全 文 ：第 !" 卷 第 # 期
$ % & % 年 # 月
林 业 科 学
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丛枝病植原体侵染对泡桐组培苗组织内
9$ e$ 产生的影响
!
田国忠6李6永6梁文星6朴春根6黄钦才6郭民伟
"中国林业科学院森林生态环境与保护研究所6国家林业局森林保护学重点实验室6北京 &%%%#&$
摘6要!6用保存的不同泡桐无性系染病和健康组培苗为试材!对染病苗’机械损伤’嫁接接种和健康组培苗组织
中 9$e$ 及过氧化物酶的变化进行研究% 用 @-?组织染色方法对 9$e$ 组织定位结果显示!在未损伤情况下多数
染病泡桐苗和健康苗 9$e$ 积累皆较少% 机械损伤后!病与健苗皆出现 9$e$ 过量积累!其中健苗强于病苗% 在维
管束部位!重症苗 fe@活性最强! 轻症苗次之!无症和健康苗活性较低# 而且所有苗在脉间叶肉组织 fe@活性都
明显低于叶脉组织% 用病接穗嫁接健康泡桐砧木的早期 "7 天以内$似乎与损伤反应类似 "包括 fe@和 9$e$ 产
生$# " 天后损伤反应减弱% 嫁接接种成功的组合至 $% 天!在嫁接接口处仍维持高的 9$e$ 释放和强 fe@活性!并
且砧木主茎和部分叶片出现系统性 fe@活性增强和 9$e$ 积累% 采用 l)A淀粉试剂对 9$e$ 组织定位结果显示&
在健株主茎切片中皮层和髓细胞表面’木质部成熟导管管壁有较强的 9$e$ 释放# 而病株的相应部位产生量较少%
在健康切片测定液中加入病主茎横切片可诱导健康切片 9$e$ 积累量增加% 用不同浓度的 9$e$ 处理染病泡桐丛
枝茎段外植体 & D! 在 $> _&%% JJ01).=&浓度范围内能明显缓解组培苗丛枝症状% 抗坏血酸和低通气环境处理也
有减轻病苗丛枝症状的作用% 不同泡桐品系在活性氧代谢上的差异与其对植原体的抗性存在密切关系%
关键词&6泡桐无性系组织培养# 丛枝病植原体# 过氧化氢" 9$e$ $# 过氧化物酶"fe@$# 组织定位
中图分类号! ’8"72&!666文献标识码!-666文章编号!&%%& =8!<<#$%&%$%# =%%#" =%#
收稿日期& $%%# =%7 =$%# 修回日期& $%%# =&% =%&%
基金项目& 国家自然科学基金项目"7%%8%"$$!7%<8$%$>$和国家级星火科技项目"国科发计字-$%%!.&!% 号$ %
! 本研究得到本所林英华副研究员在数据分析方面的支持!本学科组郑翠女士协助泡桐组织培养!特此致谢% 梁文星博士现在
@34LOSJ3ES0N?I0UD3JITSOPLER b013UH1LO?I010FP! cEIV3OTISP0NbILJI"B10OIRL77&%&!c’-$工作%
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J3UDLEIUL1Z0HER3R LER 4DPS041LTJLFOLNS=SOLETJIS3R SITTH3YUH1SHO3R 41LES13ST0NRIN3O3ES4LH10ZEILU10E3TZ3O3
IEV3TSIFLS3R HTIEFDITS0UD3JIUL1J3SD0RT59$e$ 10UL1IQLSI0E XP@-?TSLIEIEFJ3SD0R TD0Z3R SDLSSD39$e$ RIR E0S
TIFEINIULES1PLUUHJH1LS3R IE X0SD RIT3LT3R LER D3L1SDP41LES13ST0NIESLUS41LEST5-NS3OZ0HERIEFSO3LSJ3ES! X0SD RIT3LT3R
LER D3L1SDPSITTH3TIERHU3R 9$e$ LUUHJH1LSI0E! LER SD39$e$ IE D3L1SDPSITTH3TZLTJ0O3SDLE SD3RIT3LT3R 0E3T5fe@
LUSIVISPIE SD3VLTUH1LOXHER13T0NT3V3O3RIT3LT3R 41LESTZLTDIFD3TS! N010Z3R XPSDLS0N41LESTZISD 1IFDSTPJ4S0JT! LER
SD3E LTPJ4S0JLSIULER HEIEN3US3R 41LES13ST5b3T04DP10HTSITTH3TZLT10Z3Ofe@LUSIVISPSDLE SD3V3IET5-SSD33LO1P
TSLF3"ZISDIE 7 RLPT$ 0NFOLNS=IE0UH1LSI0E XPJ3LET0NIET3OSIEFIEN3US3R TUI0E 0ES0D3L1SDPTS0Uh! UDLEF3TIE SD3fe@
LUSIVISPLER 9$e$ U0ES3ESDLR TIJI1LO4LS3OE LTSD3J3UDLEIUL1Z0HERIEFO3LUSI0E! LER SD3T33N3USTX3ULJ3Z3Lh3O"
RLPT1LS3OLNS3OFOLNSIE0UH1LSI0E5,D3THTSLIEIEF9$e$ U0ES3ESLER DIFD fe@LUSIVISPZ3O3R3S3US3R LSSD3FOLNSHEI0E TIS3
LTZ31LTIE SD3TS0Uh IE $% RLPT40TSFOLNSIE0UH1LSI0E HTIEFIEN3US3R TUI0E ZDIUD L443LO3R ZISUD3T#YXO00JTPJ4S0J5
b0O30V3O! SD3TPTS3JLSIUIERHUSI0E 0N9$e$ LER fe@ZLTL1T0R3S3US3R IE SD3RITSL14LOST0NJLIE TS3J0OV3IET0NT0J3
13LV3T59$e$ 10UL1IQLSI0E XPJ3LET0Nl)ATSLOUD LTTLPO3V3L13R SDLSJ0O39$e$ ZLTN0HER IE SD3U31THONLU30NU0OS3[LER
4ISD LTZ31LT0E SD3ZL10NU0ERHUSSHX30N[P13JIE SD3D3L1SDPT3USI0E LER 13TT9$e$ ZLTN0HER IE SD3U0OO3T40ERIEF
6第 # 期 田国忠等& 丛枝病植原体侵染对泡桐组培苗组织内 9$e$ 产生的影响
SITTH3T0NRIT3LT3R 41LEST5MD3E SD3RIT3LT3R TS3JT3FJ3ESTZ3O3SO3LS3R ZISD RIN3O3ESU0EU3ESOLSI0E 0N9$e$ N0O& D0HO
LER SD3E IE VISO0UH1SHO3R 0E b’ J3RIHJ! ISZLTR3J0ETSOLS3R SDLSSD39$e$ IE $> S0&%% JJ01).
