全 文 ：第 !" 卷 第 # 期
$ % & % 年 # 月
林 业 科 学
’()*+,)- ’)./-* ’)+)(-*
/012 !"，+02 #
3456，$ % & %
核桃早实基因的 ’(-7标记!
李伟波&，$ 8 马8 明# 8 孙8 翠&，$ 8 侯立群! 8 杨克强&，$
（&2 作物生物学国家重点实验室 8 泰安 $9&%&:；$2 山东农业大学农业生态与环境重点实验室 8 泰安 $9&%&:；
#2 山东省济宁技术学院 8 济宁 $9$%&#；!2 山东省林业科学研究院 8 济南 $;%%&!）
摘 8 要：8 根据与核桃早实性状连锁的 7-<= 标记 >引物。在亲本、杂交后代和栽培品种（系）中的检测结果表明：’*-@B C ’*-@7 引物对在早实亲本‘绿园’中能稳定扩
增出 ’(-7@’*-A;:特异标记；在‘绿园’D‘绿丰’杂交 B& 后代群体中，’(-7@’*-A;:标记与核桃早实性状共分离，与
核桃早实性状间的遗传距离为 &2 AA E3；用晚实优系‘,@&$’和栽培品种‘元丰’及‘,@&$’D‘元丰’杂交 B& 后代，检
测 ’(-7@’*-A;:标记的分离情况，’(-7@’*-A;:与核桃早实性状共分离；在 A 个核桃栽培品种（系）中，’(-7@’*-A;:
在 : 个供试品种的 9 个早实品种上出现，在 & 个早实品种‘鲁光’和 & 个晚实优系‘ ,@&$’上没有扩增出条带。
’(-7@’*-A;:标记在不同遗传背景下有较高的稳定性。
关键词：8 核桃；早实性状；7-<=；’(-7
中图分类号：’9&:2 !"8 8 8 文献标识码：-8 8 8 文章编号：&%%& F 9!::（$%&%）%# F %%;" F %"
收稿日期：$%%: F &$ F &:。
基金项目：山东省良种产业化工程项目，山东省自然基金项目（$%%9G7?%&;;!），山东省人事厅项目（$%%"%#%#A）和山东省教育厅项目
（ H%9IB%"）。
!杨克强为通讯作者。
!"#"$%&’"() %* + ,-./ 0+12"1 34(2"5 )% 61"7%74%89 :1+4) 4( ;+$(8)（!"#$%&’ ()#*%）
.J IKJL0&，$ 8 34 3JMN# 8 ’OM (OJ&，$ 8 P0O .JQOM! 8 R4MN SKQJ4MN&，$
（&2 !"#"$ %$& ’#()*#")*& )+ ,*)- ./)0)1&8 2#/’#3 $9&%&:；
$2 %$& ’#()*#")*& )+ 41*/560"6*#0 75)0)1& #38 739/*)3:$3"，!;#38)31 41*/560"6*#0 <3/9$*=/"& 8 2#/’#3 $9&%&:；
#2 >/3/31 2$5;3)0)1& ,)00$1$，!;#38)31 ?*)9/35$8 >/3/31 $9$%&#；8 !2 !;#38)31 45#8$:& )+ @)*$="*&8 >/3#3 $;%%&!）
.<9)1+7)：8 ’(-7（ TKQOKMEK EU454EVK5JWKX 4YZ1J[JKX 5KNJ0M）Y45\K5 Z5JYK5T ’*-@B C ’*-@7 4MX ’*?@B C ’*?@7 ]K5K
XKTJNMKX 0M VUK L4TJT 0[ VUK =+- TKQOKMEK 0[ 7-<= Y45\K5 >NKMK JM ]41MOV（ >610#3= *$1/#）6 ,UK 5K1J4LJ1JV^ 0[ ’(-7@’*-A;: Y45\K5 ]4T XKVKEVKX L^ TE5KKMJMN =+- [50Y Z45KMVT，
U^L5JXT 4MX _45JKVJKT（ E10MK）]JVU ’*-@B C ’*-@7 Z5JYK5T6 ,UK 5KTO1VT TU0]KX VU4V VUK TZKEJ[JE Y45\K5 ’(-7@’*-A;: ]4T
4YZ1J[JKX TV4L1^ OTJMN =+- K‘V54EVKX [50Y Z5KE0EJ0OT Z45KMV‘ .a^O4M’4T VUK VKYZ14VK ]JVU ’*-@B C ’*-@7 Z5JYK5T6 )M
VUK B& U^L5JX Z0ZO14VJ0M [50Y‘.a^O4M’D‘.a[KMN’，VUK ’(-7@’*-A;: Y45\K5 ]4T E0@TKN5KN4VJMN ]JVU Z5KE0EJ0OT NKMK 0[
]41MOV 4MX VUK NKMKVJE XJTV4MEK LKV]KKM ’(-7@’*-A;: 4MX Z5KE0EJ0OT NKMK ]4T &2 AA E36 ,0 XKVKEV VUK 5K1J4LJ1JV^ 0[
