全 文 ：第 3 卷 弟 4 期
1 9 9 0 午 8 月
林 业 科 学 研 究
I犷O R E S f R E S E A R C H
V o l
.
3
A u g
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N o
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4
1 9 9 0
外生菌根真菌 厚环乳牛肝菌
发 酵 条 件 的研 究 *
王学聆 赵志鹏 郭秀珍
(
‘尸国林业 科学研究院林业研 究所)
摘要 本 文对外生菌根真菌一一 厚环礼牛杆蔺 (Su illu s g l e v ill。i (K I. ) S in g . )
80 01 菌抹的发 酵条件选行 了研 究。 其 中培养基初始 p H 以 4 . 5一 5 . 6 为宜 , 装液量选
为 15 0 m l/ 5 0 0 m l三 角瓶 , 该菌株不需要特珠的碳源和 氮源 。 14 L 发酵罐 液体深层
发酵 结果表明 , 8 0 0 1菌林具有发酵周期短、 生长迅速 、 易于工业化生 产等特点 。 本
研完为外生菌根菌剂 的大规模工业化生产提供 了理论依据 。
关锐词 外生菌根 ; 厚环礼牛肝菌 , 发酵条件
外生菌根是高等真菌同某些植物的根系形成的一种相互有益 的共生联合体。 它可使植物
获得更多的矿物质养分 , 特别是促进对难溶磷的吸收 , 并具有一定的抗病和抗逆性功能 。 目
前在外生菌根的应用研究中 , 美国已采用液体发酵技术生产出数种外生菌根菌剂 , 在林业上
应用的效果较为理想 L‘l。 我国这方面的研究开展得较少 , 童竞新等曾采用液体通气方法扩大
培养彩色豆马勃 , 用于接种国外松 , 取得了较好 的效果山 。
本实验在一系列筛选 的基础上 , 选择了一株对寄主植物 既有生长促进作用 , 又有抗病效
应的8。。1菌株 13 ’‘〕, 对其进行了发酵条件的研究 , 目的在于采用液体深层发酵生物 技术 , 为
外生菌根菌剂 的大批量工业化生产提供依据 。
一 、 材料与方法
(一 ) 实验菌株与培养墓
1
. 菌株 厚环乳牛肝菌 (5 0 111: 5 g r 。。ille i (K I。 ) S in g . ) , 系从北京地区 3 0年生油松林
内采集分离 I‘l。
2
. 培养墓 实验采川 PD A 培 养 l去和改良 M M N 培养基 I‘] 。
(二 ) 摇瓶发酵条件试验
采用 50 m l三角瓶盛一定量 的改 良 MM N 培养纂 , 在 T Z一 2 型台式往复旋转振 荡器上
振荡培养 , 振幅 2 一 3 c m , 领率 13 0 次 / m in , 培养温度25 土 1 cC , 接种量为每瓶 接种直径
}
、 文 于工3 8 9年1 2 月2 2 日 收到 ,
水卞研 兄力 国家 “ 七五 ” ‘几点科技攻关项 门生初技术专题 (7 马一了1 一O了一 。了)山 部分 工仆。 中国 林科院分 析中 心 和林研 所 场
七;莹先生分 析样品 , 热 茹珍同 志多加 扭;分工 作 . 特此致谕。
4 期 王学聘等 : 外生菌根真菌一一厚环乳牛肝菌发酵条件的研究 3 1 1
为 8 m m 的菌丝块 3 块 。 每个处理重复 3 次 , 培养周期为 5 天 。
(三 ) 发酵罐液体深层发酵川
采用 日本 L . E 。MA R U B IS H I C。。 Ltd . 生产的 MJ一摊议L 发酵装置 , 使用改良MM N
培养基 , 进行二级发酵 。 接种量为 4 % , 搅拌速度为1 5 0 印m , 培养温度为 25 士 1 ℃ , 通风
量为 S L / m in 。
(四 ) 菌丝体生物量浦定
取 10 m l发酵液 , 经抽滤 , 烘恒重 (1 0 5 ℃ , 6 h )用下列公式计算生物量 : 菌丝干 物重
(g )八 0 0 m l发酵液 。 ,
(五) 发酵液中全氮及有机碳的浏定
经一定时间培养后 , 取一定量 的发酵液 , 6 0 0 0 印m 离心20 m in , 取上清液作为样品。 全
氮测定采用凯氏定氮法 , 使用瑞士 B 位C H I一3 2 全自动定氮仪 。 有机碳测定采用重 铬酸钾法 。
(六) 发酵液中糖及氨墓酸的测定
在发酵 1 8 、 4 2 、 6 6 h 后 , 分别从发酵罐中取样 , 经 5 0 0 0 r p m 离 心后 , 用 W at e rs 2 4 4
H PL C 高压液相色谱仪进行测定。
1
. 糖的刚 定 色谱条件为 : 柱 : S u ga r p ar k 一 i , 流动相 : H : O , 流速 : 0 . 7 m l/ m i巧
检测器 : R Z : 4 X , 柱温 : 90 ℃ 。
2
. 氛基酸的刚 定 色谱条件为 : 柱 : 协一B o n da Pa R c p n e n yl , 流动相 : 35 % CH : OH ,
流速 : 1 . 2 m l/ m in , 检测器 : U V Zs o nm x o
.
