全 文 ：第 !" 卷 第 # 期
# $ % $ 年 # 月
林 业 科 学
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2345，# $ % $
国槐转雪花莲凝集素基因及抗蚜性
张晓英% 6 甘6 敬# 6 尹伟伦7 6 朱6 祯! 6 王华芳7
（%5 北京市琅山苗圃 6 北京 %$$$78；#5 北京市园林绿化局 6 北京 %$$$#8；75 北京林业大学生物科学与技术学院 6 北京 %$$$97；
!5 中国科学院遗传与发育生物学研究所 6 北京 %$$%$%）
摘 6 要：6 通过农杆菌介导法将雪花莲外源凝集素基因（ !"#）导入国槐叶片，获得转基因再生植株，经卡那霉素抗
性筛选，:’; 和 &/<=>3?@ 40/= 检测证实，!"# 基因已经整合进入国槐基因组中。凝血活性检测表明，大部分转基因
植株表现出一定的凝血活性，对照未转化植株的凝血活性很低。室内离体叶片虫试试验进一步证明，转基因植株
较非转基因植株有一定的抗蚜虫能力。
关键词：6 国槐；雪花莲凝集素；槐蚜；根癌土壤农杆菌；基因转化；虫口密度
中图分类号：&A%91 !"；B8!71 #6 6 6 文献标识码：,6 6 6 文章编号：%$$% C A!99（#$%$）$# C $$D% C $D
收稿日期：#$$9 C $8 C %9。
基金项目：国家高技术研究发展计划（9"7 计划）资助项目（#$$%,,#!!$!%）。
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6 6 国槐（ 73>+3.# (#>3"’6#），系豆科（ -3G槐属植物，原产中国北方，为华北、西北地区城乡重
要的绿化树种。国槐易感槐蚜（ @>+’* ?&1’6#!’"’*），
蚜虫刺吸汁液并分泌蜜露，影响树木的光合作用和
呼吸作用，导致霉菌的产生和传播病毒，破坏城市景
观。目前在国槐的栽植中，均需施用化学杀虫剂进
行防治，对环境造成更严重的危害。随着全球气候
的变暖，蚜虫的危害面积和危害程度也正在不断扩
大并日趋严重。近年来，蚜虫已经成为国槐等豆科
植物发展的重要限制因子之一。
植物凝集素是一组在储藏及繁殖器官中含量丰
富、具有特异糖结合活性的蛋白质，可以透过昆虫肠
壁屏障进入脂肪体、卵巢管、血淋巴中（李旭刚等，
%889）。目前一般认为植物凝集素可能通过与糖蛋
白，如昆虫围食膜的几丁质、消化道上皮细胞的糖缀
合物、糖基化的消化酶等结合从而影响昆虫对营养
的吸收，促进消化道中细菌繁殖及诱发病灶，使昆虫
的生长发育受到抑制，最终达到抗虫、杀虫目的（梁
辉等，#$$!；王关林等，#$$!）。雪花莲凝集素
（0#4#"8+-* "’;#4’* FGG0<=I@I@，K*,）是植物凝集素的
一 种，对 具 有 刺 吸 式 口 器 的 害 虫，如 蚜 虫
（,S>IRIRF3）、褐 飞 虱（ ,’4#>#.;#8# 4-!&"*）、叶 蝉
（’IVFR300IRF3）等同翅目害虫的毒杀性在转基因水
稻（B./C# *#8’;#）、烟草（,’638’#"# 8#A#6-?）和喂食昆
虫试验上均有证实（王志斌等，%889；吴昌银等，
#$$$；周岩等，%889；朱新生等，%88A；朱玉等，
林 业 科 学 !" 卷 #
$%%&；’()*+,-.* !" #$/，$%%%），但未见国槐抗蚜虫基
因工程育种的报道。本文通过农杆菌介导将 %&# 基
因转化国槐，获得具有一定抗蚜性的转基因植株，为
国槐抗蚜新品种的培育提供了新的途径。
