全 文 ：第 51 卷 第 4 期
2 0 1 5 年 4 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 51，No. 4
Apr．，2 0 1 5
doi:10．11707 / j．1001-7488．20150415
收稿日期: 2013 － 04 － 09; 修回日期: 2015 － 01 － 12。
基金项目: 林业公益性行业科研专项“重大森林病虫灾害防控技术的关键理论基础”(201204501) ; 国家“十二五”科技支撑项目“商品林
重大病虫害监测预警与防控技术研究示范”(2012BAD19B08)。
* 梁军为通讯作者。
土壤中杨树溃疡病生防菌的分离鉴定*
杨 蕾2，3 梁 军1，3 周国英2 倪 杨3 吕 全3 张星耀1，3
(1． 南京林业大学南方现代林业协同创新中心 南京 210037; 2． 中南林业科技大学林学院 长沙 410004;
3． 国家林业局森林保护重点试验室 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 北京 100091)
摘 要: 【目的】杨树溃疡病是中国杨树人工林重大生物灾害之一，采用生物防治的方法控制杨树溃疡病是持续有
效的手段。本研究旨在从杨树林地土壤中分离出对杨树溃疡病菌有良好生防效果的拮抗微生物。【方法】以杨树溃
疡病病原菌葡萄座腔菌为靶标，进行土壤中生防微生物的分离、筛选和鉴定。土壤微生物的分离采用稀释平板涂布
法; 拮抗微生物的筛选分为初筛、发酵液复筛和拮抗菌株离体复筛 3 步，初筛采用平板对峙法，拮抗菌发酵液复筛选
择三明治法和改良琼脂扩散法相结合的方法，最终通过离体组织防治效果测定确定目的生防菌株; 生防菌株的鉴定
采用形态学观察和分子生物学鉴定相结合的方法。【结果】在河北省廊坊市和河南省原阳县的杨树林地中按上、中、
下 3 层共采集 48 份土样，从土样中共分离得到微生物 259 株，其中细菌 122 株;放线菌 106 株;真菌 31 株，各土层微生
物数量规律整体符合上层 ＞中层 ＞下层; 通过平板对峙法初筛选择出 8 株抑菌带直径 ＞ 4 mm 的细菌和放线菌以及 8
株拮抗菌菌落直径 ＞ 40 mm 的真菌; 再通过发酵液三明治法和改良琼脂扩散法复筛，筛选出 8 株对杨树溃疡病有良
好抑制作用的拮抗菌，分别是细菌 TYZ1B3 和 YX5B1，真菌 LS10F1，LX5F1，LZ10F1，LS6F1，LX6F2 和 TLZ2F2; 最终通
过离体组织防治效果测定，从这 8 株拮抗菌株中筛选出 1 株土壤生防真菌 LX6F2，其对杨树离体组织溃疡病的防治效
果可达 76. 04% ; 经过形态学观察，菌株 LX6F2 的菌落、菌丝及孢子形态符合镰刀菌的特征，通过 rDNA-ITS 序列及其
系统发育分析，测得生防菌株 LX6F2 的序列长度为563 bp，序列登录号为 FＲ872729. 1，其与编号为 JN038467 的木贼
镰刀菌相似度高达 100%，从而鉴定该菌株为木贼镰刀菌。【结论】该菌株的发现为杨树溃疡病的生物防治提供了新
的原材料，对杨树溃疡病的可持续控制具有重要意义，可在后续研究中将进一步对其抑菌机理、有效拮抗成分及菌剂
研制等进行研究。
关键词: 土壤微生物;杨树溃疡病;木贼镰刀菌;拮抗活性;生防菌株
中图分类号: S761. 3 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2015)04 － 0116 － 10
Isolation and Identification of Bio-control Microorganisms in Soil to Poplar Canker
Yang Lei2，3 Liang Jun1，3 Zhou Guoying2 Ni Yang3 Lü Quan3 Zhang Xingyao1，3
(1 ． Southern modern forestry cooperative innovation center，Nanjing Forestry University Nanjing 210037;
2 ． College of Forestry，Central South University of Forestry ＆ Technology Changsha 410004;
3 ． The Key Laboratory of Forest Protection of China State Forestry Administration，Ｒesearch Institute of Forest Ecology，
Environment and Protection，Chinese Academy of Forestry Beijing 100091，China )
Abstract: 【Objective】Poplar canker is one of the major biological disasters of poplar plantations in China． The biological
control method for regulating poplar canker is sustained and effective． The aim of this study is to find and isolate antagonistic
microorganisms which have good bio-control effect on poplar canker from the poplar forest soil． 【Method】In this study，poplar