=& U0EU3ESOLSI0ETU0H1R
0XVI0HT1PO31I3V3TPJ4S0J0E SD3UH1SHO3R 3[41LEST5-TU0OXLS3LUIR LER 10Z1PL3OLSIEFUH1SHO3U0ERISI0ETL1T0TH44O3TT3R
TPJ4S0JR3V3104J3ES5(3OSLIE 4LH10ZEILU10E3TTD0Z3R T0J3RIN3O3EU3IE 9$e$ LUUHJH1LSI0E LER fe@LUSIVISPIE
O3T40ET3S04DPS041LTJLIEN3USI0E! ZDIUD JIFDS4O0XLX1PO31LS3S0SD3O3TITSLEU3TS04DPS041LTJLT5
:); <"(=/&641 34)(’UH1SHO3R 4LH10ZEILU10E3#ZISUD3T,YXO00J4DPS041LTJL# DPRO0F3E 43O0[IR3# 43O0[IRLT3# DITS010UL1IQLSI0E
66泡桐"<%;/’H14%$是原产于我国的重要速生用
材树种% 由植原体引起的泡桐丛枝病是我国泡桐上
的严重病害% 迄今!植原体病原尚未能人工培养!导
致植原体与寄主植物相互作用的研究一直是难点%
此前!已用发病组培苗和相应的健康对照苗测
定了病与健康苗在过氧化物酶"fe@$’吲哚乙酸氧
化酶")--e$’苯丙氨酸解氨酶"f-.$’多酚氧化酶
"ffe$等酶活性’激素和酚类物质代谢的差异 "田
国忠等!&##"# $%%&L# $%%&X# ,ILE ")%/5! &##>$% 对
其他植物的许多研究结果已显示& 活性氧爆发!包
括过氧化氢 "9$e$ $’超氧自由基 "e
(
)
$ $’羟自由基
")e9$是植物对环境应力的重要早期反应!与植
物的抗病反应’信号传导等有密切的联系"bIS13O")
%/5! &#### f3EF")%/5! &##$# ?01Z31")%/5! &##8#
.3VIE3")%/O! &##!# eO0QU0Y(LOR3ELT")%/5! &####
’HERLO3TLE ")%/5! &##># bHT3SI")%/5! $%%># 田国忠
等!$%%7$ % 但迄今在植物感染植原体后活性氧爆
发’对其他病理代谢的影响等方面!国内外相关研究
报道很少# 涉及泡桐树种本身的活性氧代谢研究也
一直是空白% 由于植原体不存在普通细菌的细胞壁
结构!也不能在人工培养基上培养!并专性寄生在植
物的韧皮部筛管系统内!能引起植原体病原特有的
丛枝和花器变态等症状!所以探讨植原体侵染对寄
主活性氧代谢的影响!对于深入了解植原体与泡桐
互作的早期信号识别’植原体致病机制和特点!泡桐
抗病性及药剂治疗研究等都具有特别重要的意义
"田国忠等!$%%7$%
本研究选用已表现典型丛枝病症状的多个无性
系泡桐丛枝病组培苗和健康组培苗为研究对象!研
究染病泡桐组培苗体内的活性氧代谢变化!了解其
在植原体与寄主互作过程中的地位和作用%
&6材料与方法
>D>?试验材料
泡桐丛枝病植原体"&"’O)Y@$株系来自山东兖
州% 泡桐健康组培苗包括无性系 m9! (%$%! ,C$,!