$# 材料与方法
!" !# 植物材料
所用植物材料取自北京林业大学植物生物技术
学科实验室，无菌苗由国槐种子萌发后，在附加
"012$3 4 56·7 8 $和 92243 $ 56·7 8 $的 :;（:-<(.+=6*
!" #$/，$%">）培养基上进一步继代繁殖得来，苗高均
为 $/ 4 ?5 以上。
!" $# 菌株与质粒
携带 质 粒 @’A2（ 图 $）的 根 癌 农 杆 菌
（’%()*#+"!(,-. "-.!/#+,!&0）菌株 712!!4! 由中国科
学院遗传与发育生物学研究所惠赠。所含标记基因
为 &1"!（新霉素磷酸转移酶基因），&1"!和 %&#（雪
花莲凝集素基因）分别受花椰菜花叶病毒的 BC; 启
动子控制，其 D0EA2 区段基因结构见图 $。
图 $# @1=F’A2 质粒中 D0EA2 区段基因结构
G=6/ $# ’*F* .)<-?)-<* ,H D0EA2 =F )+* @1=F’A2
!" %# 农杆菌的培养
取出用于转染的保存菌种，在含有卡那霉素
（I5 C4 56·7 8 $）与利福平（J=H C4 56·7 8 $）> 种抗
生素的平板（KL1 培养基）上划线，置于 >& M恒温
箱内培养，至长出单菌落后挑取单菌落，接种于含相
应抗生素的液体 KL1 培养基，于 >& M恒温下摇床
培养（>44 <·5=F 8 $）过夜。
!& ’# 叶片基因转染
取生长健壮的无菌苗叶片 $$! 枚，在预培养培
养基上预培养 > N B 天。用叶盘法（O,<.?+ !" #$2，
$%PC）将预培养的无菌叶片，在菌液中浸染 $4 N $C
5=F 左右，取出叶片，用无菌滤纸吸干后，转入共培
养培养基中于 >C M暗培养 > N B 天后，最后将叶片
转入分化筛选培养基中，>C M光条件下培养。继代
选择出的抗性幼苗转入生根筛选培养基中诱导生
根。叶片预培养培养基：:; Q "012B3 4 56·7 8 $ Q
922 43 $ 56·7 8 $；叶片共培养培养基：:; Q "012
B3 4 56·7 8 $ Q 922 43 $ 56·7 8 $ Q 2; $44 "5,R·7 8 $；
叶片分化筛选培养基：:; Q "012 B3 4 56·7 8 $ Q
922 43 $ 56·7 8 $ Q ’!$P P 56·7 8 $ Q S*H C44 56·
7 8 $；生根筛选培养基：$ T >:; Q 912 $/ 4 56·7 8 $ Q
’!$P $4 56·7 8 $ Q S*H >44 56·7 8 $。
!& (# )*+ 检测
采用 SD21 法（U,<*V.W= !" #$2，$%%&）提取 % 株转
基因植株 EA2，以 @1=F’A2 为阳性对照，以未转化
植株叶片 EA2 为阴性对照。引物 $：CX0S22 22D
’’S D22 ’’S 22’ DSD SSD S0BX；引物 >：CX0S’’
DS2 DD2 SDD D’S S’D S2S 22’0BX。反应体系
为：%! M $ 5=F，CP M $ 5=F，&> M > 5=F，BC 个循
环；最后在 &> M下继续延伸 $4 5=F。扩增产物用
4/ PY琼脂糖凝胶电泳检测。
!" ,# -./01234 56.0
用 3,&Z#和 4*#$酶切质粒 @1=F’A2，从凝胶
中回收约 !P! V@ 的 %&# 基因片断为模板，采用随机
引物法（!0B> U）ZSDU（$4 "S=·"7 8 $）$ "7 放射标记
探针，取 >4 "6 植物 EA2，用 3,&Z#和 4*#$酶切