canker pathogen Botryosphaeria dothidia was used as the target strain，and the bio-control microorganisms in the soil were
isolated，screened and identified． The dilution plate coating method was used to separate soil microorganisms． Three procedures
were applied to screen the antagonistic microbes，including primary screening，fermentation liquor secondary screening and the
inhibitory action in vitro． The dual culture method was used in primary screening，the“sandwich method”and the“improved
agar diffusion method”were combined in fermentation liquor secondary screening，and the objective bio-control strain was used
ultimately to determine the control effect on poplar canker in vitro tissue． The bio-control strain was identified by combining
morphological observation and the the molecular biology method． 【Ｒesult】Totally 48 soil samples were collected in upper，
第 4 期 杨 蕾等: 土壤中杨树溃疡病生防菌的分离鉴定
middle and deeper soil layers of poplar forest in Langfang Hebei and Yuanyang Henan． A total of 259 strains were isolated in the
48 soil samples，including 122 bacteria strains，106 actinomycetes strains and 31 fungi strains． The microbial distribution pattern
overall followed as: top layer soil ＞ middle layer soil ＞ lower layer soil． There were 8 bacteria and actinomycetes strains，
screened in primary screening，which had antibiological average diameters ＞ 4 mm，and there were 8 fungi strains，selected by
dual culture，which had colony diameter ＞ 40 mm． Eight antagonistic microorganisms strains were selected by fermentation
medium secondary screening． They were bacteria strains of TYZ1B3 and YX5B1，and fungi strains of LS10F1，LX5F1，LZ10F1，
LS6F1，LX6F2 and TLZ2F2，respectively． Through determination of the control effect in vitro tissue，a bio-control fungus
strain，LX6F2，was obtained，and the control effect of the strain could be up to 76． 04% ． The LX6F2 feature，including the
colonies，hyphae and spores，was matched with Fusarium sp． by morphological observation． Through rDNA ITS sequence and
phylogenetic analysis，the LX6F2 sequence length was 563 bp，and the sequence registration number was FＲ872729． 1． There
was 100% similarity between LX6F2 rDNA ITS sequence and the Fusarium sp strain’s sequence which number is JN038467 in
GenBank． Based on these results，the strain LX6F2 was identified as Fusarium equiseti． 【Conclusion】The discovery of LX6F2
provides a new raw material for biological control of poplar canker． It’s important for sustainable control of poplar canker． In a