(&$>! K9! b?77!,7>Y%$< 等!感染植原体的病组
培苗包括 m@"m9的染病苗$! W,C$,@",C$,的染
病苗$!(&$>@"(&$>9的染病苗$!W77@"b?77 的
嫁接发病苗$! (<>Y%$<@"健苗 ,7>Y%$< 由此染病苗
经脱毒获得$等!所采用的基本培养基为普通未添
加激素的 b’ 培养基% 染病组培苗根据症状划分为
7 类& 重症苗"表现为严重丛枝’小叶’节间缩短’甚
至顶芽膨大白化!多无根分化$’轻症苗 "有明显的
腋芽分化!但叶片较大’节间较长’多有短根或毛细
根分化$和无症苗"由病苗具芽茎段培养出现的无
明显症状的近似健康组培苗$ ",ILE ")%/5! &##>!田
国忠等!&###$%
>DF?机械损伤和嫁接接种方法
机械损伤包括用止血钳夹伤叶片和针刺叶脉’
主茎’叶柄等损伤方式%
植原体接种采用泡桐组培苗嫁接传病试验方法
"田国忠等!&###$% 本试验用感染植原体的丛枝芽
为接穗嫁接到健康组培苗无性系砧木切口上!以健
康组培苗接穗嫁接作为对照%
>DC?过氧化氢#EFWF$组织定位
9$e$ 在植物叶片和幼茎中的定位测定按
,D0ORL1Y(DOITS3ET3E 等"&##8$报道的 7! 7, =二氨基
联苯胺"@-?$组织染色法并加以改进% 分别取组
培带根苗或截根后的地上部茎叶组织插入含
& JF)J.=&的 @-?溶液中!或将叶片的叶柄直接插
入 @-?溶液中!于正常培养条件下吸收 @-?< D 以
上!然后用 #>j乙醇煮沸 &% JIE 脱色!观察透明组
织中红褐色的 9$e$ 产生部位和强度!并照相记载%
另外!也试验了直接将叶片’茎段或整株完全浸泡到
@-?溶液中 $ _! D!然后再进行脱色处理%
9$e$ 产生量和组织切片定位测定根据 ?LOU310
等"$%%$$淀粉Al)显色的方法并加以改进% 徒手切
取 >%% ’J左右的厚切片 &%% 片!浸入& JJ01).=&抗
坏血酸溶液中 & JIE! 以去除内源 9$e$!用淀粉Al)
试剂于 $> ‘下温浴染色!测定$% D不加抗坏血酸和
加入抗坏血酸"& JF$后的 e@>8$差值来判断切片中
产生并溶解到溶液中 9$e$ 的浓度% 同时!将反应
后的切片取出置于载玻片上!用光学显微镜检查蓝
8#
林 业 科 学 !" 卷6
黑色 9$e$ 产生部位%
>@G?过氧化物酶#NW0$组织定位
过氧 化 物 酶 " fe@$ 定 位 测 定 按 ,D0ORL1Y
(DOITS3ET3E 等"&##8$报道的 @-?吸收法加以改进%
包括整株 @-?浸泡法’组织切段 @-?浸泡法和组
织切片染色 7 种方法% @-?的吸收方法同前!在经
吸收后溶液中加 !%% ’.7%j9$e$ 显色 &% JIE 左
右!然后用 #>j乙醇煮沸 &% JIE 脱色!观察红褐色
的 fe@产生部位% 切片用光学显微镜检查%
>DH?EFWF 和抗坏血酸处理病与健组培苗及培养
瓶密封
在超净工作台的无菌环境下!将病与健组培苗
具芽茎段"%2> _& UJ$用不同浓度的 9$e$ 水溶液
浸泡处理 & D!然后放入 b’ 培养基上于正常组培条
件下培养!或将茎段直接插入含有不同浓度 9$e$
的培养基上培养% 9$e$ 浓度为 &2> _$ J01).
=&%
定期观察外植体生长和病苗症状变化%
将 %2& 至$ %%% ’F).=&的抗坏血酸加入 >% ‘
左右未凝固的 b’ 培养基中混匀! 然后接种病或健
康组培苗茎段!进行组织培养和定期观察记载",ILE
")%/5! &##!$%
将接种过的病与健康组培苗茎段的培养瓶加盖
密封橡皮塞!并进一步用固体石蜡密封!以常规培养
方法为对照!观察记载组培苗变化%
$6结果与分析
FD>?染病泡桐丛枝病组培苗和健康苗 EFWF 和
NW0组织定位
本试验结果显示"图 &$!多数无性系健康苗’已
感病并表现典型丛枝症状的病苗!其培养基以上茎
叶在未有任何损伤和环境应力时!9$e$ 积累不明
显!表明正常生长的健康泡桐茎叶内未发生 9$e$
过度积累% 在组培苗根部能检测到少量 9$e$ 释
放!但例外的是无性系 (&$>9轻症苗 W&$>@体内
产生的 9$e$ 却明显强于重症苗’无症苗或健康苗!
这可能与此轻症苗体内仍持续进行的病菌扩展作用
及此无性系抗病特性有关"田国忠等!&###$%
fe@组织定位结果显示"图 $$!培养 7% 天以上
图 &6病与健泡桐组培苗 9$e$ 组织定位
BIF5&69ITS0UD3JIUL110UL1IQLSI0E 0N9$e$ IE SD3SITTH3T0NIEN3US3R LER D3L1SDP4LH10ZEIL41LES13ST41 34)(’UH1SHO3T0E b’ J3RIHJ
L2健苗 m9无性系叶部 9$e$ 积累不明显 ,D3D3L1SDPU10E3m913LV3TZISD 1IS139$e$ LUUHJH1LSI0E IE SD3IESLUS13LV3T#
X2健苗 b?77 无性系 ,D3D3L1SDPU10E3b?77# U2健苗 (&$>9! 随机夹伤造成局部 9$e$ 积累"箭头所指$ ,D3D3L1SDP(&$>9!
LU3OSLIE 9$e$ 4O0RHUSI0E LSSD3OLER0JIEnHOPTIS3XPSD3D3J0TSLS"-OO0ZT40IES$ # R2完整病苗叶片 m@9$e$ 积累不明显
,D3IESLUSIEN3US3R m913LV3TZISD0HSR3S3USLX139$e$ LUUHJH1LSI0E5
表现典型丛枝症状的多数无性系染病组培苗!在地
上部茎叶内酶活性显著高于相应的健康对照!其中
病苗主茎中部相对伸展病叶主脉和支脉的红褐色
fe@着色最为明显% 健康和染病苗根部 fe@活性
皆强于茎叶部位% 在健叶脉间的叶肉组织常出现弱
的不规则的 fe@活性区域% 重症苗叶脉着色深’粗
或有放射状脉间染色!甚至整叶着色# 在轻症苗上
不同部位的叶片间 fe@活性有差异!有时在同一叶
片叶脉上的 fe@活性也不均匀% 在多数无性系无
症苗的叶脉中 fe@活性较弱!接近其相应的健康对
照苗!说明维管束部位的 fe@活性强弱与症状的严
重程度呈明显正相关性%
同时!在不同无性系间微管束部位的 fe@活性
也存在一定差异!其中 ,C$,和相应病苗 W,C$,@
活性最强!m9 和 m@!b?77,和 W77@中等!而
(&$>9和 W&$>@则较弱%
将主茎切片放入 @-?溶液并加 9$e$ 定位
fe@!发现 fe@活性主要定位在表皮组织和微管束
部位!病苗韧皮部到形成层的区域为活性较强部位%
虽然病株梢部组织的皮层细胞膨大明显!但维管束
细胞并未有明显增大% 纵切片可见韧皮部束状深色
细胞呈不规则长线管状和向形成层扩散现象% 在健
株主茎基部表皮及微管束内 fe@活性皆强于梢部!