后，在 $3 4Y琼脂糖凝胶电泳 $> +，然后转移到 AS
膜上，通过预杂交、杂交后，于 8 &4 M放射自显影 &
天，冲洗 [ 光片并照相记录结果。
!& 7# 叶片蛋白提取液的凝血活性检测
取 43 B N 43 C 6 新鲜叶片，液氮研磨后加入 "44
"7 蛋白提取液充分混匀，以$$ 444 <·5=F 8 $，! M离
心 $4 5=F，将上清液作为检测样品；取羊血液 $4 57
（羊血由中国农科院畜牧研究所提供），用新鲜生理
盐水配成 $Y柠檬酸钠溶液作抗凝剂。取抗凝剂 C
57 于锥形瓶中，将采取的血液立即加入锥形瓶中，
轻轻摇动，立即以$ C44 <·5=F 8 $离心 C 5=F，去上清，
加 B 倍体积的新鲜生理盐水悬浮红血球，再以$ C44
<·5=F 8 $离心 C 5=F，去上清。同法再洗 > 次，收集红
细胞加生理盐水配成 \EC!4 ] $3 4，! M 保存备用。
取干燥的 %" 孔血凝板 $ 块，加检测样品 >4 "7，轻
轻振荡。各孔加入经洗涤的红细胞 P4 "7，轻轻振
荡静置室温（>C M）约 > N ! + 后观察结果。
!" 8# 抗蚜性检测及效果评价
$3 P3 $# 蚜虫生殖能力 # 参照吴昌银等（>444）的方
法并做适当的修改，在直径 % ?5 培养皿中放置 > 层
滤纸，无菌水浸湿后置适量新鲜叶片，以非转化植株
叶片为对照，每皿内放置 B 只 $ N > 龄的槐蚜（ ’15,0
.!6,+#%,&,0），重复 C 次，将培养皿置于恒温光照培
养箱（>> M；光照 ^黑暗 ] $!^ $4；相对湿度 P4Y）。
每隔 >! + 定时观察记录蚜虫存活、生长发育及繁殖
情况，并于检查时将所蜕皮和幼蚜挑出，同时及时更
换新鲜叶片直到母体蚜虫死亡为止。
$3 P3 ># 蚜虫群体增长情况 # 将 ! 株转化植株和对
照植株用网罩隔开，每个植株接上 C 头 > 龄幼虫，每
>C
! 第 " 期 张晓英等：国槐转雪花莲凝集素基因及抗蚜性
天定时统计蚜虫群体的数量，连续调查 #" 天。调查
指标：蚜口密度抑制率 $（对照植株虫数 %转化植
株虫数）&对照植株虫数 ’ #(()；平均蚜口密度抑
制率 $各个供试植株的蚜口密度抑制率之和 &供试
植株数。
"! 结果与分析
!" #$ 转 !"# 基因国槐的获得
预培养 * 天的 ##+ 枚国槐叶片用根癌土壤农杆
菌侵染后，转接到共培养培养基 * 天左右，然后转移
到筛选培养基上，经过 " 周筛选培养后，大多数叶片
褪绿、变黄，有的叶片也能形成少量白色紧密的愈伤
组织（图版! % #），但在以后的筛选培养中很难分
化出芽，最终变褐、坏死（图版! % "）。只有 #* 枚
叶片从叶柄部长出愈伤组织，逐渐分化出小芽（图
版! % *，+，,），分化率为 ##- +)。将再生芽切下，
插入生根培养基中，约 " 周后在小苗的基部生出白
色根，生根率达 .#- /)。随后的几周产生许多须
根，生长正常（图版! % 0）。当植株在生根培养基
中长至 + 1 0 23 时，移栽到小钵，置于温室，进行适
宜的栽培管理（图版! % 4，.）。
!" !$ 国槐转化植株的 %& 抗性鉴定
切取生长在无菌管中转化植株的叶片，接种于
含有抗生素的筛选分化培养基上，能逐渐形成愈伤
组织，并能分化出不定芽，而未转化的对照植株叶片
不能形成愈伤组织，叶片会逐渐变黄、发褐、坏死。
初步证明转化取得成功。将对照植株顶芽切下，插
入含有抗生素的生根培养基中，植株不能生根，约
#( 天后苗基部变褐，叶片逐渐变黄，直至整株枯死