’(-7@’*-A;: Y45\K5 [O5VUK5，VUK VKYZ14VK =+- [50Y 14VK5 Y4VO5K Y4VK5M41 Z45KMV‘ ,@&$’，Z5KE0EJ0OT Z4VK5M41 Z45KMV
‘R4M[KMN’4MX VUKJ5 &$# B& U^L5JXT Z14MVT ]4T TE5KKMKX ]JVU ’*-@B C ’*-@7 Z5JYK5T6 ,UK ’(-7@’*-A;: Y45\K5 ]4T E0@
TKN5KN4VJMN ]JVU Z5KE0EJ0OT NKMK JM VUK B& U^L5JX Z0ZO14VJ0M [50Y‘ ,@&$’D‘ R4M[KMN’ KJVUK56 )M A ]41MOV _45JKVJKT
（ E10MK），VUK ’(-7@’*-A;: Y45\K5 ]4T Z5KTKMVKX JM 9 0OV 0[ : Z5KE0EJ0OT _45JKVJKT，LOV 4LTKMV JM Z5KE0EJ0OT _45JKV^
‘.ONO4MN’4MX 14VK5 Y4VO5K E10MK‘,@&$’2 )V ]4T JMXJE4VKX VU4V ’(-7@’*-A;: ]0O1X LK 4M JXKMVJ[JK5 0[ Z5KE0EJ0OT ]41MOV
_45JKVJKT（ E10MK）6 ’V4LJ1JV^ 0[ VUK K[[KEV 0[ ’(-7@’*-A;: ]4T UJNU JM XJ[[K5KMV NKMKVJE L4E\N50OMXT6
="> ?%159：8 ]41MOV（ >610#3= *$1/#）；Z5KE0EJ0OT V54JV；7-<=；’(-7
8 8 多数林木和果树树种，从播种到第 & 次开花的
童期（ bO_KMJ1K）较长，这是影响其栽培和育种的一个
主要因素。而在核桃（ >610#3= *$1/# ）中存在着一类
播种当年或第 $ 年就能开花结实的早实类型（杨文
衡等，&A:#；cK5Y4JM $" #06，&AA9）。奚声珂（&A:9）通
过杂交试验认为，核桃早实性状是 $ 对以上等位基
因决定的显性性状。?5KV0M 等（$%%!）报道了一些
早实核桃，在组织培养的试管内就能开花，并用同源
序列法从这些组培苗木中，克隆获得了核桃早实相
关基因 4A4BC! 第 " 期 李伟波等：核桃早实基因的 #$%& 标记
以自然存在的早实核桃和晚实核桃类群为试材，参
照混合分离群体法（’()*+, -+./+.012 010)3-4-，5#%），
初步确定 6789:;9<是与核桃早实基因相关的 &%7=
标记。杨克强等（><<>）曾获得了与核桃早实性状
相连锁的 &%7= 标记 675?<@A<<。随后，杨克强等
（><<;）以核桃早实优系‘绿园’和晚实速生优系‘绿
丰’及‘绿园’B‘绿丰’杂交组合的 C9 杂种后代为
试材，定位了 &%7= 标记 675?<@A<<与核桃早实基因
的遗传距离为 9D AA EF，测序结果显示，该标记序列
全长 A:@ ’G，该标记应记为 675?<@A:@，8+1501* 登
录号为 =HI;"I9J。
本研究根据与核桃早实基因连锁的 &%7= 标记
675?<@A:@序列，设计了 #K%，#K5 > 对 #$%& 引物，
将与核桃早实基因连锁的 &%7= 标记 675?<@A:@转
化为 #$%&（ -+L(+1E+ EM0/0E2+/4N+, 0OG)4P4+, /+.4Q1）
标记，并在亲本、杂种后代和栽培品种中验证该
#$%& 标记与核桃早实基因的分离情况，计算该标
记与核桃早实基因间的遗传距离，并对该标记进行
克隆测序及序列分析，为核桃分子辅助育种和图位
克隆早实基因奠定基础。
9! 材料与方法
!" !# 植物材料
供试植物材料为普通核桃（ !"#$%&’ ()#*%）的品
种、优系及其杂交后代。
栽培品种 A 个：‘元丰’、‘鲁光’、‘辽 9’、‘中林
"’、‘中林 :’、‘扎 "J"’、‘西扶 >’、‘西林 >’、‘西林
"’，均为早实核桃品种。优系 " 个：其中早实核桃
优系 9 个，为‘绿园’；晚实核桃优系 > 个，为‘绿丰’
和‘R?9>’。
杂交组合 > 个：‘绿园’（早实）B‘绿丰’（晚
实）杂交组合 C9 后代 9:J 株；‘ R?9>’（晚实）B‘元
丰’（早实）杂交组合 C9 后代 9>" 株。
供试的杂交材料于 ><<> 年春进行套袋杂交，秋
季收获杂交种子。><<: 年 " 年生时，‘绿园’B‘绿
丰’C9杂交后代中有 ;< 株开花，为早实类群，有 @J