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。
二 、 结 果
口R6月,on0八UluJ。之忽
(一 ) 培养初始 pH
由图 1 可见 , 8 0 0 1菌株的培 养基 最 适
班 (灭菌前 )在4 。 5一 5 。 6 之间 , 其生物量 可
达0 。8 9八 0 0 m l以上 。
(二) 振荡与静止培养
由表 1 可知 , 振荡培养的生物量明显高
于静止培养 , 说明振荡培养更有利于菌丝体
的生长 。
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.
0 月。0 4 . 5 5 . 2 5 . 6 6 . 0 7 . 。
图 1 培养基 p H 对菌丝体生物量的影响
喇孚州
团日目叼曰
习烈川口叼留冈日目川表 1 培养方式对菌丝体生物盘的影晌
O
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4
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3
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培 养 方 式 生 物量 ( g / 1 0 0 m l)
炯泽州
振荡墙养
静止培养 :
.
:
0
。
2
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。
1一
(三 ) 不同装液量试验
从图 2 得知 , 随着装液量 由 75 m l增加
到20 0 m l, 8 0 0 1菌株的最终生物量无明显变
75 1 0 0 1 2 5 ! 5 0 17 5 公0 0
已o om l三角瓶的装液量 ( n l l)
图 2 装液量 对菌丝体生物量的影晌
3 1 2 林 业 科 学 研 究 3 卷
化 , 装液量达巧O m l时 , 其生物量最大 , 为
0
.
3 8 9八 0 0 m l。 因 此 , 5 0 0 m l三角瓶装液
量以 15 0 m l为宜 。
(四 ) 碳派试验
在 5 0 0 m l三 角瓶中盛 15 0 m l MM N蛋培
养液 , 并分别加入12 种碳源 。 从表 2 可知 ,
其生物量均比对照有所增加 , 其中甘露糖 、
木糖、 半乳糖 、玉米浆、 阿拉伯搪和葡萄搪的
生物量高出对照 10 倍以上 , 淀粉高出 8 倍 。
(五 ) 氮洲试验
从表 3 可见 , 无机氮源中氨态氮比硝态
氮效果明显 , 其中硫酸按的生物量比对照高
出 3 倍 , 有机氮生物量均比对照高 , 其中酵
母粉、 干酪素和醉母浸膏高出18 倍以上。
(六 ) 1 4 L 发醉 . 发醉试验
发酵过程中 p H 呈下降趋 势 , 最 终 pH
4
.
0 左右 。 培养基中全氮、 有机碳含量的 变
化呈下降趋势 。 生物量在发酵第 4 天达到高
峰 (图 3 ) 。 但所测的生物量比实际菌丝体生
物量低 , 因为在发酵过程中 , 发酵罐挡板与
罐壁之间截留了相当一部份菌丝体 , 而未能
进行测定 。
表 2 碳源对生物 , 的形晌
(单位 : g 八 0 0 m l)
,匕 物 生 物 盈
葡 萄 搪
阿拉伯糖
甘 露 惦
木 糖
半 乳 糖
蔗 衡
麦 芽 箱
表 3 氮派对生物 , 的影晌
(单 位 : g / 10 0 m l)
盆 源
N H
一
N O 3
N H 一C l
(N H 一) 2 5 0 -
K N O 3
N a N O 3
C a (N O : ) :
对 照
尘 钓 证 源 } 生 物 盈
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0 3 0
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.