follow-up study its antibacterial mechanism，effective antagonist compositions，bacterium agent and so on will be investigated．
Key words: soil antagonistic microorganisms; poplar canker; Fusarium equiseti; antagonistic activity; bio-control strain
杨树溃疡病［有性型病原菌 ( Botryosphaeria
dothidia)，无性型聚生小穴壳菌(Dothiorella grearia)
是中国杨树(Populus)干部病害中的主要类型，在中
国华北、西北及南方杨树栽培区均有分布，在杨树幼
林上发生较多，危害严重，一般在感病品种上发病率
高达 80% ～ 100%，死亡率达 30% ～ 50% (向玉英
等，1996)。该病是中国杨树人工林重大生物灾害
之一，是一种寄主主导型病害，其发生与寄主的树势
强弱、健康状况密切相关，严重制约了杨树人工林的
发展(张星耀等，2003; 梁军等，2005; 焦一杰等，
2010)。研究表明，寄主体内微生物的种群和数量对
于病害的发生有着密切的关系，噬菌体 ( Phage)对
柑橘溃疡病(Xanthomonas ampestris)和柑橘细菌性
病害有良好的抑制作用 ( Balogh et al．，2008 )，
Anand 等用荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)
和化 学 杀 菌 剂 联 合 作 用 控 制 了 辣 椒 根 腐 病
(Colletotrichum apsici) 和粉霉病 ( Leveillula taurica)
的发生，任嘉红等(2010)发现吡咯伯克霍尔德氏菌
(Burkholderia pyrrocinia) JK-SH007 产生的抗菌蛋白
可很好地抑制杨树溃疡病菌的生长。杨树溃疡病有
多种类型，分别由葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)、疡
壳孢属(Dothichiza)、盾囊霉属(Coniothyrium)、腐皮
壳属 ( Valsa )、棒盘孢属 ( Coryneum )、从赤壳属
(Nectria)、茎点霉属 (Phoma)等真菌引起 (任飞娟
等，2011)，其中病原菌葡萄座腔菌的寄主种类最
多，分布地域最广，侵染能力最强，为害较为严重。
目前对杨树溃疡病的防治主要通过调整杨树林生态
系统空间结构及物理和化学方法完成 (洪少明，
2011)。但生态系统空间结构调控是一个相对较长
的过程而化学防治对于环境的污染和破坏已成为不
容忽视的问题。在人们愈来愈关注环境安全的情况
下，对杨树溃疡病的防治也提出了越来越高的安全
要求。随着社会经济的发展和人们环境保护意识的
增强以及生物防治技术的愈加成熟，用生物防治的
方法治理杨树溃疡病极有可能成为取代化学防治的
有效方法。本研究旨在筛选具有开发潜力的优良生
防菌株，为杨树溃疡病的生物防治奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 采样点基本情况
1. 1. 1 河北廊坊 造林地位于廊坊广阳区，为冲积
平原，气候条件基本一致，年均温度 11. 8 ℃，年均降
水量 593. 4 mm，年均日照时间 2 689 h，无霜期 183
天，海拔 10. 0 ～ 13. 8 m，地下水位 3 ～ 5 m。影响立
地条件的主要因子为土壤差异和水分供应情况。本
实验基地的杨树品种为欧美杨 107 杨 ( Populus ×
euramericana‘Neva’)(简称 107 杨)、欧美杨 108 杨
(P． × euramericana‘Guariento’)(简称 108 杨)和毛
白杨( P． tomentosa)，栽种模式为各无性系块状混
交，品种构成上 107 杨占 35%，108 杨占 31%，毛白
杨占 34%。株行距为(3 m × 4 m) × 6 m。平均树高
9. 82 m，胸径 10. 32 cm，冠幅 0. 87 m。
1. 1. 2 河南原阳 位于原阳县蒋庄乡靳屋村北，面
积约 53. 33 hm2，属黄河冲击平原，属暖温带大陆性
季风气候，年平均气温13. 4 ℃，年均湿度 68%，年平
均降雨 656. 3 mm，无霜期 220 天，全年日照时间约 2
400 h，土地肥沃、光热充沛，地下水源富足。本试验
基地 的 杨 树 品 种 为 中 林 46 ( P． × euramricana
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林 业 科 学 51 卷
‘Zhonglin46’)和毛白杨无性系块状混交，品种构成
上中林 46 占 43%，毛白杨占 57%。株行距为
(2. 5 m × 3 m ) × 4 m。平均树高 8. 63 m，胸径
9. 78 cm，冠幅 0. 77 m。
1. 2 试验材料
1. 2. 1 培养基 细菌分离选用 NA 培养基，配方
为:牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，蔗糖 10 g，琼脂 15 ～
20 g，H2O 1 000 mL，pH7. 2 ～ 7. 4; 放线菌的分离选
用高氏 1 号培养基，配方为:可溶性淀粉 20 g，氯化
钠 0. 5 g，硝酸钾 1 g，硫酸铁 0. 01 g，磷酸氢二钾
0. 5 g，水硫酸镁 0. 5 g，琼脂 20 g，水 1 000 mL，
pH7. 2 ～ 7. 4; 真菌分离培养采用 PDA 培养基，配方