株未开花，为晚实类群；‘R?9>’B‘元丰’C9 杂交后
代中有 "@ 株开花，为早实类群，有 @: 株未开花，为
晚实类群。供试栽培品种（系）均为嫁接苗。材料
单株按 9 O B " O 的株行距定植保存于山东农业大
学林学试验站和山东泰安绿园经济林研究所。
!$ %# 仪器和试剂
7$& 仪为美国 FS 公司生产 7R$?9<< 型，电泳
仪为北京六一仪器厂生产 =TT?!型，凝胶成像仪为
英国 UV7 公司生产 8=#;I<< 型，高速低温离心机
为德国 KGG+1,Q/P E+12/4P(.+ :J9:= 型。
=W><<< =X% F0/*+/，+%, =X% 聚合酶 Y42，
,XR7-，%.0/Q-+ 8+) =X% 7(/4P4E024Q1 Y42，F414 5K#R
7)0-O4, 7(/4P4E024Q1 Y42，胰蛋白胨，酵母提取物，Z?
80)，[7R8，氨苄（ %OG），以及载体质粒 GF=9@?R
V+E2Q/，大肠杆菌（ -’./)(*./*% .0$*） SF9-.0&"和 1*&,!，F9" 7/4O+/ FJ，F9" 7/4O+/ &V
等，均购自大连 R0Y0&0 公司。$R%5，K=R%，7V7，
R/4-，# \ 巯 基 乙 醇， &X% 酶 购 自 上 海
#01.Q1 公司。 ! !
!$ &# ’()* 引物设计
在特异引物 675?<@A:@及其互补序列基础上，向
内延长了 A ] 9" ’G，设计了 #K%，#K5 > 对 #$%& 引
物，序 列 如 下：#K%?C：:^?8R$$%$%$88%%R%8R
$$$%R?"^；#K%?&：:^?$8R8R8%$%$$8R8R88%$?
"^；#K5?C：:^?8R$$%$%$88%%R%8R$$$%RR%?"^；
#K5?&： :^?R8%$8R8R8%$%$$8R8R88%$?"^。 #$%&
引物由上海 #01.Q1 公司合成。
!$ +# 核桃基因组 ,-) 的提取
核桃基因组 =X% 的提取参照杨克强等（><<;）
的方法。
!$ .# /(* 扩增体系
反应体系总体积为 >: $W，其中 9< B 7$& 5(PP+/
［9<< OOQ)·W \ 9 R/4-?_$)（ G_ @D "），:<< OOQ)·W \ 9
Y$)］>D : $W，F.$)> >D < OOQ)·W
\ 9，,XR7 各 :
OOQ)·W \ 9，#$%& 特异引物 =X% 聚合酶 9 U，=X% 模板 9:< 1.。
7$& 扩增反应程序：AJ ‘预变性 : O41；每个循
环 AJ ‘变性 9 O41，"I ‘退火 9 O41，;> ‘延伸 >
O41，共 J: 个循环；完成最后 9 个循环后，再 ;> ‘延
伸 9< O41，反应终止于 J ‘。
扩增产物用含 胶，在 : V·EO \ 9 电压下 电 泳，电 泳 缓 冲 液 为
\ 9
K=R%）。在凝胶成像仪下观察、照相。
!$ 0# ’()* 标记片段 ,-) 的克隆与测序
#$%& 标记片段 =X% 的回收、克隆、阳性克隆
的筛选参照杨克强等（><<:）的方法。=X% 测序由
上海博亚公司完成。
!$ 1# 遗传距离的计算
对标记片断在杂交 C9 后代中的分离状况进行
%> 检测，利用 _0),01+ 函数 2 b \ )1（9 \ >(）c > 估算
遗传距离，式中，2 为遗传距离，( 为重组率（莫惠
栋，9AAI）。
;:
林 业 科 学 !" 卷 #
$ # 结果与分析
!" #$ %&’( 标记转化为 )*&% 标记
以早实亲本‘绿园’和晚实亲本‘绿丰’的基因
组 %&’ 检测 $ 对 ()’* 引物（图 +）。
图 +# ()’* 引物 (,’ 和 (,- 扩增结果
./01 +# (234567/2 839:/;0 %&’ <=6054;78 65>?/:/73 ()’*A(,’ 6;@ ()’*A(,- >=/54=8
B：%C$DDD %&’ 56=E4=；+ F G：()’*A(,’ 在退火温度分别为
H!，H"，HI J时在早实亲本‘绿园’上的扩增结果；! F "：()’*A
(,’ 在退火温度分别为 H!，H"，HI J时在晚实亲本‘绿丰’上
的扩增结果；K F L：()’*A(,- 在退火温度分别为 HH，HK，HL J
时在早实亲本上的扩增结果；+D F +$：(,- 在退火温度分别为
HH，HK，HL J时在晚实亲本上的扩增结果。
B：%C$DDD %&’ 56=E4=；+ F G：%&’ <=6054;78 65>?/()’*A(,’ >=/54= 9; >=4292/9M8 >6=4;7‘ CNOM6;’ 67 6;;46?/;0
