全 文 ：林 业科学 研究
 
,










户,讲“








用


 技术测定黑荆树种源遗传关系初报 ’
黄少甫 李桂英 赵治芬 陆 军
关锐词 黑荆树 系统树

 技术
黑荆树








 ,








系含羞草科





 
金合欢属






植物 , 是一多
用途 、速生树种 。 我国引种时间较短 , 种源混杂 , 但黑荆树象其它树种一样 , 表型的变化受环境
影响极大 , 种内各品种之间的差异很小很难用常规的方法加以识别和划分
’〕。 而应用
 !
技术可以快速 、简便 、灵敏地检测


的多态性 , 将品种间的差异显著地反映出来 。 这已在医
学上 、农业上得到广泛的应用
 ’〕。

 在林业上也已有应用 , 例如 , 苏晓华
’用

技术
估测了柳树种及无性系的变异
李宽饪”利用


分子标记对 白杨派 , 青杨派之间的系统进
化
毛白杨的起源 , 青杨

多态性及遗传分化等问题作了系统的研究 。
本实验对
个种源的黑荆树进行了

 分析 , 旨在探索各种源之间的亲缘关系, 为黑
荆树的分类和系统学研究积累资料 。

材料和方法



材料
实验所用黑荆树种源见表
, 采 自福建岩溪林场引种试验点 。
表
黑荆树种源原产地地理位

编号 代号 原 产 地 经度
。 ‘

海拔


一




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一

收搞

黄少甫副研究员
李桂英 、赵治芬
中国林业科学 研究院亚热带林业研究所 浙江富阳


。

陆军
中国 水稻研究
, 本研究为中国林业科学 研究院
  基金项目“林木抗性遗传机理研究”的内容 。

 李宽饪
杨树
 多态性及遗传分化研究
南京林业大学博士学位论文 ,
”