为:去皮马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂15 ～ 20 g，
水1 000 mL，pH 值自然。
1. 2. 2 供试病原菌 葡萄座腔菌 ( Botryosphaeria
dothidica)由中国林业科学研究院森林保护实验室
菌种保藏中心提供，编号为 72②B。
1. 2. 3 杨树扦插苗 离体组织试验中选用的杨树
扦插苗为毛白杨当年生苗木。在温室内采用枝接顶
端封蜡的方法进行扦插，扦插时间为当年 3 月，使用
时间为当年 8 月。使用时苗高 90 ～ 120 cm，主干枝
条直径为 5 ～ 10 mm。扦插苗生长状况良好，无病
虫害。
1. 3 试验方法
1. 3. 1 土样采集 在廊坊和原阳县各选择 2 块样
地，在每个样地根据杨树树势生长情况、病虫害是否
发生以及土壤及林下植被情况选择采样点，其中廊
坊 11 个，原阳 5 个，共 16 个采样点。采土样时，按
照不同土层分别采集距杨树主干 20 cm 范围内的土
样，去除土壤表层杂物后，上层 ( S ) 土壤为 5 ～
15. 99 cm，中层 ( Z)为 16 ～ 25. 99 cm，下层 (X) 为
26 ～ 40 cm。采集采样点各层土壤 50 g，共 48 份，装
入塑封袋内。记录采集人姓名，采集时间，地点，立
地条件，海拔、地形、气候及植被、土壤类型、寄主及
其附近植物、种类及生长情况、发育阶段等。采集的
土壤置于 4 ℃冰箱内保存，并尽快分离。
1. 3. 2 土壤微生物的分离培养 采用稀释平板涂
布法分离土壤微生物。将 1 g 土壤置于装有 100 mL
无菌水的250 mL三角瓶中制成土壤悬浮液母液。
将母液置于 28 ℃摇床中震荡 1 h。无菌条件下对土
壤母液进行 10 倍梯度稀释，稀释倍数为 10 － 2 ～
10 － 7，细菌选用 10 － 5 ～ 10 － 7稀释梯度的土壤悬浊液
进行分离，放线菌选用 10 － 3 ～ 10 － 5稀释梯度的土壤
悬浊液进行分离，真菌选用 10 － 2 ～ 10 － 4稀释梯度的
土壤悬浊液进行分离。用无菌移液枪吸取 0. 1 mL
土壤悬浊液涂布于相应的平板培养基上，每个梯度
设 3 个重复，并将上述平板培养基放入培养箱中培
养。其中，细菌培养温度为 37 ℃，真菌和放线菌的
培养温度为 28 ℃。NA 平板培养 2 天后，高氏 1 号
和 PDA 平板培养 4 天后进行观察计数。根据菌株
的不同形态特征，将培养分离的不同种类微生物进
一步纯化，直至获得纯培养物。
1. 3. 3 拮抗微生物的初步筛选 选择杨树溃疡病
病原菌葡萄座腔菌为指示菌株，提前 7 天将病原菌
活化待用。拮抗能力的测定选择平板对峙法:1) 拮
抗细菌和放线菌:在 PDA 平板中央接入直径为
5 mm的已活化 5 天的病原菌菌块，然后在距培养皿
边缘 2 cm 的同心圆上每相距 120°的培养基上用接
种针接入分离的菌株，28 ℃下培养 3 天后，测得其
抑菌圈大小。每个菌株在一个培养皿内接 3 个点并
重复 3 次。2) 拮抗真菌:分别取 5 mm 的活化 5 天
后的病原菌与土壤真菌菌饼，接种于 PDA 平板培养
基中线距边缘 1 cm 处，每个土壤真菌重复 3 次，置
于 28 ℃下，黑暗恒温培养 3 天，每天记录相对横向
生长长度，并拍照。此方法中，病原菌和土壤真菌在
同一培养皿内生长，会竞争培养基中的营养、生存空
间等，即此方法主要判定土壤真菌对病原菌的竞争
作用强弱。在本文中将对峙试验中的竞争作用根据
郭润芳等(2002)的方法进行修正，按以下标准进行
等级分类:
Ⅰ:土壤真菌菌落直径占据平板 100% ;
Ⅱ:土壤真菌菌落直径占据平板 ＞ 2 /3;
Ⅲ:土壤真菌菌落直径占据平板 ＜ 2 /3 但 ＞ l /3;
Ⅳ:土壤真菌菌落直径占据平板 ＜ l /3;
Ⅴ:病原菌菌落直径占据平板 100%。
1. 3. 4 拮抗微生物的发酵液复筛 发酵培养液的
制备:将初筛的拮抗菌株分别在 NA 或 PDA 培养基上
活化。细菌用接菌环移取一环置入装有 100 mL NA
液 体 培 养 基 的 250 mL 三 角 瓶 中，在 35 ℃、
120 r·min － 1的摇床上振荡培养 48 h，拮抗放线菌和
真菌用打孔器取 4 mm 的菌饼，接入 PDA 培养基中，
28 ℃、140 r·min － 1的摇床上振荡培养 96 h。采用 2
种方法进行发酵液复筛，用“三明治法”来判定拮抗
菌株发酵液难挥发物质的拮抗活性强弱，用改良的
琼脂扩散法来衡量接抗菌易挥发扩散物质的抗菌物
质活性高低。经初筛选出的拮抗菌都需分别进行这
2 种方法的复筛。
1) 三明治法(邱思鑫，2004):在直径 9 cm 的
培养皿中倒入约 3 mL PDA 培养基，凝固后加入
1 mL分离菌株的培养液和 3 mL 冷却至 45 ℃左右
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第 4 期 杨 蕾等: 土壤中杨树溃疡病生防菌的分离鉴定
的 PDA 培养基，摇匀凝固后再加入约 15 mL PDA 培
养基(要求倒好的平板表面不长细菌)，以加 1 mL
无菌水和3 mL PDA 为对照，然后在平板上接入直径
为 5 mm 的病原菌菌饼，28 ℃黑暗培养 5 天后用十
字交叉法测量病菌菌落直径，计算抑制率。按以下
公式计算抑制率。选出抑菌效果最好的菌株，保存
备用。
抑菌率(% ) =对照菌落直径 －处理菌落直径
对照菌落直径
× 100%。
2) 改良的琼脂扩散法:在凝固的 PDA 琼脂
平板距边缘 1. 5 cm 处的圆周上等距离打 3 个
孔，孔洞直径为 4 mm; 将预先培养好的病原菌用