745>4=67M=4 H!，H"，HI J；! F "：%&’ <=6054;78 65>?/()’* B6=E4= (,’ 9; ?674 567M=4 >6=4;7‘ CN<4;0’67 6;;46?/;0
745>4=67M=4 H!，H"，HI J；K F L：%&’ <=6054;78 65>?/()’*A(,- >=/54= 9; >=4292/9M8 >6=4;7‘ CNOM6;’ 67 6;;46?/;0
745>4=67M=4 HH，HK，HL J；+D F +$：%&’ <=6054;78 65>?/()’*A(,- >=/54= 9; ?674 567M=4 >6=4;7‘ CN<4;0’67 6;;46?/;0
745>4=67M=4 HH，HK，HL J 1
对于第 + 对引物 (,’，分别设定在退火温度为
H!，H"，HI J条件下进行 Q)* 扩增。结果发现，在
H!，H"，HI J退火条件下，引物对 (,’ 在早实亲本
‘绿园’上均能扩增出 LHI P> 左右和 *’Q% 特异标
记片段大小相近的片段特异条带，在晚实亲本‘绿
丰’上没有扩增出条带（图 + 泳道 + F " 所示）。将
这一特异标记条带记为：()’*A(,’LHI。而引物对
(,- 仅在退火温度 HH，HK J时在早实亲本上同时扩
增出了约 LHI P> 的条带，在退火温度 HL J时在早
实亲本上扩增不出特异条带；HH，HK，HL J退火温度
时在晚实亲本上扩增不出条带（图 + 泳道 K F +$）。
()’*A(,’ 引物对的稳定性好于 ()’*A(,- 引
物对。
!" !$ )*&%+),&-./标记在 0# 后代和栽培品种中的
检验
$R $R +# ()’*A(,’LHI标记在‘绿园’S‘绿丰’.+ 杂
交后代中的分离 # 用 ()’*A(,’ 引物对对‘绿园’
S‘绿丰’.+ 杂交后代 +H! 株个体的基因组 %&’ 进
行 Q)* 扩增，部分扩增结果如图 $。结果表明，在
KD 株早实后代中，有 "L 株扩增出 LHI P> 的 %&’ 条
带，+ 株（H 号）未出现该条带；I! 株晚实后代中，I$
株未出现该条带，$ 株（+I 号、+DI 号）出现，共有 G
株表现为重组类型，其重组率为 +R LHT。!$ 检测显
示，供试的‘绿园’S‘绿丰’.+ 杂交群体早实和晚
实性状的分离比例符合 + U +的分离比例，标记
()’*A(,’LHI与早实性状共分离（表 +）。 ()’*A
(,’LHI在该群体中与核桃早实基因间的遗传距离为
+R LL 2B。 ()’*A(,’LHI 在后代中的分离情况和
*’Q% 标记 VQ-ADILHI的分离情况相一致。
图 $# ()’*A(,’ 引物对在‘绿园’、‘绿丰’及‘绿园’S
‘绿丰’杂交 .+ 后代 + F $D 号植株上的扩增结果
./01 $# (234567/2 839:/;0 %&’ <=6054;78 65>?/()’*A(,’ >=/54= /;‘CNOM6;’，‘CN<4;0’6;@
‘CNOM6;’S‘CN<4;0’.+ 3OP=/@8 9< &91 + 79 $D
B：%C $DDD %&’ 56=E4=；,：早实亲本‘绿园’；C：晚实亲本‘绿丰’；
W：早实后代；F：晚实后代；Q：特异标记出现；’：特异标记未出现。
B：%C $DDD %&’ 56=E4=；,：Q=4292/9M8 >6=4;7‘CNOM6;’；
C：C674 567M=4 >6=4;7‘CN<4;0’； W：Q=4292/9M8 3OP=/@8 9< 2=988；
F：C674 567M=4 3OP=/@8 9< 2=988；Q：B6=E4= >=484;7；’：B6=E4= 6P84;71
表 #$ 杂交群体早实性状及特异标记分离的 !! 检测"
1234 #$ !! 52678 9:; <::=>8?? 9@A A: B;8C:C@:7? A;2@A 2>= D2;E8;
杂交组合
)=988 295P/;67/9;
结实特性
X=6/7
.+ 群体
.+ >9>M?67/9;
+U+分离比例
+U + 840=4067/9;
()’*A(,’LHI的分离
(40=4067/9; 9< 56=E4=
()’*A(,’LHI
! Y DR DH
（ @< Y +）
! Y DR D+
（ @< Y +）
早实 Q=4292/9M8 KD KK "L GR I!+ "R "GH
‘绿园’S‘绿丰’ 晚实 C674 567M=4 I! KK I$
!$ 值 !$ Z6?M4 +R !DD!! DR D"L!!