（图版! % /）；而转化植株则能正常生根，生长状况
良好，证明转化获得初步成功。
!" ’$ 转化植株的 ()* 检测
以质粒 56789:; 的 <:; 作阳性对照，未转化
植株叶片 <:; 作阴性对照，对 . 株转化植株进行
=>? 检测表明，阳性对照及转化植株扩增出了预期
的 +4+ @5 的电泳带，而阴性对照没有此条电泳带
（图 "），证明外源基因已整合到国槐基因组中。
!" +$ 转化植株的 ,-./0123 45-/
取经 =>? 初步鉴定的植株 <:; 作为检测样
品，以非转化植株 <:; 为阴性对照，将阳性质粒酶
切后为阳性对照。分子杂交结果证明，质粒 <:; 和
转化植株 <:; 均有杂交信号，而未转化植株 <:;
无杂交带（图 *）。由此可见，经 A3 抗性鉴定、=>?
和 BCDEFGH8 @ICE 检测的植株是转 !"# 植株。
图 "! 转 56789:; 植株的 =>? 检测
J7KL "! =>? M8MINO7O CP 56789:;QEHM8OPCH3GR 5IM8EO PCH EFG !"# KG8G
#L标准分子量 SCIG2DIMH 3MHTGH；"L质粒 56789:; 作为
阳性对照 =CO7E7UG 2C8EHCI；*L非转基因植株作为阴性对照
:C8QEHM8OKG872 2C8EHCI 5IM8EOL
+ % #"L 转基因植株 56789:;QEHM8OPCH3GR 5IM8EOL
图 *! 国槐转 !$# 基因植株的 BCDEFGH8 @ICE 分析
J7KL *! BCDEFGH8 MOOMN CP !"# KG8G 78 EHM8OKG872 5IM8EO
=L质粒 56789:; & %&’?!作为阳性对照
56789:; VMO R7KGOEGR @N %&’? ! MO 5CO7E7UG 2C8EHCI；
#L非转基因植株基因组 <:; 用 %&’?!酶切
:C8QEHM8OKG872 2C8EHCI 5IM8E，KG8C372 <:; VMO R7KGOEGR V7EF %&’?!；
" % ##L 转基因植株基因组 <:; 用 %&’?!酶切
WHM8OKG872 5IM8EO，KG8C372 <:; VMO R7KGOEGR V7EF %&’?! L
!6 7$ 转化植株的凝血活性检测
提取转 !"# 基因植株的总蛋白，稀释后作为凝集
素活性的待检样品。以 (L ((, "K·"X % #的标准 9:; 蛋
白为阳性对照，不加植物蛋白提取液和加未转基因蛋
白提取液 " 个阴性对照，每孔加 "( "X；接着加制备的
羊红血细胞悬液 4( "X，混匀 ", Y静置 " F 观察结果。
从转 !"# 基因植株的凝血反应可以看出，!"# 基因在转
基因植株中不仅存在并正常表达，当转基因植株蛋白
提取物与羊血红细胞混合静置一段时间后，其中含有
的 9:;蛋白与羊血红细胞表面糖蛋白结合，发生凝血
反应而呈混浊状态，相比之下非转基因植株蛋白提取
物或转基因失活植株的蛋白提取物则不能使血红细胞
凝集，最终血细胞沉积于凝血板底部。本试验中大部
分转 !"# 的国槐植株样品凝集反应比较明显，例如样
品 6,，60，>#，>"，>*，<#，<*，证明 !"# 基因在这些植株
中有表达。非转化植株 ;# % ;0中没有表达活性，证明
羊血红细胞未发生凝集反应（图 +）。
!6 8$ 转基因国槐抗蚜虫初步鉴定
取移植到营养钵 * 周的转基因国槐 #* 株及未
转化对照（>A）植株，分别接上 " 龄幼虫 " 头，进行