打孔器取4 mm的菌饼接在培养皿中央，再将液体
培养 4 天的拮抗菌的上清液 20 μL 滴加到各孔
中，28 ℃恒温培养，4 天后观察记录。以在孔洞
中加入 20 μL 无菌水作为对照。所有处理进行 3
次重复试验。
1. 3. 5 拮抗菌的离体复筛 1) 杨树溃疡病菌孢子
液的制备 杨树溃疡病菌在 PDA 平板上 28 ℃培
养，待充分产孢后，加无菌 1%葡萄糖溶液 10 mL 浸
15 min，用无菌的棉签洗下孢子和菌丝体，经无菌脱
脂棉过滤，除去菌丝体，再用无菌 1%葡萄糖溶液配
成悬浮液，将孢子含量调到10 × 10 倍视野含 80 ～
100 个孢子。
2) 拮抗菌发酵液的制备 用 250 mL 的三角瓶
装入 100 mL 培养液( pH7. 0)，细菌用 NA 培养基，
真菌和放线菌用 PDA 培养基; 灭菌冷却后，接种 10
mL 活化的拮抗菌菌液; 细菌 35 ℃120 r·min － 1振荡
培养 48 h，放线菌和真菌 28℃，140 r·min － 1振荡培
养 96 h。
3) 试验方法 选取生长一致的当年生杨树扦插
苗，截取约 7 cm 长的干部枝条放入直径为 9 cm 的
培养皿内，皿底铺上一层约 2 mm 厚的脱脂棉并加
入少量无菌水保湿培养。每个培养皿中放置 3 根枝
条，每个处理分别设 3 次重复，即每个生防菌株处理
9 根枝条。用已灭菌的接种针沾取拮抗菌发酵液在
枝条上进行刺伤接种，蘸取的发酵液量以不从接种
针上滴下为宜，刺伤接种的伤口大小约 1 mm。将蘸
有预先制好的病原菌孢子悬浮液的脱脂棉覆盖在刺
伤接种的伤口上，清水对照，28 ℃保湿培养，10 天后
待对照枝干充分发病后，进行病情调查并计算病情
指数和防治效果。室内离体组织试验病级分类按表
1 标准进行。
病情指数 = Σ (病级枝数 ×该病级代表数值)
调查枝数 ×发病最高一级代表值
×100。
防治效果(% ) =
对照组平均病情指数 －处理组平均病情指数
对照组平均病情指数
×100%。
综合初筛、复筛及离体复筛的结果，筛选出拮抗
效果强的菌株作为目的菌株进行下步试验。
表 1 室内接种病斑分级标准
Tab. 1 Disease gradings standards of indoor
inoculation experiment
病斑直径
Scab diameter /mm
分级
Grading
代表值
Central value
0 0 0
1. 00 ～ 5. 99 Ⅰ 1
6. 00 ～ 10. 99 Ⅱ 2
11. 00 ～ 15. 99 Ⅲ 3
16. 00 ～ 19. 99 Ⅳ 4
＞ 20. 00 Ⅴ 5
1. 3. 6 拮抗菌株的鉴定 1) 形态培养特征观察
使用 PDA 固体培养基和插片接种法接种，于 28 ℃
下培养，分别于 7，15，30 天后将盖玻片取出，在显微
镜下观察基内菌丝、气生菌丝形态以及孢子丝的形
态特征。
2) rDNA-ITS PCＲ 纯化扩增和序列测定 对拮
抗菌依据核糖体基因内转录间隔区( rDNA-ITS)序
列进行分子鉴定。以真菌 rDNA-ITS 序列的通用引
物 ITS1 ( 5 － TCCGTAGGTGAACCTGCGG － 3) 和
ITS4(5 － TCCTCCGCTTATTGATATGC － 3)对菌株
的基因组 DNA 进行 PCＲ 扩增。扩增体系: 2 × Pfu
PCＲ Mix 25 μL，上游引物(10 μ mol)2 μL，下游引
物(10 μ mol) 2 μL，基因组模板 1 μL，总体积为
50 μL; 扩增程序:95 ℃ 预变性 3 min，95 ℃ 变性
30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 60 s，共 35 个循环，
最后 72 ℃延伸 8 min。取 3 μL PCＲ 产物经过 1%
的琼脂糖凝胶电泳检测，以 DNA Marker DL2000 为
分子量标准，电泳结束后，拍照记录电泳结果。
序列经 BioEdit 等软件分析和手工校正后，用
NCBI 的 BLAST(2. 2. 12version)程序将测出的序列
与在 GenBank ( http:∥ www． ncbi． nlm． nih． gov /
BLAST)中已知菌种的 ITS 序列进行同源性比较分
析，从而确定菌株的分类地位。
2 结果与分析
2. 1 不同层次间土壤微生物的变化规律
根据培养特性和菌落特征判定，从上、中、下 3
层土壤中共分离得到菌株 259 株，其中细菌 122 株，
放线菌 106 株，真菌 31 株。各土层微生物种类分布
情况见表 2。细菌在分离出的菌株中占有优势，其
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林 业 科 学 51 卷
次是放线菌，而真菌的数量最少。这与土壤中微生
物的分布规律相符。在下层土壤中，3 类微生物的
数量差别不大。
2. 2 杨树溃疡病土壤拮抗菌的初筛
通过平板对峙试验，从 259 株菌中共分离得
到有抑菌效果的菌株 69 株，其中细菌和放线菌
36 株，真菌 33 株。各菌株拮抗作用或竞争作用
情况见表 3。从细菌和放线菌中筛选出抑菌带直
径 ＞ 4 mm 的菌株 8 株，真菌中生防菌菌落直径
＞ 40 mm 的菌株 8 株为后续研究对象。在细菌
和放线菌中，菌株 YX5B1 和 TLZ1A5 的抑菌直径
可达到 9 mm 以上; 在有效果的真菌中，大部分
的抗生等级处于Ⅲ或Ⅳ级，而菌株 LX6F2 的抑菌
等级为Ⅱ级。
表 2 杨树林土壤中微生物种类分布情况
Tab. 2 Distribution situation of microbial species in the poplar soil
土层
Soil layer