但病株则以梢部活性强于基部%
<#
6第 # 期 田国忠等& 丛枝病植原体侵染对泡桐组培苗组织内 9$e$ 产生的影响
图 $6病与健康泡桐组培苗 fe@组织定位
BIF5$69ITS0UD3JIUL110UL1IQLSI0E 0Nfe@IE SD3SITTH3T0NIEN3US3R LER D3L1SDP4LH10ZEIL41LES13ST
L5病苗 W,C$,@,D3IEN3US3R W,C$,@!LY&5重症苗!深色叶脉 fe@活性高 ,D3T3V3O3TPJ4S0JTTD0ZIEFDIFD fe@LUSIVISI3TZISD R334YU010HO3R
13LNV3IE!LY$5无症苗 ,D3LTPJ4S0JLSIU41LES13STIERIULSIEF13TTfe@LUSIVISI3TZISD T1IFDSYU010HO3R 13LNV3IE# X5健苗 ,C$,!叶脉色浅!
但脉间不规则着色 ,D3D3L1SDP,C$,ZISD T1IFDSU010HOIE SD313LNV3IE! XHSDLVIEFIOO3FH1LOU010HOIQ3R LO3LTLTIES3OV3IET5
F@F?机械损伤对组培苗 EFWF 积累的影响
泡桐叶片’叶柄或茎部用针刺或用止血钳夹伤
&$ _$! D 后!可在损伤部位检测到 9$e$ 积累!其中
健康组培苗叶片 9$e$ 的累积量明显高于病苗"图
7$# 但无性系 ,C$,健苗在损伤部位产生 9$e$ 却
明显少于 m9% 机械损伤可调节活性氧代谢相关酶
基因的表达!损伤诱导局部 9$e$ 积累程度的差别
可能与品种遗传特性或植株生理状态有关"(D30EF
")%/O! $%%$# mD0H ")%/5! &###$% 由于已知染病苗
fe@活性明显高于健苗! 这也进一步表明病与健苗
体内 fe@ 活 性 不 是 @-? 法 测 定 9$e$ 的 限
制因子% 66
图 76机械损伤对病与健康组培苗 9$e$ 释放的影响
BIF576,D3F3OE3OLSI0E 0N9$e$ IE SD313LV3T0NIEN3US3R LER D3L1SDP4LH10ZEIL41LES13ST41 34)(’UH1SHO3R IE O3T40ET3S0Z0HERIEF
L5健康 m9主茎切口损伤!箭头指 9$e$ 积累部位 ’S3JUHSZ0HERIEFSO3LSJ3ES0ND3L1SDPU10E3m9!LOO0ZT40IESS0SD3TIS3T0NTSO0EF
9$e$ F3E3OLSI0E# X5m9叶片夹伤 m913LV3TZLTZ0HER3R 43O43ERIUH1LOS0SD3JLIE V3IE XPUOHTDIEFZISD LD3J0TSLS# U5m9未损伤
cEZ0HERIEF# R2病苗损伤处理!病苗 m@未损伤"左$ !病苗 m@夹伤"右$ !病株损伤诱导 9$e$ 积累少 M0HERIEFSO3LSJ3ES0NIEN3US3R
41LES13STm@! HEZ0HERIEF" 13NS$ ! UOHTDIEFSO3LSJ3ES0N13LV3T"OIFDS$ !13TT9$e$ F3E3OLSI0E IERHU3R IE Z0HERIEFRIT3LT3R 41LES13S5
F@C?嫁接接种植原体过程中 EFWF 和 NW0变化
将携带植原体的病组培苗接穗插接在健康泡桐
苗砧木上!嫁接 7 天后!所有组合在接口处"接穗楔
形削面和砧木切口$都产生程度不同的 9$e$ 局部
积累"局限于伤口表面部位$% 个别组合 "m9Ym@$
也出现沿砧木接口向茎基和侧枝延伸的红褐色组
织!并出现个别远离接口叶片的叶柄和叶脉 9$e$
释放现象!可能是损伤或病菌诱导了微管束内 9$e$
的系统性累积% 嫁接 " _8 天后多数组合在砧木接
口处的 9$e$ 产生量有减弱趋势!但仍明显高于未
损伤部位% 此时 ,C$,接口 9$e$ 释放降低明显!但
(&$>9在砧木接口 9$e$ 积累却仍较明显%
在正常组培条件下!引起健株无性系砧木开始
显症的时间一般要在成功嫁接后 $> 天左右"田国
忠等!&###$% 本次试验组合 b?77Ym@在嫁接 $& _
$> 天"图 !$其砧木已开始表现丛枝症状% $% 天后
在砧木接口处检测到很明显的 9$e$ 过量积累! 并
出现向下延伸!但原病接穗 9$e$ 产生却不明显%
相反!在接活但未发病组合和在嫁接后数小时内病
接穗从砧木接口脱落的组合!其 $% 天后的砧木接口
处 9$e$ 积累已不明显% 而用自体健枝作接穗嫁接
自体砧木对照 "将健枝从主茎中部截断!梢部作接
穗再嫁接到原株主茎上$!接口处 9$e$ 产生量也微
弱% 由此判断!嫁接 $> 天左右在接口处 9$e$ 的释
放主要应是植原体与泡桐组培苗砧木专化性互作的
结果% 另外发现!在接口愈伤组织分化能力强的无
性系!比如 m9’(%$%!愈伤组织中一直检测到较强
9$e$ 积累%
用 @-?直接浸泡嫁接组合 ! D!然后加入 9$e$
显色反应 $% JIE 来定位组织内 fe@活性% 结果显
示!嫁接后 7 _! 天砧木切口部位 fe@活性明显高
于其他部位!部分砧木有沿接口向上或向下延伸性
##
林 业 科 学 !" 卷6
图 !6泡桐病组培苗接穗嫁接健康砧木接种对相关组织 9$e$ 释放和 fe@活性的影响
BIF5!6*N3UST0NFOLNSIE0UH1LSI0E 0E D3L1SDPTS0UhTZISD 4DPS041LTJLYIEN3US3R 4LH10ZEILTUI0ETHER3OTS3OI13SITTH3
