扫描 曲线 (% )
未发病株率(% )
皿‘
’ .八 _
{以儿为 接 种 株 数
; 2
·
1
1
0 2
·
1
1
0 7
·
2
{
。。
}
4 1
3 6 0天 18 0 天 7 5天对 丸介七产J粗叶期 七叶期 六叶期
图 4 健康长春花植株不同生长期的茎叶过氧化 物 同
功醉谱扫描曲线(图示 I 和班 区 , 箭 头所指位
置为 址. 和 I d )
图 5 土琢素溶 液浸
根处理后病株 过氧化
物 同功醉 谱
(蒸馏水浸根 : 1 . 半
年发病株 , l 级 , 3 .
半年生健株对 照
土霉素浸根: 2 . 半
年 发病株 , l 级 , 4.
半年生健株对 照 , 5 .
一年发病株 , I 级 ,
6
. 二年发 病株, l
级 )
2 期 田 国忠等 : 长春花感染泡桐丛枝病原(M L O )后过氧化物同功酶的变化 14 9
(三 ) 植株的不同生长期抗性与体内过妞化物同功醉的关系
对五对真叶至一年生的健康长春花植株顶梢茎叶过氧化物同功酶带的分析结果表明 , 六
叶期前检测不到酶带 l d 和 l 。 , 七叶期后开始显示其活性 , 且 随 生 理年龄的增 加 , 活 性和
浓度逐渐增大 , 见图 4 。 同时对八叶期 、 生长1 80 天和3 60 天的健康长春花植株用芜丝子接种
泡桐丛枝病 MLO , 待其充分发病后调查其发病情况 。 从表 1 中看出 , 接种时间越早 , 发病
率越高 , 症状也越严重 , 这与健株体内过氧化物同功酶带 l d 和 1 . 的变化趋势相吻合 。 因而
推断 皿 d 和 l 。 两酶带与长春花植株对 ML O 的抗性有关。
(四 ) 土拼案处理病株对过饭化物同功醉谱的影晌
经土霉素处理后20 天 , 发病半年植株的黄化顶梢叶片开始变绿 , 新抽出腋芽叶片正常 ,
过氧化物同功酶分析发现 l d 和 uI 。 两酶带活性明显高于清水对照 , 但仍低于健康植株水平 。
发病一年和两年的病株 , 经处理后20 天 , 其外部症状未有明显的变化 , 但电泳结果表明 , 皿 d
和皿 。 两带 的活性和浓度均高于对照 (蒸馏水浸根)( 见图 5 ) 。 抗菌素 (四环素簇 )能抑制 MLO
的生长和繁殖 , 因而会部分地解除病原对 l d 和 1 。 酶带产生或活性 降 低 的抑制因子 , 这也
间接地说明这两条酶带的变化与 MLO 的存在有密切关系。
三 、 讨 论
从试验结果看出 , 泡桐丛枝病 MLO 侵染长春花植株后引起体内过氧化物同功酶带的减
少。其它植物上由 MLO 引起的病害象月季绿瓣病山 、木麻黄丛枝病 [ 3 1和桑树黄化型萎缩病 I’]
均出现类似的规律 。 而某些真菌和病毒引起的病害象棉花枯萎病 I‘」和大豆花叶病 [6] 等分别出
现相反的结论。 即使是泡桐丛枝病原 M LO 侵染泡桐和长春花植株所引起的过氧化物同功酶
的变化规律也不尽一致 口 ’“l , 其原因有待进一步探讨 。就长春花植株感染袍桐丛枝病原 ML O
来说 , 某些酶带是相对稳定的 , 受植株年龄、 季节变化及病原物的干扰甚小 , 它们是维持植
株代谢的基础酶。 而有些酶带则是富于变化的 , 它们在逆境生理变化中起重要的作用 , 因而
在选育抗病品种时 , 这类酶带会成为抗病性的生化指标 。
长春花植株感染泡桐丛枝病 M LO 后的过氧化物同功酶的变化是一个复杂的过程, 准确
地阐明这些变化与 MLO 侵染的相关性本质 , 还需作大量的研究 , 因而试图以过氧化物同劝
酶的变化来早期诊断 ML O 的侵染有其局限性。
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