期 黄少甫等
用
 ! 技术测定黑荆树种源遗传关系初报



方法






提取
 ‘〕 剪取嫩叶
一

, 加液氮于研钵中磨碎 , 倒入
 一

预热


的盛有

 沙 抽提液的离心 管中
抽提液










,



一








一







,








,





,


, 临用时加琉基乙醇至
纬

加入等体积氯仿
异戊醇



 抽提 , 摇

 ,
  印m 离心 20 m in , 吸取上清液 , 再加等体积氯仿异戊醇
(24 : l) 抽提 , 同样离心 , 吸取上清液 ;将上述上清液与 2/3 体积的异丙醇混 匀 , 室温 30 m in ,
4 0 0 0 rP m 离心 20 ~ 30 m in , 倒去上清液 , 倒置离心管晾干沉淀 ;加入 50 。川J ‘r E 溶液 , 溶解沉
淀 , 转 入 1. 5 m L 的 E ppendor f 管中 , 加 入 4 5 拼L 3 m ol / L 醋酸 钠 , 1 m L 无水 乙 醇混 匀 ,
一 20 C 放置 Z h ;用玻棒钩将沉淀的 D N A 钩出 , 用 70 % 乙醉轻微冲洗 .于室温将 D N A 晾干 ;
将钩尖上晾干的 D N A 溶于 50 0 “L ‘r E 溶液中 , 4 C 或一 Zo C 保存 。
实验所用引物购自加 拿大 B ritish一 C o l u m b i a 大学 (B C U ) , 见表 2 。
表 2 R A PD 分析所用引物
编号 代号 序 列 编号 代号 序 4lJ
1 406 G C C A C C I、 C C ‘I 、 1 2 4 3 3 T C A C ( ; 1 、 G C C T
2 4 0 7 T G ( ;
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f C C T G ( ; C 1 3 4 3 9 ( ; C C C 〔” r ‘r ( 宝A C
3 4 l l G A G G C C C (; ’I 一 T 1 4 4 3 〔) A (分T (、〔;(二(飞A C C
4 4 12 T G C G C C G (;T G 1 5 4 4 6 (马C C A ( 奋C G T ’ l 、C
5 4 1 5 G I
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6 4 1 7 G A C A G ( ; C C A A 1 7 4 9 9 G ( ; C C G I
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1 】 4 3 2 A G C G I 、 C ( 二A 〔、 ’r 2 2 9 1 ( ; ( 二( ;’ 1 , ( ; ‘; ‘I ~ I ’ ( ; ( 、
1
.
2
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2 R A I
)
I ) 程序 将提 出的 I)N A 用水稀释至 10 n g/拼IJ , 取 3 拼l矛 作 R A I, I ) 分析 , R A I , I )
反应在 25 拼IJ 的反应液 中进行 , 其 中含 10 n、m o l / L T r is 一 H e l ( p H s . 3 ) , s o n 、n 飞0 1八J K e l, 2 . 5
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0 0 1 乡6明胶 , 0 . 1 % 的 l’ r i t o n , d A ‘I ’ I 〕 、d G 飞’ I 〕 、( l ‘F ‘I ’ l 〕 和 dC ‘I ’ I ) 各0.Z n 、n 、0 1八一 ,
引物浓度 0.36 “n lo l/ IJ , 1 个单位 T a(l 聚合酶 , 反应前加 40 川J 石蜡油粗盖 。
扩增反应在温度循环仪上进行 。 循环条件 93 e 一m in , 3 6 C 2 m i n , 7 2 ( · I n 、i :、 , 共 45个
循环 , 最后在 72 C 维持 8 m in , 取 5~ 15 川J产物在 1. 2 % 的琼脂糖凝胶中电泳 。 经浪化乙锭染
色后紫外灯观察拍照 。
1
.
2
.
3 数据分析 按 N ei的方法计算种源间共有片段 比例及遗传距离 , 按其介绍的平均距离
法 (V pG M A )编制计算机程序(BA Sl c )进行聚类分析 , 统计中每条带作为一个单位处理 , 仅考
虑 多态性带川 。
2 结果与讨论
实验共做了 2 个随机引物 , 1 份材料间多态性片段有 42 条 。 扩增产物经琼脂糖凝胶电
泳能分辨出清晰的 D N A 条带 , 不同的引物扩增的带数不同 , 范围大致在 1一 7 条之间 。 引物
“ 1 7 ”扩增 的产物在 1 个种源 中有 7 条 D N A 带 (图 lb ) , 而 引物 “ 4 28 ” 只扩增出 1 条带 (图
林 业 科 学 研 究 10 卷
la ) 。 作者用该引物扩增水稻(釉稻 )基因组 D N A 时 , 产物则有 7 条带之多 , 可见水稻和黑荆树
基因组差别很大 。 在黑荆树中引物 “ 42 8 ”的结合位点很少 , 或者由于扩增的片段为一重复序列
的一部分 , 导致扩增产物分子量大小一致 , 而表现为一条很浓的 D N A 带 。
图 l 黑荆树 O N A 随机引物扩增 产物电泳图谱
(l一 11 , 黑荆树不同种源 , 1 2 为分子量标记 Ikb ladder 。 . 引物 428 ; b. 引物 17)
1 个种源间共有片段的比值见表 3 。 按 N ei 的方法编制计算机程序进行聚类分析 , 获得
1 个种源的亲缘关系系统树(图 2) , 从图中可以清楚地看出 , 1 个种源分为两大群 , 1 号种源
丧 3 种源间共有片段比值
种源号 1 2 3 魂 ’ 5 6 7 5 9 1 0
2 0
.
5 7 8 9
3 0
.
6 1 5 4 0
.
5 7 7 8
4 0 . 5 0 0 0 0
. 6 1 5 4 0
.
7 6 1 9
5 0
.
3 8 8 9 0
.
6 6 6 7 0 5 2 3 8 0
.
5 4 0 5
6 0
.
4 8 4 8 0
.
5 5 5 6 0
.
7 1 7 9 0
.
6 4 8 6 0
. 4 5 7 1
7 0 . 4 0 0 0 0
.
7 2 7 3 0
.
5 9 5 7 0
.
6 l 9 0 0
.
5 7 l 4 0
.
4 6 l 5
8 0
.
5 4 0 5 0
.
5 8 5 4 0
.
6 3 6 4 0
.
6 6 6 7 0
.
5 6 4 l 0
.
5 5 5 6 0
.
6 0 4 7
9 0
.
5 4 5 5 0
.
6 4 8 6 0
.
7 3 l 7 0
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7 0 2 7 O
.
6 6 6 7 0
.
7 5 0 0 0
.
6 0 0 0 0
.
6 8 4 2
1 0 《) . 6 1 1 1 0 . 6 6 6 7 0 . 7 2 7 3 () . 6 8 2 9 0 . 7 1 7 9 0 . 7 4 2 9 0 . 5 5 8 1 0
. 6 3 4 1 (). 7 6 9 2
1 1 0 . 5 0 0 0 0 . 7 6 9 2 0 . 7 7 4 2 0 . 7 5 8 6 0 . 5 8 3 3 0 . 5 8 3 3 0
. 7 8 5 7 0 . 6 6 6 7 0 . 6 4 0 0 0 . 7 5 8 6
0 . 0 2 2 5
0 . 0 1 , 5
健晏0.0:25
侧
0.007 5
0.002 5
11 7 2 5 9 10 6 3
种浑代号
图 2 种源间亲缘关系系统树
期 黄少甫等 :用 R A PD 技术测定黑荆树种源遗传关系初报 89
独为一群 ;其余 10 个种源为一群 , 后者又可分为 2 个组 , 1 1 、 7 、 2 、 5 为一组 , 9 、 1 0 、 6 、 3 、 4 、 8 为另
一组 。 从种源材料看 , 5 、 6 号来自同一个地方 , 实际上属于同一种源的两个单株后代 , 但在系统
树中的位置却属两个组 , 遗传距离比之同组的其它种为远 。 这很可能即使生长在同一地方 , 而
内在的遗传基础却存在较大差异 ;也可能原先相近 , 随引种而发生遗传变异而导致如今的差
异 。
黑荆树内含物中多糖成份较高 , 影响 D N A 抽提的质量 。 杂质的干扰 , 给扩增引物的配对
造成困难 , 使整个实验结果受影响 。 故作者在抽提液中加入 C T A B Z % , P v P Z 写 , 克服 了多糖
高的影响 , 获得了较为理想的效果 。
参 考 文 献l 高传璧 , 郑芳揖 .任华东.等.黑荆树优良地理种源选择研究.林业科学 研究 , 1 9 9.1 , 7 〔2 ) :1 3 ~ 1 4 2 .
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,
1 9 9 2
.
1 0 ( 1 )
:
6 6 ~ 7 2
.
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