UH1SHO3U0ERISI0ET0E 9$e$ F3E3OLSI0E LER fe@LUSIVISPIE LN3US3R SITTH3T
LYU2为组培苗嫁接 $> 天后砧木开始表现丛枝症状组合"L$ ’砧木未发病组合 b?77Ym@" X$及自体健康接穗嫁接组合 b?77Yb?77"U$ % L
S0UTD0ZSD3L44LO3EU30NIE b?77Ym@ZISD ZISUD3T, XO00JTPJ40S0JT"L$ ! SD3TS0Uh RIT41LPIEFE0TPJ4S0JT" X$ LTZ31LTT31NYFOLNS0Nb?77Y
b?77"U$ $> R 40TSFOLNS5RYN为 9$e$ 定位结果! R 为 L处理!3为 X 处理!N为 U处理% R S0NTD0ZSD310UL1IQLSI0E 0N9$e$ ! R O34O3T3EST
SO3LSJ3ESL! 3O34O3T3ESTSO3LSJ3ESX! NO34O3T3ESTSO3LSJ3ESU% F和 D 为 fe@定位结果!F为 L处理丛枝砧木叶片! D 为 U处理叶片和茎段% F
LER D TD0ZSD3fe@10UL1IQLSI0E! FO34O3T3ESTSO3LSJ3ESL! SD313LV3T0NTS0Uh! D O34O3T3EST13LV3TLER TS3JT3FJ3ES0NSO3LSJ3ESU2箭头示嫁接
接口及 9$e$ 积累部位% -OO0ZT40IESS0SD3FOLNSHEI0ETLER 4LOST0N9$e$F3E3OLSI0E5
fe@活性增高区域!延伸长度在上下 & UJ范围
之内%
在病接穗内!仍维持强的 fe@活性!其切口处
与其他部位相比未有明显增强% 嫁接成活株’掉接
穗株和未嫁接病接穗而仅做切口损伤的对照处理间
所导致的切口 fe@局部增高似乎无明显的差别%
此期间机械损伤对 fe@的基因的诱导表达可能占
主导地位%
在嫁接 8 天后!某些无性系在接穗脱落的砧木
切口长出愈伤组织部位维持强的 fe@活性% 嫁接
$& _$> 天已开始表现出发病症状"腋芽萌生! 组织
切片经 @-f)荧光显微镜检查证明植原体的存在$
的组合 b?77Ym@!接口及近接口主茎部位 fe@活性
最强!在染病砧木中部腋芽萌生的短小茎叶内 fe@
活性更明显!中部较大叶片的叶脉活性也增强% 而
健康对照嫁接苗的叶片’叶柄 fe@活性明显低于嫁
接发病苗%
图 >6l)A淀粉显色法定位泡桐病与健组织切片中的 9$e$ 释放
BIF5>69$e$ F3E3OLSI0E 0NRIT3LT3R LER D3L1SDPSITTH3T3USI0ETR3S3OJIE3R XPl)ATSLOUD LTTLP
L!X2K9健株主茎切片!反应液中加 W,C$,@病切片显色 &# D 后观察结果"L$ ! K9健株切片中加健切片 ,C$," X$ ,D3D3L1SDP
K9JLIE TS3JT3USI0E! RIT3LT3R W,C$,@T3USI0ETZ3O3LRR3R IES0O3LUSI0E T01HSI0E"L$ 0OD3L1SDP,C$,T3USI0ETZ3O3LRR3R" X$ #
U2(&$>9健切片 ,D3D3L1SDP(&$>9T3USI0E# R2W&$>@病切片 ,D3RIT3LT3R W&$>@T3USI0E5箭头示木质部!深色部位表示
9$e$ 积累明显 -OO0ZT40IESS0SD3[P13J4LOSTZISD R334YXO0ZE3R LO3LTIERIULSIEFRITSIEUS9$e$ LUUHJL1LSI0E
F@G?病与健苗主茎切片 EFWF 释放
采用 l)A淀粉试剂对切片组织内 9$e$ 定位研
究结果显示 "图 >$! 在放入试剂溶液 $% D 左右!健
株横切片皮层和髓细胞间隙’木质部成熟导管管壁
%%&
6第 # 期 田国忠等& 丛枝病植原体侵染对泡桐组培苗组织内 9$e$ 产生的影响
出现的 9$e$ 释放较强!病株的相应部位 9$e$ 产生
较少% 切片上 9$e$ 的产生可能是切口损伤或溶液
渗透势变化诱导作用的结果%
不同无性系健康组培苗间在损伤后 9$e$ 产生
的强弱有差别!依次为 K9$(%$% :(&$> :m9:
,C$,% 另外!用 @-?溶液浸泡离体损伤叶片 ! D 以
上后!由于叶片产生 9$e$ 释放!浸泡溶液会逐渐变
为红色!故溶液颜色在一定程度上可反映 9$e$ 的
释放量% 其中!W&$>@的 9$e$ 产生和释放最为
明显%
在健康切片测定液中加入病组培苗切片!然后
于 $> ‘下测定加入病切片 &# 和 !> D 后切片上和
释放到溶液的 9$e$ 量% 初步的测定结果发现病苗
茎段切片的加入"每 <% 片健康苗切片加 $% 片染病
苗切片!对照为 $% 片健康苗切片$具有增加健康切
片的 9$e$ 的产生量的趋势% 从切片释放到溶液中
的 9$e$ 的量也相应增加%
由于植原体存在于泡桐筛管中!从横切片筛管
断面会释放出一定量的植原体细胞和破碎细胞内含
物!这些病菌组分很可能会与健康切片特定部位发
生识别或结合!从而特异性激发健株细胞 9$e$ 代
谢作用% 在植原体未能人工培养的情况下!此方法
可能会成为研究植原体与寄主植物互作关系的一种
新的有效手段%
FDH?EFWF对组培苗症状影响
用 9$e$ 溶液处理 %2> _& UJ发病组培苗泡桐
具芽茎段 & D!然后将茎段放在 b’ 培养基上!于光
照条件下培养% 从表 & 中可以看出!低浓度范围的
9$e$ 处理"&2> _&$2> JJ01).