0 16
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0 5 2
0
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0 0 2
牛 肉 青
蛋 自 肋二
千 丙齐 舅矛
醉母汉资
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母 粉
0
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1 95
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1 1 4
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(七 ) 发醉液中粉与奴甚酸的组成
从所测定的糖的变化来看 , 发酵过程中
蔗糖消耗较多 , 发酵末期略微回升。 其它 3
种糖在发酵18 h 后都有所下降 , 在发酵末期
均略有回升 (表 4 ) 。
裹 4 发醉液中粉的变化
(单位 : m g / 10 0 m l)
发醉时间
葡萄搪 锗 总 掂一“10邪86三一42175枪一2746089.5果6245
口日。t、兽喊令
蔗 糖
一 全纸 一试一 . p 卜君一 有机碳芭 丝重 !国 3 发醉 过程呼, p ll、 全泥 、 ·f了机碳 、
菌丝体生物盆 的变化
;:
5 1
.
6 6
1 7
.
4 8
2
.
3 3 9
1 3
.
9 9
1 5 96 0 0
7 5 5
.
4 4
1 3 9 1
.
4 9
1 3 92
.
22
1 7 59
.
9 5
8 12
.
7 6
1 4 87
.
6 3
1 51 1
.
7 6
在发酵过程中 , 发酵液氨墓酸总量呈下降趋势 (表 5 ) , 其中丝氨酸、 甘氨酸、 撷氨酸 、
蛋氨酸 、 亮氨酸 、 酪氨酸 、 苯丙氨酸 、 组氨酸、 精氨酸均呈下降趋势 , 而丙氨酸和色氨酸则
略有增加。
4 期 王学聘等 : 外生菌根真菌—厚环乳牛肝菌发酵条件的研究 3 1 3
表 5 发 醉 液 中 氮 基 酸 的 变 化 (单位 : m g / 1 0 0 m l)
总计色氨酸⋯一1川-l甘|刻51刁精氨酸赖氨欲组氨酸氨异酸亮 氨苯酸丙蛋氨酸领氨酸丙氨酸甘氨酸谷氨丝 酸氨酸苏氨酸发时酥 间( h ) 氨天门酸冬
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l
。 通过对外生菌根真菌 8 0 0 1菌株发酵条件的研究得知 , 它具有生长周期短 , 生长旺盛 ,
发酵工艺易于控制 , 无需特殊的碳 、 氮源等诸多优点。 该菌株进行工业化生产是可行的 , 但
需进行降低制剂生产成本的研究 。
2
. 采用1 4 L 发酵罐进行菌根真菌液体深层发酵条件的研究表明 , 随着培养基全氮 、有机
碳在发酵过程中的消耗 , 培养基 p H 下降而生物量呈上升趋势 , 这一结果与真菌的生理代谢
规律相一致。 至于发酵过程中氨基酸和糖的变化与真菌生长代谢的关系有待进一步研究 。
参 考 文 献
仁1 〕 郭秀珍等 , 1 9 89 , 林木菌根及应用 技术 , 中国林业出版社 , 7 。
〔2 〕童竞新等 , 1 983 , 纯培养彩色豆马勃菌丝体接种国外松研究初报 , 林业科学 , 19 ( 3 ) : 3 32 。
〔3 〕 郭秀珍等 , 19 81 , 松树某些外生菌根真菌对防治油松碎 倒病的作用 , 云南植物研究 , 3 ( 3) : 3 59 ~ 36 6 。
〔魂〕 Z h a o , Z , P . e t a l . , 1 0 5 8 , P r e lim in a r y s e le e t i o n o f e e t o m y e o r r h i z a l fu n g i w it h r e s i st a n e e t o
R hi 之o c t o n i a so la 月f, P r o e e e d i n g s o f Se e o n d E u r o Pe a n S y m p o s i u m o n M v e o rr h i Z a e
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