菌株数量 Number of microbial strains
细菌
Bacteria
放线菌
Actinomycetes
真菌
Fungi
合计
Total
上层 Top-level(5 ～ 0. 99 cm) 73 68 7 148
中层 Middle-level(16 ～ 25. 99 cm) 34 22 9 65
下层 Lower-level(26 ～ 40 cm) 15 16 15 46
合计 Total 122 106 31 259
表 3 溃疡病拮抗菌株平板对峙试验结果
Tab. 3 The antagonistic effect of antifungal strains to poplar canker in plate confrontation experiment
拮抗细菌和放线菌 Antagonistic bacteria and actinomycetes 拮抗真菌 Antagonistic fungi
编号
No．
抑菌带直径 Diameter of inhibition zone /mm
T1 T2 T3 AV
编号
No．
拮抗菌
菌落直径
Colony diameter
of antagonistic
fungi /mm
所占比例
Ｒatio(% )
竞争作
用等级
Grade
LZ8B2 5 4 4 4. 33 LS3F1 40 47. 01 Ⅲ
LS1A12 1 0 1 0. 67 LS10F1 46 54. 12 Ⅲ
LS7B1 1 1 1 1. 00 TLZ2F2 50 58. 82 Ⅲ
YS3A5 2 1 1 1. 33 LX5F1 50 58. 82 Ⅲ
LS3A2 3 3 2 2. 67 LZ8F1 35 41. 18 Ⅲ
TYZ1B3 4 5 5 4. 67 YS1F1 38. 5 45. 29 Ⅲ
LS9A3 2 1 0 1. 00 YS1F2 36 42. 35 Ⅲ
LS9A2 3 2 1 2. 00 YS3F1 27 31. 76 Ⅳ
YS3B4 1 1 2 1. 33 LX6F1 37 43. 53 Ⅲ
LS1A4 1 1 1 1. 00 LX6F2 58. 5 68. 82 Ⅱ
LS9A1 2 2 2 2. 00 YSF7 22 25. 88 Ⅳ
LS8B3 4 2 3 3. 00 LZ8F2 16 18. 82 Ⅳ
YS3A5 1 2 1 1. 33 LZ10F1 50 58. 82 Ⅲ
LS4A7 5 6 6 5. 67 LX2F1 37 43. 53 Ⅲ
YS3A15 1 1 0 0. 67 LX9F1 35 41. 18 Ⅲ
LZ8B3 2 1 2 1. 67 YX2F1 13 15. 29 Ⅳ
LS1A5 1 0 0 0. 33 YX3F1 26 30. 59 Ⅳ
LS8B8 3 4 3 3. 33 YZ3F1 21 24. 71 Ⅳ
LX10A6 1 1 0. 5 0. 83 TYZIFI 22 25. 88 Ⅳ
YS3A3 2 3 3 2. 67 LX10F1 32 37. 64 Ⅲ
YX5A1 4 5 4 4. 33 TYZ1F2 22 25. 88 Ⅳ
LZ8B2 8 6 7 7. 00 TYZ2F1 23 27. 06 Ⅳ
YX5B1 9. 5 9 8. 67 9. 06 LX11F2 32 37. 64 Ⅲ
TYZ2A3 3 1 1 1. 67 LX11F1 28 32. 94 Ⅲ
TLZ1A2 5 2 2 3. 00 LX7F1 30 35. 29 Ⅲ
LZ7B3 1 1 1 1. 00 LX1F2 55 64. 71 Ⅲ
LZ3B1 5. 67 5 5 5. 22 YSF5 31 26. 47 Ⅲ
LS8B2 5 4 4 4. 33 YZ2F13 34. 5 40. 59 Ⅲ
LS3A3 2 1 2 1. 67 YZ4F1 14 16. 47 Ⅳ
LS11A1 1 1 1 1. 00 LX8F1 17 20. 00 Ⅳ
LS1A19 4 2 2 2. 67 YX1F1 15 17. 65 Ⅳ
LS11A5 2 3 3 2. 67 LS6F1 40 47. 06 Ⅲ
LS11B6 5 5 4 4. 67 LS1F7 34 40. 00 Ⅲ
LS7A7 2 1 0 1. 00 － － － －
TLZ1A5 10 8 10 9. 33 － － － －
LS2A8 2 1 2 1. 67 － － － －
021
第 4 期 杨 蕾等: 土壤中杨树溃疡病生防菌的分离鉴定
图 1 拮抗菌株对葡萄座腔菌的平板对峙效果
Fig． 1 Antagonistic effect of antifungal strains to Botryosphaeria dothidea in plate confrontation experiment
A:细菌 YX5B1 Bacteria strain YX5B1;B:细菌 LZ8B2 Bacteria strain LZ8B2;
C:真菌 TLZ2F2 Fungus strain TLZ2F2;D 真菌 LX5F1 Fungus strain LX5F1
2. 3 拮抗菌株发酵液复筛
2. 3. 1 三明治法测发酵液抑菌活性 通过三明治
法的筛选结果可知，初筛出的 16 株菌株，除 LZ8F9，
LX6F1，LX1F2 外，其余各株的抑菌率均可达 60%以
上。在三明治法测定中，病原菌和拮抗菌只隔着一
层约 0. 5 mm 厚的培养基，减小了拮抗菌分泌物扩
散能力对拮抗作用的影响，使得接种后拮抗菌与病
原菌间可以很快形成强作用的营养竞争和相互作
用，同时避免了对峙试验中的物理障碍问题。在本
次试验中，用此方法各拮抗菌株均表现出较好的防
治效果，可能是因为加入的发酵液为1 mL，抑菌活
性物质含量较高，抑菌效果明显。