=& $可明显抑制病苗
的株高生长!丛枝症状与对照处理无显著差别% 而
较高浓度 9$e$"$> _&%% JJ01).
=& $则对病苗症状
产生了抑制作用!表现为丛枝症状减轻’生根株增
多# 而且!株高生长有恢复的趋势"表 &$%
表 >?EFWF 处理病苗 a0茎段 > ,后对组培病苗生长和症状的影响
!
4-9@>?4,))11).’/"1’()-’A)*’"1=#/)-/)=a0/’)A/)3A)*’/<#’,=#11)()*’."*.)*’(-’#"*"1EFWF 1"(> ,
"*’,))OB$-*’3("<’,-*=/;AB’"A=)7)$"BA)*’
9$e$ 处理浓度
9$e$ U0EU3ESOLSI0EA
"JJ01).=& $
株数
+HJX3O0N
41LES13ST
平均株高)
b3LE D3IFDSAUJ
生根株数
+HJX3O0NO00SIEF
41LES13ST
症状严重度
’3V3OISP0NZISUD3T,Y
XO00JTPJ4S0JT
枯死株数
+HJX3O0NR3LR
T3FJ3EST
% !< &5"" s%5>$ L > 中至重 bI1R S0T3V3O3 %
&2>% &7 %5#8 s%57! UR % 中至重 bI1R S0T3V3O3 %
72&7 $$ &5&$ s%57# XUR % 中至重 bI1R S0T3V3O3 %
"2$> $> &5!% s%5!8 LX 7 中至重 bI1R S0T3V3O3 %
&$2> &! &5$< s%57< XUR 7 中至重 bI1R S0T3V3O3 %
$> &> &5$> s%5>& XUR 7 中 bI1R %
>% &8 &57" s%5!& LXU < 中 bI1R %
&%% $8 &5"# s%5>> L < 轻至中 .IFDSS0JI1R %
& %%% # %5#> s%57> R & 轻至中 .IFDSS0JI1R* 7
66! 在 b’ 培养基上培养 $$ 天的调查结果 ,D3O3TH1STLNS3OUH1SHOIEFN0O$$ RLPT0E b’ J3RIHJ5) 株高为平均值 s标准偏差!@HEULE 多重比
较法! L=X 表示平均株高差异性"<*%2%>$ % 93IFDSITJ3LE sTSLERLOR R3VILSI0E! @HEULE JH1SI413OLEF3S3TS! L=R TD0ZTIFEINIULESRIN3O3EU3LS<
*%2%>5* 叶片微黄!部分株基部茎叶枯 ’1IFDSP310ZIEF13LV3T! T0J3XLTL113LV3TR3LR5
66在 & 周内!& %%% JJ01).=&以上的高浓度 9$e$
会导致健康泡桐茎叶全部枯死!组织褪绿呈漂白状%
而感染植原体的 # 个丛枝外植体茎段在此浓度下仅
有 7 个枯死!7 个基部茎叶枯死而上部茎叶仍为黄
绿色!且有一株生短根芽% 而且较低浓度的 9$e$
也会引起健株成熟叶片叶柄至主脉出现水浸状褐化
坏死% 这说明染病外植体对 9$e$ 的耐受浓度明显
高于健株%
F@Q?低透气环境和抗坏血酸处理对病与健康组培
苗生长的影响
低浓度抗坏血酸可促进健株组培苗生根!高浓
度则抑制根生长% 在 %2! _&%% ’F).=&范围内抗坏
血酸具有缓解和抑制 W77@!m@等无性系病苗丛枝
症状发展的效应!表现为叶片增大’节间伸长及根芽
分化# 但病株需要较高浓度的抗坏血酸才能诱导根
芽分化% 当培养基内抗坏血酸浓度达到 &%% ’F)
.=&时!部分苗开始出现叶片变黄现象% 当浓度达
到 & JF).=&时!转接的外植体在 $% 天内枯死!而在
$ JF).=&时转接的外植体在数天内即完全枯死%
在茎段组培时!用不透气的塑料膜代替常规透
气棉塞!及在严格的密封条件下!接种病与健组培苗
茎段于三角瓶中! 结果显示!低透气环境会促使病
苗叶片增大’节间伸长及根分化’存活时间延长等症
状减轻的现象% 密闭瓶内病株叶片 fe@活性主要
集中在于叶脉组织!而透气瓶内病叶 fe@除叶脉外
脉间叶肉组织内活性也比不透气瓶活性强"图 "$%
&%&
林 业 科 学 !" 卷6
已知在低氧条件下"%2&j _%27j$!细胞质抗坏血
酸 fe@基因表达受到抑制!活性氧形成下降!9G细
胞死亡减弱"bIS13O")%/O! &##"# &###$% 因而可能
是氧气交换不足能抑制病原诱导的活性氧爆发!以
及进一步诱致 fe@A)--e活性下降和内源生长素
吲哚乙酸")--$水平回升%
图 "6密闭瓶培养对感染植原体组培苗症状和 fe@活性的影响
BIF5"6*N3US0NT3L13R SITTH3UH1SHO3N1LThT0E SD3TPJ4S0JTLER SD3fe@LUSIVISPIE 13LV3T
左为密闭瓶中健叶 ,C$,fe@定位!整叶 fe@活性低!中为透气瓶中病叶 W,C$,@!fe@活性很高!右为密闭瓶中病叶 W,C$,@!fe@