早实 Q=4292/9M8 GI "+R H G"
‘XA+$’S‘元丰’ 晚实 C674 567M=4 IH "+R H I$
!$ 值 !$ Z6?M4 +KR LHL G DR $$D I!!
# # "!!：在 !’DR DH 水平上差异显著 # (/0;/IH
! 第 " 期 李伟波等：核桃早实基因的 #$%& 标记
’( ’( ’! #$%&)#*%+,-标记在‘ .)/’’0‘元丰’1/ 杂
交后代中的检验 ! 以‘ .)/’’、‘元丰’及‘ .)/’’0
‘元丰’杂交 1/ 后代 /’" 株个体的基因组 23% 为模
板，用 #$%&)#*% 引物对进行 4$& 扩增，检测
#$%&)#*%+,-标记在‘ .)/’’0‘元丰’杂交 1/ 后代
群体中的分离情况，部分扩增结果如图 "。
图 "! #$%&)#*% 引物对在‘.)/’’、‘元丰’及‘.)/’’0
‘元丰’杂交 1/ 后代 / 5 /+ 号植株上的扩增结果
1678 "! #9:;<=>69 ?:@A6B7 23% CD=7<;B>? =#$%&)#*% ED6<;D 6B‘JK=BC;B7’，‘.)/’’=BG
‘.)/’’0‘JK=BC;B7’1/ :IHD6G? @C 3@8 / >@ /+
L：2M ’NNN 23% <=DO;D；*：早实亲本‘元丰’；
M：晚实亲本‘.)/’’；P：早实后代；5：晚实后代；
4：特异标记出现；%：特异标记未出现。
L：2M ’NNN 23% L=DO;D；*：4D;9@96@K? E=D;B>‘JK=BC;B7’；
M：M=>; <=>KD; E=D;B>‘.)/’’； P：4D;9@96@K? :IHD6G? @C 9D@??；
5：M=>; <=>KD; :IHD6G? @C 9D@??；4：L=DO;D ED;?;B>；%：L=DO;D =H?;B>8
结果表明，在该杂交群体的 "- 株早实后代中，
有 "Q 株扩增出 +,- HE 的 23% 条带，’ 株（+ 号、/NR
号）未出现该条带；在 -, 株晚实后代中，-’ 株未出
现该条带，" 株（’" 号、,R 号、S- 号）出现该条带。
共有 , 株表现为重组类 型，检 测 的 准 确 率 为
+,( +"T。在‘.)/’’0‘元丰’杂交 1/ 杂交群体中，
早实和晚实性状与标记 #$%&)#*%+,- 共分离（表
/）。#$%&)#*%+,-标记在‘ .)/’’0‘元丰’杂交 1/
群 体 中 与 核 桃 早 实 基 因 间 的 遗 传 距 离
为R( ’R 9L。 ! !