2. 3. 2 改良琼脂扩散法测发酵液抑菌活性 在改
良琼脂扩散法中，筛选出拮抗菌菌落直径 ＞ 38 mm
的菌株为后续研究对象。
综合三明治法和改良琼脂扩散法的结果，筛选
出的拮抗菌株有 8 株，分别为细菌 TYZ1B3 和
YX5B1，真菌 LS10F1，LX5F1，LZ10F1，LS6F1 中，
LX6F2 和 TLZ2F2。
表 4 拮抗菌株发酵液三明治法复筛结果
Tab. 4 Ｒesults of biocontrol strains fermented
liquid rescreening by sandwich method
编号
No．
病原菌菌落直径
Colony diameter of
pathogenic fungi /mm
T1 T2 T3 AV
抑菌率
Inhibitory
rate(% )
TLZ2F2 6 5 7 6 92. 94
LX6F2 7 8 7 7. 33 91. 38
TYZ1B3 0 0 0 0 100
LS11B6 14 12 12 12. 67 85. 06
LS6F1 10 9 11 10 82. 35
LZ3B1 0 0 0 0 100
LZ8B2 31 27 30 29. 33 65. 49
LS8B2 7 8 7 7. 33 91. 38
YX5B1 8 9 8 8. 67 88. 51
LZ10F1 27 24 20 23. 67 72. 15
LS4A7 50 52 50 51. 00 40. 00
LX1F2 44 50 55 50. 00 41. 18
LS10F1 14 15 14 14. 33 81. 96
LS3F1 28 32 35 31. 67 62. 73
LX5F1 14 12 12 12. 67 85. 06
TLZ1A5 12 10 11 11. 00 87. 06
121
林 业 科 学 51 卷
图 2 拮抗菌 LX6F2 发酵液三明治法复筛效果
Fig. 2 Effect of biocontrol strain LX6F2 fermented liquid
rescreening by sandwich method
表 5 拮抗菌株发酵液改良琼脂扩散法复筛结果
Tab. 5 Ｒesults of biocontrol strains fermented liquid
rescreening by Improved agar diffusion method
编号
No．
拮抗菌菌落直径
Colony diameter of
antagonistic strains /mm
抑菌率
Inhibitory rate(% )
LS3F1 37. 92 44. 61
LS10F1 48. 67 57. 26
LX5F1 47. 25 55. 59
LX1F2 35. 00 41. 18
LZ10F1 43. 42 51. 08
LX1F2 4. 00 4. 71
LS6F1 41. 17 48. 44
LX6F2 48. 83 57. 45
TLZ2F2 39. 00 45. 88
TYZ1B3 53. 10 62. 47
LS11B6 35. 83 42. 15
LZ8B2 37. 50 44. 12
LS8B2 36. 10 42. 47
YX5B1 39. 00 45. 88
LZ3B1 21. 50 25. 29
LS4A7 4. 83 5. 68
TLZ1A5 4. 00 4. 71
图 3 拮抗菌株发酵液改良琼脂扩散法复筛效果
Fig. 3 Effect of biocontrol strain LX6F2 fermented
liquid rescreening by Improved agar diffusion method
2. 4 组织离体生防菌株复筛结果
在筛选出的 8 株拮抗菌中，各株在离体组织上
表现出的拮抗活性各不相同，其中菌株 LX6F2 的
防治效果最好，可达 76. 04%。经 SPSS 软件对不
同菌株的防治效果进行单因素方差分析显示，不
同菌株对杨树组织溃疡病的防治效果差异非常显
著(P ＜ 0. 01)。衡量生防菌株是否优良的一个最
重要的标准就是在实际应用中防治效果能否保持
稳定高效。通过组织离体试验筛选出的菌株虽然
和大田或是林间的实际应用情况有差别，但这是
林间试验的基础，在很大程度上可以预示生物防
治的效果。
通过离体组织试验，从 8 株对杨树溃疡病有良
好防治效果的拮抗菌株筛选到 1 株生防菌株
LX6F2，该菌株在离体组织上表现出的对溃疡病的
生防效果显示了其抑菌活性良好的适用性和稳定
性，这对于对后续开发利用至关重要。
表 6 生防菌株离体组织防效测定
Tab. 6 Determination of control effect of biocontrol
strains to poplar canker in vitro tissue
菌株
Strain
平均病斑直径
Scab
diameter /mm
等级
Grade
病情指数
Disease
index
防治效果
Control
effect(% )
TYZ1B3 10. 23 Ⅱ 35. 68 61. 52c
YX5B1 16. 05 Ⅳ 67. 52 27. 19f
LS10F1 7. 58 Ⅲ 31. 67 65. 95b
LX5F1 9. 46 Ⅱ 35. 44 61. 77c
LZ10F1 11. 24 Ⅲ 40. 39 56. 44d
LS6F1 15. 27 Ⅲ 62. 17 32. 96e
LX6F2 4. 73 Ⅰ 22. 22 76. 04a
TLZ2F2 10. 54 Ⅲ 36. 67 60. 46c
CK 21. 34 V 92. 73 —
图 4 生防菌株 LX6F2 的形态特征