活性低于透气瓶% .3NSTD0ZTSD3D3L1SDP13LNfe@10UL1IQLSI0E NO0JT3L13R N1LTh 41LES13STZISD 13TTfe@LUSIVISPIE ZD01313LN! JIRR13
TD0ZTSD313LNfe@10UL1IQLSI0E NO0JRIT3LT3R 41LES13SUH1SHOIEFIE L3OLSIEFN1LTh ZISD V3OPTSO0EFfe@LUSIVISP! OIFDSTD0ZTSD3RIT3LT3R
41LES13SUH1SHOIEFIE T3L13R N1LTh ZISD R3UO3LTIEFfe@LUSIVISPU0J4LO3R S0SD341LES13STIE L3OLSIEFN1LTh5
76讨论
机械损伤诱导染病泡桐组培苗和健康组培苗
9$e$ 过度积累!其中健苗产生量明显强于病苗% 而
植原体侵染早期! 即从病菌侵染至症状表达期间可
能发生着类似机械损伤诱导 9$e$ 过度积累现象%
当病菌成功地侵入砧木组织后"$% D 左右$才出现
系统性 9$e$ 积累% 而一旦病菌在植株体内成功定
殖并大量繁殖和引起典型丛枝症状之后!一般感病
无性系的 9$e$ 的积累量’及再受损伤时 9$e$ 的产
生能力反而下降%
活性氧作为生物体内普遍产生的’对生命活动
至关重要的物质!既具有信号传导和调控基因表达
与细胞内代谢的功能!也会对生物产生损伤等多重
作用"方允中等!$%%8$# 而在植原体与泡桐寄主互
作关系中!活性氧可能既有对病菌膜和 @+-的损伤
而起到对病菌生长和繁殖产生抑制的作用!也会通
过激发植物抗病性反应或代谢途径的改变而产生的
抗病或致病反应!这些作用的强弱与活性氧产生的
进程和强度密切相关% 之前的研究已经发现植原体
侵染导致泡桐体内 fe@和 )--e活性的明显升高!
而且这种变化可能与寄主体内生长素 )--的氧化
分解和丛枝症状的表达有密切联系% 本研究进一步
证明感染植原体的组培苗体内 fe@活性的明显增
高发生在病菌定殖的微管束系统内!与植原体侵染
引起韧皮部 fe@活性的增加及植原体寄生部位专
化特性相吻合% 据此推测!植原体侵染"介体昆虫
刺吸传毒$可能首先诱导了寄主受影响部位的 9$e$
等物质的非正常积累!进一步导致相应组织细胞内
fe@和 )--e基因的过量表达和氧化游离 )--!进
而导致维管束形成层分生组织细胞内 )--浓度降
低和丛枝病症状的形成 ",ILE ")%/5! &##>!田国忠
等! &##"# $%%&L# $%%&X$% 从目前的研究结果看!
泡桐体内特别是微管束内 fe@活性的升高主要应
是植原体诱导泡桐 fe@基因过量表达的结果!但从
最近动物菌原体 "F#.’D/%,5% 0%/4,"D)4.;5$研究结
果分析!也不能排除植原体起源的 fe@的存在和作
用"k3EhIET")%/O! $%%<$%
本试验也发现!机械损伤’因溶液浓度改变及材
料处理不及时而导致的叶片脱水或脱落’病菌侵染
都可诱导泡桐组培苗局部组织 9$e$ 释放% 除嫁接
接种外!9$e$ 产生部位与病菌直接作用部位似乎无
必然联系% 因而推断!植原体侵染的"介体昆虫刺吸
传毒$早期反应首先是损伤或毒素诱导了 9$e$ 的
非特异性积累# 局部高浓度的 9$e$既会对植原体
的繁殖产生广谱性抑制作用"f3EF")%/5! &##$$!同
时也会进一步诱导相应部位组织细胞内比如 fe@
等致病或抗病相关基因的表达! 以及过敏性细胞坏
死等抗病反应 ".3VIE3")%/5! &##!# MH ")%/O!
&##8$% 成功定殖的植原体在侵染初期"$% 天以内$
很可能也发生与寄主专化性作用而诱导产生 9$e$
的特异性积累过程",LELhL")%/5! $%%7# MH ")%/5!
&##8$% 笔者用间苯三酚A盐酸染色法测定病与健
组培苗茎部木质素结果显示!健株初生木质部导管
壁有典型的紫红色木质化# 韧皮部筛管及其他细胞
壁木质化现象不明显% 而病株不仅导管分化少!而
且导管的木质化程度也明显低于健株 "结果未显
示$% 因而!植原体诱导的微管束部位 fe@活性的
$%&
6第 # 期 田国忠等& 丛枝病植原体侵染对泡桐组培苗组织内 9$e$ 产生的影响
增高可能与生长素的氧化分解关系最为密切!而与
木质素的积累联系较小 "田国忠等!&##"# ,ILE ")
%/O! &##>$%
根据本研究结果分析!不同遗传背景的泡桐无
性系间对机械损伤和病菌侵染后造成活性氧爆发的
程度和方式上的差异!既与泡桐本身的遗传和生长
特性有关!也可能与无性系对病菌抵抗能力强弱有
密切 联系 "fLOh3O! $%%%# mD0H ")%/5! &####
9HUh31D0O3E ")%/5! &##<# -1VLO3Q")%/5! &##<$% 根
据田间自然抗性表现和嫁接接种抗性鉴定结果来看
"部分结果未发表$!本研究所采用的泡桐试材中!