!" #$ %&’()%*’+,-标记在品种（系）中的检验
为进一步检测 #$%&)#*%+,-标记的稳定性和可
信度，利用 #$%&)#*% 引物对对核桃早实品种‘辽
/’、‘鲁光’、‘中林 "’、‘中林 ,’、‘扎 "R"’、‘西扶
’’、‘西林 ’’、‘西林 "’和晚实优系‘.)/’’的基因组
23% 进行了 4$& 扩增。结果发现，在这 - 个早实品
种中，有 S 个扩增出了 +,- HE 的特异条带（图 R 泳
道 /，" 5 -），而早实核桃‘鲁光’未能扩增出特异条
带（图 " 泳道 ’）；晚实优系‘ .)/’’上没有出现该条
带（图 R 泳道 +）。说明 #$%&)#*%+,-标记在核桃早
实栽培品种上也有较高的检出率。
!" .$ %&’( 标记回收、克隆与测序分析
从早实亲本‘绿园’的 #$%&)4$& 扩增产物中，
图 R! #$%&)#*% 引物对在栽培品种（系）
上的扩增结果
1678 R! #9:;<=>69 ?:@A6B7 23% CD=7<;B>? =#$%&)#*% ED6<;D 6B A=FBK> U=D6;>6;?（ 9F@B;?）
L：2M ’NNN 23% <=DO;D；/ 5 +：‘辽 /’，‘鲁光’，‘中林 "’，
‘中林 ,’，‘扎 "R"’，‘西扶 ’’，‘西林 ’’，‘西林 "’，‘.)/’’。
4：特异标记出现；%：特异标记未出现。
L：2M ’NNN 23% <=DO;D；/ 5 +：‘M6=@ /’，‘MK7K=B7’，
‘V:@B7F6B "’，‘V:@B7F6B ,’，‘V:= "R"’，‘W6CK ’’，
‘W6F6B ’’，‘W6F6B "’，‘.)/’’8 4：L=DO;D ED;?;B>；%：L=DO;D =H?;B>8
利用 23% 凝胶回收试剂盒，回收该特异目的片断，
电泳检测纯度和浓度后，将回收产物与质粒 4L2/-)
. 连接，转化大肠杆菌 XL/N+ 菌株感受态细胞，菌液
涂布到含 %预先涂布 ’N !M W)Z=F（,N <7·（’RN <7·菌落于 MY 液体培养基（含 %中回收质粒。电泳检测回收的特异片断，可以看出
与早实品种扩增出的特异片断相一致（图 , 泳道 R，
,）。利用提取的完整质粒，!"#&"和 $%&G#双酶切
可以切下插入的特异标记片断（图 , 泳道 /，’），用
L/" 系列引物 L/" 4D6<;D LR（ ,])Z.... $$$%Z
.$%$Z %$)"]）和 L/" 4D6<;D &^（ ,])$%ZZ%
%%$%Z $.%.Z %$)"]）做 4$& 检测，扩增出异常亮
的条带，都与特异片断相一致（图 , 泳道 "）。这证
明特异片段的回收和克隆准确。
23% 序列测定由上海博亚公司完成。测序结
果显示，标记 #$%&)#*%+,-片断长度为 +,- HE，与
&%42 标记 _4Y)N-+,-相一致，具体序列见 2‘QS"Q/R
（ :>>E： a a AAA8 B9H68 BF<8 B6:8 7@U a BK99@D; a
/N-S-RNS,）。进一步表明本研究将与核桃早实基
因相连锁的 &%42 标记 _4Y)N-+,-成功转化为 #$%&
标记。
"! 讨论
L69:;F<@D; 等（/++/）曾指出，对于整个基因组
作图，需要筛选大量的标记，并且这些标记与具体目
标性状的连锁程度较难确定，而选用与目标性状紧
密连锁的标记，对控制目标性状基因所在的区域进
+,
林 业 科 学 !" 卷 #
图 $# %&’( 标记片段的回收与重组
质粒酶切和 )&( 鉴定结果
*+,- $# ./012+3+452+61 63 704689+1512 :;5<8+/ 9= 70<27+42+61 01>=80
!"#(! ? $%&/" 51/ )&(
@：AB CDDD AE’ 857F07；GH 重组质粒；CH 重组质粒的酶切鉴
定结果；IH )&( 鉴定结果；!H 回收片断；$H %&’(J%K’ 引物对
在早实亲本‘绿园’上的扩增结果。
@： AB CDDD AE’ 857F07； GH (04689+1512 :;5<8+/； CH
(04689+1512 :;5<8+/ /+,0<20/ 9= !"#( ! ? $%&/ "； IH
(04689+1512 :;5<8+/ +/012+3+4520/ 9= @GI )7+807 @! 51/ @GI
)7+807 (L；!H %&’(J%K’M$N 857F07 7027+0O5;；$H *75,8012<