孤雌生殖繁殖后代（图 ,）。母体蚜虫产生的后代总
数、产生后代蚜虫的时间及母体蚜虫的死亡时间的
统计结果见表 #。
*,
林 业 科 学 !" 卷 #
图 !# 转 $%&’()* 植株的凝血反应检测结果
+&,- !# ./01/ 234&5&46 2’2768&8 19 $%&’()*:4/2’891/;<=
$72’48 91/ 4>< !"# ,<’<
*? @ *"：非转基因植株 )<,24&5< 31’4/17；%? @ %"：转基因植
株，大部分植株显示了较强的凝血活性，但 %A 和 %B 活性较小
C/2’91/;<= $72’48，;184 8>1D 84/1’, 3/01/ 234&5&46 D>&7< %A 2’=
%B 8>1D 7<88 234&5&46-
# # 接种蚜虫 ?A 天时统计结果表明，转化植株上的
蚜口密度明显低于非转化植株，并且不同转化植株
的抗蚜性存在明显差异，蚜口密度抑制率从 E- "F
到 !!- !F不等，平均抑制率达 BGH BF，但单株之间
存在差异，比如转基因植株 C?B 可达 !!H !F，而 C?
的抑制率仅为 EH "F（图 "）。
综合蚜虫在转基因植株叶片和幼苗上的繁殖能
力和群体增长情况，与对照植株相比，转基因植株对
蚜虫有一定的抑制作用。转基因植株较对照能使蚜
虫的繁殖率降低，蚜口密度减少。A 项调查的结果
基本一致。另外，蚜虫存在多型现象，即在合适环境
中，产生无翅胎生雌蚜；在环境不适时，产生有翅
蚜，并且个体较大，容易死亡，而未转化植株上没有
发现有翅蚜。
B# 讨论
在试验中发现，植物蛋白提取物和羊血红细胞
图 E# 部分转基因植株的室内抗蚜性试验
+&,- E# *$>&= /<8&842’4 4<848 &’ /11; 91/ 81;< 4/2’8,<’&3 $72’48
图 "# 部分转基因植株蚜口密度抑制情况
+&,- "# *$>&= =<’8&46 /<84/2&’&’, /<80748 19 81;< 4/2’8,<’&3 $72’48
!E
! 第 " 期 张晓英等：国槐转雪花莲凝集素基因及抗蚜性
表 !" 转 !"# 基因植株室内抗蚜虫初步鉴定
#$%& !" ’()*$(+ ),-./)0)1$/)2. 20 (-3)3/$.1- 20 4-$0 ,)31 $., 5624- 74$./ /2 $76),3 ). !"#8/($.39-.)1 74$./3
供试植株
#$%&$’ ()*+&%
蚜虫的生殖能力
#,$ -$(-.’/0&12$ 0*(*01&3 .4 *(,1’%
蚜虫群体增长情况
5(,1’ (.(/)*&1.+ 6-.7&,
母体蚜虫产生的后代总数
#.&*) +/89$- .4
*(,1’ .44%(-1+6%
产生后代蚜虫的时间
#18$ .4 -$(-.’/01+6
*(,1’ .44%(-1+6% : ’
母体蚜虫的死亡时间
#18$ .4 8*&$-+*)
*(,1’ ’$*&, : ’
; ’ < ’ = ’ >" ’
?@ >= " >> A B >C "=
#> >D E B — — — —
#" >" E = A D >" >A
#E >E < C — — — —
#< >> A C A C >; >E
#A >" A C — — — —
#C >< < D — — — —
#D >> A C A A = >"
#= >E A A — — — —
#B >" < C — — — —
#>; >> < C — — — —
#>> >E E D — — — —