(&$> 和 K9为抗病品系!其他为感病品系"田国忠
等! &##$# &###$% 像 (&$> 品系在感染植原体后表
现出较高 9$e$ 产生能力!可能发挥着抑制病菌生
长和繁殖或起到进一步诱导抗病反应的作用%
已知抗坏血酸过氧化物酶通过作用于抗坏血酸
而具有清除过量 9$e$ 作用! 并且抗坏血酸可抑制
fe@活性! 所以!染病泡桐组培苗补充抗坏血酸后
可能是通过清除过量的活性氧或抑制体内 fe@活
动而逆转由病菌侵染引起的 )--的氧化分解和缓
解丛枝症状的 ",ILE ")%/5! &##># f3hh3O")%/O!
$%%$# GHXIETS3IE ")%/O! &##7# W3XDLOR! &#<$# ,ILE
")%/O! $%%!$ % 巨关升等"&##"$对不同泡桐品种对
丛枝病抗性与抗坏血酸含量的关系的研究显示!抗
性强的品系抗坏血酸含量高于感病品系!同一品系
的健株叶片含量也高于病叶% 这一结果与本研究用
抗坏血酸处理病组培苗可以减轻丛枝症状和抑制
fe@活性的结果相吻合% 因而推断!泡桐抗氧化能
力’活性氧爆发方式与程度以及相关的酶基因的表
达水平皆与无性系或品种的抗病’耐病’症状的严重
程度等存在密切的联系"?01Z31")%/5! &##8$%
泡桐丛枝植原体除影响 9$e$ 变化外!笔者的
研究结果也显示了 e
(
)
$ 在泡桐与植原体互作关系中
发挥重要作用!进一步系统测定和比较不同泡桐品
种间的各类活性氧代谢的差异和关键酶基因特性有
可能找到与品种抗性相关的抗病性鉴定指标!为泡
桐定向抗病育种鉴定良好的基础% 在植原体未能人
工培养的情况下!本研究在活性氧研究方法上!尝试
将病组培苗切片加入健康切片测定液中!测定病切
片释放的植原体细胞和破碎细胞内含物对寄主特异
性激发作用可能不失为研究植原体与寄主植物互作
关系的一种新的途径% 通过电镜观察’免疫或组织
化学方法获得更为准确的植原体侵染对寄主活性氧
和相关酶的亚细胞定位和基因表达信息"bHT3SI")
%/O! $%%>$%
参 考 文 献
方允中!郑荣梁5$%%85自由基生物学的理论与应用5北京& 科学出
版社!&$% =&>#5
巨关升! 王6蕤! 周银莲! 等5&##"5泡桐丛枝病的抗性与维生素 (
关系的研究5林业科学研究! #"!$ & !7& =!7!5
田国忠! 李6永! 梁文星5$%%75感染植原体的泡桐丛枝病组培苗
和健康苗体内 9$e$ 的测定5云南农业大学学报! &< "!$ & &"%
=&"&5
田国忠! 李怀方! 裘维蕃5$%%&L5植物过氧化物酶研究进展 武汉植
物学研究! &#"!$ & 77$ =7!!5
田国忠! 张锡津! 罗6飞! 等5&###5抗病和感病泡桐无性系组培苗
对嫁接传染植原体的不同反应5林业科学! 7>"$$ & 7& =7#5
田国忠! 张锡津! 罗6飞5&##"5抗病与感病泡桐感染 b.e后过氧
化物酶和 )--氧化酶变化比较5林业科学研究! #"b*b$ & !8
=>$5
田国忠! 朱水芳! 罗6飞! 等5$%%&X5根癌农杆菌对感染植原体的
泡桐组培苗症状的影响5林业科学研究! &!"7$ & $>< =$"!5
-1VLO3Qb *! f3EE31G)! b3In3Ofk!")%/5&##<5G3LUSIV30[PF3E
IES3OJ3RILS3T J3RILS3R L TPTS3JIU TIFEL1 E3SZ0Oh IE SD3
3TSLX1ITDJ3ES0N41LESIJJHEISP5(31! #$& 887 =8?LOU310-G! f0JLOB! .043QY’3OOLE0b! ")%/5$%%$5@3V3104J3ESL1
O3FH1LSI0E 0NSD39$e$Y4O0RHUIEFTPTS3JLER 0NLXLTIU43O0[IRLT3
IT03EQPJ3IE SD3W4114% "/"0%1,1IFEINPIEF[P13J5f1LESfDPTI01
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O3LUSIV30[PF3E T43UI3TIE 41LESR3N3EU3=LXO0LR 43OT43USIV35
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林 业 科 学 !" 卷6
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U0J40E3ESTLER O013IE 41LES4O0U3TT3T5-EEH G3Vf1LESfDTI01b01
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’HERLO3TLE b! CH mK! B3OOLET/k! ")%/O&##>5G3oHIO3J3ESN0O
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& LER f?m&! XHSE0S0N.eKIE OIU35b01f1LESYbIUO0X3)ES3OLUS!
&"& !$$ =!$<5
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XLO13PY40ZR3OPJI1R3Z IES3OLUSI0E5,D3f1LESk! && " " $ & &&<8
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!责任编辑6朱乾坤"
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