58:;+3+0/ 9= %&’(J%K’ :7+807 +1‘BP=Q51’-
行基因定位与作图，是比较省时省力和利用价值比
较高的策略。%&’( 标记一般是由 (*B)，(’)A，
’*B) 等标记转换而来，其基本原理是根据已获得
的标记片段的序列信息，设计 G 对长度为 CD 9: 左
右的特异引物，然后通过普通的 )&( 手段来揭示多
态性。在果树和林木上已有许多 AE’ 分子标记成
功转换为了 %&’( 标记。%&’( 标记在 %E) 位点寻
找、RSB 定位、基因克隆和分子辅助育种上有其独特
的优势（TU51 ’( )*-，CDDV；W5;0516 ’( )*-，CDDM）。姜
立杰等（CDD$）以桃（ +,-./)*01 2’31%")）品种“京玉”
和“美味”的正反交 "M 株 *G 群体为试材，利用引物
对 X*)M! ? X*)M$ 将与桃有毛 ?无毛性状相连锁的
(’)A 标记成功转化 %&’( 标记。任朝兴等（CDDV）
利用 (’)A 标记技术鉴定了番木瓜（4)3%" 2)2)-)）
雄性性状，并将 (’)A 标记成功转化为 %&’( 标记，
并命名为 %AJGDDD。贾彦利等（ CDDV）获得了梨
（5-301）矮化基因 2"67 的 G 个 %&’( 标记。吴松权
等（CDDV）建立了松茸（83%"9#*#,)）%&’( 标记。
本研究根据与核桃基因相连锁的 (’)A 标记
Y)XJDNM$N测序，在原有的 Y)XDN 随机引物及其互补
序列基础上，向内延长了 M Z GI 9:，设计了 %K’，
%KX C 对 %&’( 引物，以早实亲本‘绿园’和晚实亲
本‘绿丰’的基因组 AE’ 检测 C 对 %&’( 引物。结
果表明，%&’(J%K’ 引物对具有较好的稳定性（图
G），将该标记命名为 %&’(J%K’M$N。
为进一步检测该标记的稳定性和可信度，本研
究检测了 %&’(J%K’M$N标记在‘绿园’、‘绿丰’及
‘绿园’[‘绿丰’杂交组合 G$! 株 *G 后代群体中的
分离状况。结果表明，%&’(J%K’M$N与 (’)A 标记
Y)XJDNM$N在 *G 群体中的分离状况相一致（图 C，表
G）。还利用‘SJGC’、‘元丰’及‘ SJGC’[‘元丰’杂
交 *G 后代 GCI 株个体的基因组 AE’ 为模板，检测
%&’(J%K’M$N标记在‘ SJGC’[‘元丰’杂交 *G 后代
群体中的分离情况。虽然‘SJGC’[‘元丰’杂交 *G
后代群体中早实类型和晚实类型的分离比例不符合
G\ G的分离比例，但 %&’(J%K’M$N与核桃早实性状共
分离（图 I，表 G）。在部分核桃栽培品种（系）中，
%&’(J%K’M$N在 N 个供试品种的 V 个上出现，在 G 个
早实品种‘鲁光’和 G 个晚实优系‘ SJGC’上没有扩
增出条带。
对 %&’(J%K’M$N标记片断回收、克隆、测序，结
果发现，该标记序列为 M$N 9:，序列与 (’)A 标记
Y)XJDNM$N的 AE’ 系列相一致。
从 G 个杂交组合得到的标记能否在其他材料或
杂交组合中出现，这对于标记的适用性至关重要。
赵晓 彦 等（ CDDV）开 发 了 普 通 菜 豆（ 59)1’#*01
:0*.)3%1）抗炭疽病基因 %&’( 标记后，利用 GC 个菜
豆品种（鉴别寄主）评价了 %&’( 标记的可靠性和
实用性，认为抗病品种含有的抗病基因标记与品种
来源存在相关性。TU51 等（CDDV）在‘ *+0<25’苹果
第 V 连锁群中发现 了 对 苹 果 火 疫 病（ !37%&%)
),-*#:#3)）抗性贡献值高达 I!H I] Z !"H "] 的一些
主效 RSB 位点，将其中的 C 个 (’)A 标记转换成
%&’( 标记；家系分析表明，这些主效位点来自于
‘橘苹’苹果（‘&6^’< Y751,0 )+::+1’）；为了验证这
些位点在不同遗传背景材料中的稳定性，用感病材
料‘@+;_5’与抗性材料‘GCGV’的杂交组合和一些栽
培品种对标记和抗病性的分离情况进行了验证，结
果表明，具有该 %&’( 标记的位点的材料均具有较
高的抗性，而没有该标记的材料感病比较严重，证明
了该标记在不同遗传背景下的稳定性。本文研究的
结果表明，在‘绿园’[‘绿丰’杂交 *G 群体中，
%&’(J%K’M$N标记与核桃早实性状的遗传距离为
GH MM 4@；在‘SJGC’[‘元丰’杂交 *G 群体中，与核