#>" >< A B A A >; >"
#>E >; A C — — — —
最好是现制现用，采样也最好是新生叶片，否则
FG5 蛋白凝集活性的灵敏度就会大为下降，而不利
于检测的准确性。在胰蛋白酶抑制剂活性的测定
中，样品也最好是新鲜的，因为在试验中发现，放置
过夜的样品在测定抑制剂活性时，转基因植株样品
与对照的差异会减小。另外，本研究还发现，国槐转
!"# 基因的部分再生植株中检测不到外源目的基因
的转录产物或转录产物强弱差别很大。凝集素凝血
活性表明转 !"# 基因的部分植株没有凝血活性或仅
有很弱的凝血活性，这表明这些基因在转基因植株
体内发生了基因失活现象。引起外源基因失活的因
素有很多种，比如多拷贝、位置效应及共抑制效应等
（H)*2$))，>BB<；李旭刚等，>BB=）。基因失活对于获
得目的基因稳定表达的转基因植株是极为不利的。
国槐转 !"# 基因植株失活的机制还需进一步研究。
对于转 !"# 基因的植物抗蚜性目前已有文献报
道：转 !"# 烟草（ I1)’$- $% #&’，>BBA；王志斌等，
>BB=）对桃蚜（ ()*+, -$.,/0#$）的平均抑制率为
A;J；周岩等（>BB=）报道为（";;<）在转 !"# 菊花（1$"2.#"%3$4# 45./65&/+4）的
研究中，最高蚜口密度抑制率为 =（";;<）对小麦抗蚜性的研究结果表明，转 !"# 小麦
对蚜口密度抑制率为 基因的研究未见报道。本研究结果表明，转 !"# 基
因国槐的最高蚜口密度抑制率为 <密度抑制率为 E;L EJ，较上述已报道植物低，初步
推测可能与木本植物外源基因表达机制有关。进一
步的大量抗虫试验正在进行。
参 考 文 献
李旭刚，谢迎秋，朱 ! 桢 M >BB=M外源基因在转基因植物中的失活 M 生
物技术通报，（E）：> N =M
梁 ! 辉，朱银峰，朱 ! 祯，等 M ";;转基因小麦抗蚜性的研究 M 遗传学报，E>（"）：>=B N >B王关林，刘彦泓，郭绍华，等 M ";;转基因植株的抗蚜性研究 M 遗传学报，E>（>"）：>王志斌，李学勇，郭三堆 M >BB=M植物凝集素与抗虫基因工程 M 生物技
术通报，（"）：A N >;M
吴昌银，叶志彪，李汉霞，等 M ";;;M雪花莲外源凝集素基因转化番茄 M
植物学报，<"（D）：D>B N D"EM
周 ! 岩，田颖川，吴 ! 标，等 M >BB=M 转雪花莲外源凝集素基因烟草对
桃蚜的抑制作用 M生物工程学报，><（>）：>E N >BM
朱新生，朱玉贤 M >BBDM 抗虫植物基因工程研究进展 M 植物学报，EB
（E）："=" N "==M
朱 ! 玉，吴 ! 茜，高越峰，等 M >BBDM雪花莲外源凝集素基因的克隆、序
列和植物表达载体的构建 M农业生物技术学报，（A）：EE> N EE=M
H)*2$)) O PM >BB.4 %($01410 %$S/$+0$ ’/()10*&1.+M T-.0 G*&) 501’ U01，B>：EN EF*&$,./%$ 5 V O， W*21%.+ F V， U&$7*-& X G， $% #&M >BBBM
?.+0*+*2*)1+ 5 1+,191&% ’$2$).(8$+& .4 &.8*&. 8.&,（ 7#0#"58/#
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（责任编辑 ! 徐 ! 红）
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