Fig. 4 Morphological characteristics of the bio-control strain LX6F2
(A．菌落 Colony; B．菌丝 Hypha; C．分生孢子 Conidium)
2. 5 生防菌株 LX6F2 的鉴定
2. 5. 1 形态学特征 在 PDA 培养基上，LX6F2 菌株
菌落呈圆形或椭圆形，气生菌丝初期为白色，绒毛絮
状，质地较为疏松，和培养基结合不是很紧密，易挑取
(图 4A)，生长率为 6. 89 mm·d － 1，培养后期表面具有
浅橙黄色孢子堆。菌丝有隔，少分支(图 4B)。分生
孢子梗分枝或在菌丝上直接形成产孢细胞，小型分生
孢子极少。大型分生孢子略弯，顶细胞延长成钩状，
多为 3 ～ 6 个分隔，大小约为(21. 57 ～ 44. 62) μm ×
(3. 21 ～ 5. 04) μm，但孢子堆内的大型分生孢子多为
5 ～ 7 个分隔，大小为(52. 38 ～ 62. 15) μm × (3. 85 ～
5. 43) μm(图 4C)。
221
第 4 期 杨 蕾等: 土壤中杨树溃疡病生防菌的分离鉴定
图 5 真菌通用引物 ITS1 / ITS4 PCＲ
扩增生防菌株 LX6F2 凝胶电泳图像
Fig． 5 Gel electrophoresis of fungi of ITS1 / ITS4 PCＲ
amplification by universal primers
2. 5. 2 分子生物学分类地位 对生防菌株 LX6F2
的 ITS 基因序列进行 PCＲ 扩增，产物纯化后测序
(图 5 )。测得生防菌株 LX6F2 的序列长度为
563 bp，序列登录号为 FＲ872729. 1。将所测得的
ITS 序列与 GenBank 中的已知序列进行比，分别调
出与 LX6F2 菌株相近种模式菌株的 ITS 序列，经
Clustal W进行多重对比发现 LX6F2 菌株与编号为
JN038467 的木贼镰刀菌相似度高达 100% (图 6)。
综合菌株的培养和形态学特征，确定生防菌株
LX6F2 为木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)。
图 6 菌株 LX6F2 与相关模式菌株的系统发育树
Fig. 6 The phylogenetic tree of relationship between strain LX6F2 and related strains
3 结论与讨论
本研究主要取得了以下结论:1)从杨树林土壤
中分离得到的 259 株土壤微生物中经初筛、复筛及
离体组织筛选，挑选出一株编号为 LX6F2 的优良生
321
林 业 科 学 51 卷
防菌株; 2)经形态学观察和分子生物学鉴定，确定
为木贼镰刀菌; 3)经试验验证，该菌株对杨树溃疡
病病原菌葡萄座腔菌表现出良好的抗生效果，对杨
树离体组织溃疡病的防治效果可达 76. 04%。该菌
株的发现和研究为杨树溃疡病的生物防治提供新的
原材料，对杨树溃疡病的可持续控制具有重要意义。
3. 1 土壤拮抗菌的筛选方法
土壤是微生物的大本营，由于土壤的温度、pH
值、养分及其他理化性质等条件都非常适合微生物
的生长繁殖 ( Brookes et al．，1985; Powlsond et al．，
1987)，因此，在这一环境下微生物多样性丰富、数
量巨大(牛红榜等，2007)。要从土壤中分离筛选出
专一性强的生防菌就必须有一套方便、准确、快捷的
方法。本试验中选用的筛选方法是以拮抗菌株能快
速生长，更好地占据生长空间、竞争营养为先决条
件，但这样做可能使一些生长速度慢而能产生强的
抑菌作用代谢产物的菌株在初筛时就被淘汰。筛选
功能微生物的方法很多，要根据每项研究的实际情
况和需求来选择最适宜的方法。
3. 2 木贼镰刀菌
目前的研究结果表明，一些镰刀菌可作为防治
病虫害的优良资源。很多镰刀菌可以使昆虫染病，
如嗜蚧镰孢(Fusarium coccophilum)，在自然条件下
可以控制害虫虫口密度。陕西省农科院的苑森行等
(1986)对虫生真菌木贼镰刀菌进行了初步研究，发
现它对菜青虫(Pieris rapae)有很好的防治效果等。
镰刀菌在植物线虫防治方面也具有重要意义，镰刀
菌菌株 Snef332 杀线能力遗传稳定性较很高，在南
方根结线虫(Meloidogyne incongnita)生防领域具有
较大潜力，适宜作为南方根结线虫的生防因子加以
开发利用(段玉玺等，2010)。此外非致病性镰刀菌
还可以用来防治镰刀菌病害，如生防镰刀菌可以减
轻列当(Orobance sp． )对烟草(Nicotiana tabacum)的
危害(吴元华等，2011)。从 2000 年开始，杨涛等即
采用紫外线诱变的方法获得黄瓜(Cucumis sativus)
和甜瓜(Cucumis melo) 的非致病性镰刀菌，并对其
生防潜力进行了初步研究(杨涛等，2011)。有的镰
刀菌在自然界中分解利用各种物质，参与物质循环，
对环境保护起着不可忽视的作用。
在本研究中，笔者从杨树林土壤中分离到了一
株生防菌，经鉴定它是一株木贼镰刀菌，经试验验
证，该菌对溃疡病菌葡萄座腔菌有良好的拮抗抑制
作用。笔者已经得到了该优良的生防菌株资源，但
目前对它的生防机理和应用等却鲜有报道，因此在
后续研究中需要对其抑菌机制、有效拮抗成分及毒
素等进行细致研究。作为 1 株镰刀菌，在应用中要
趋利避害，找到适宜的开发途径和方法，实现其有利
价值的最大化，在尽量发挥其生物防治作用的同时
避免对其他作物及人畜造成伤害。
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(责任编辑 王艳娜)
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