桃早实性状的遗传距离为 !H C! 4@。在不同杂交群
体中，由于交换的存在，使得标记与早实性状的遗传
距离有所差异，但在不同的杂交群体中，%&’(J
%K’M$N和核桃早实性状共分离（表 G）。在部分早实
栽培品种中的 %&’(J%K’M$N标记也有较高的检出
率。这说明 %&’(J%K’M$N与核桃的某一主效早实基
D"
! 第 " 期 李伟波等：核桃早实基因的 #$%& 标记
因相连锁，而且在不同遗传背景下有较高的稳定性。
研究结果为核桃早实性状的分子辅助育种和核桃早
实基因的克隆奠定了基础。
参 考 文 献
贾彦利，王彩虹，田义轲，等 ’ ())*+ 梨矮化基因 ,-./ 的一个 #$%&
标记 ’ 园艺学报，"0（1）：23"2 4 23"0’
姜立杰，杨英军，张晓明，等 ’ ())3+ 桃果实有毛 5无毛性状的 #$%&
标记 ’园艺学报，"(（1）：2))" 4 2))*’
莫惠栋 ’ 2661+ 数量遗传学的新发展———数量性状基因图谱的构建
和应用 ’中国农业科学，(6（(）：7 4 21’
任朝兴，黄建昌，肖 ! 艳，等 ’ ())*+ 番木瓜雄性性别的 &%8. 和
#$%& 标记 ’果树学报，(0（2）：*( 4 *3’
王国安，张虎平，虎海防，等 ’ ())0+ 核桃早实性状相关联的 &%8. 标
记 ’果树学报，(2（3）：073 4 07*’
吴松权，管清杰，全雪丽，等 ’ ())*+ 松茸 #$%& 标记的建立 ’ 林业科
学，0"（2)）：23) 4 23"’
奚声珂 ’ 267*+ 我国胡桃属（ !"#$%&’ 9’）种质资源与核桃（ !"#$%&’
()#*% 9’）育种 ’林业科学，("（"）："0( 4 "06’
杨克强，马 ! 明，孙彩玲，等 ’ ())*+ 核桃（ !"#$%&’ ()#*% 9’）早实基因
的 &%8. 标记及其序列分析研究 ’ 中国农业科学，0)（6）：()(2
4 ()(*’
杨克强，王跃进，张今今，等 ’ ())3+ 用限制性酶切和 #:;<=>?@ 杂交对
葡萄无核基因分子标记的分析 ’农业生物技术学报，2"（"）：(60
4 (67’
杨克强，王跃进，张银东，等 ’ ())(+ 核桃早实性状的 &%8. 标记 ’ 园
艺学报，(6（1）：3*" 4 3*0’
杨文衡，张建光 ’ 267"+ 廿年来核桃科研的进展 ’ 河北农业大学学
报，1（2）：2 4 2"+
赵晓彦，王晓鸣，王述民 ’ ())*+ 普通菜豆抗炭疽病基因 #$%& 标记
鉴定 ’作物学报，""（22）：2723 4 27(2’
A?><:@ $，$:?@; .，$=?BC;B .， )+ %$’ ())0+ #:DEDF?G:H>@>IBI，
DB-?:,?:,EHEH>@>?E”/EK@;<
>I（ !"#$%&’ ()#*%）<=E< LK:/>? B@ OB> 8=GIB:K:HG，(0：0(3
! 0"3’
QEK>E@: $ R，Q:D>S N，&:J?BH;>S 9 N，)+ %$’ ())6+ $M9 T @;-K>EI>
JBH>I?G E@J DE?V>? J>O>K:,D>@< B@ -:DD:@
F>E@（,-%’).$"’ /"$#%(*’ 9’）’ $?:, #-B>@->，06："72 4 "60’
Q>?DEB@ M，.>K:?< W，XE@BO>-:-B:;I DE<;?B@H /EK@;<
,:,;KE@B? F>=EOB:;? B@ W?E@->’
%-，00(：7" ! 76’
X=E@ N %，.;?>K $ M，.;LLG A，)+ %$’ ())*+ .>O>K:,D>@< :L D:K>-;KE?
DE?V>?I KB@V>J <: <=>‘ WB>I H?:;, * DEZ:? [P9 L:? LB?>
FKBH=< ?>IBI E@J <=>B? E,,KB-E?\EIIBI<>J I>K>-Q>@:D> ，3)（1）：317 4 3**’
NB-=>KD:?> & ]，8E?E@ T，X>II>KB & Y’ 2662+ TJ>@?I
KB@V>J <: JBI>EI>\?>IBI H>@>I FG F;KV>J I>H?>HE@< E@EKGIBI：E
?E,BJ D><=:J <: J><>-< DE?V>?I B@ I,>-BLB- H>@:DB- ?>HB:@I FG ;IB@H
I>H?>HE! 67"(’
（责任编辑 ! 徐 ! 红）
21