全 文 ：　　收稿日期: 2000-08-25
基金项目: 国家林业局森林保护学重点实验室基金资助项目( 1998～2000)
作者简介: 田国忠( 1963-) ,男,山东莒县人,副研究员,博士.
* 本研究得到中国林科院刘惠珍、张锡津先生,中国农科院生物技术中心李汝刚博士,农业部植物检疫实验所张作芳、
张成良老师、黄文胜和吴志明等同志的帮助,特此致谢.
　　文章编号: 1001-1498( 2001) 03-0258-07
根癌农杆菌对感染植原体的泡桐
组培苗症状的影响*
田国忠1 , 朱水芳2, 罗　飞1, 李怀方3 , 裘维蕃 3
( 1.中国林业科学研究院 森林生态环境与保护研究所,北京　100091;
2.农业部 植物检疫实验所,北京　100029;　3.中国农业大学 植物保护学院,北京　100094)
摘要: 采用含有激素合成相关基因的根癌农杆菌, 伤口接种已感染植原体的泡桐丛枝组培苗和健
康组培苗, 结果发现对丛枝苗的致瘤能力明显低于健康对照苗, 且被接种病苗的丛枝症状缓解。从
健苗获得的 T -DNA 转化泡桐瘤组织细胞能在无激素培养基上稳定生长和连续继代培养 2 年以
上, 说明瘤组织细胞自身已获得了细胞分裂素和生长素合成能力。根据已报道的根癌农杆菌株系
pT il 5955 T -DNA 的异戊烯基转移酶基因( ip t)的保守序列 ,设计了一对引物 ( CYT 和 CYT′) ,用
多聚酶链式反应( PCR)扩增了我国杨树致瘤农杆菌 ip t 基因部分序列( 427 bp 片段) ,也从遗传转
化的两个泡桐无性系瘤组织 At -ZH 和 At-T 35 扩增出此特异片段,从而进一步肯定了 T -DNA 已
被整合到泡桐的染色体上,表明泡桐易于通过 T i质粒载体途径进行基因转移操作, 但用此引物未
能从泡桐、甘薯健株和感染植原体的组培病苗扩增出相应的 427 bp 特异片段。当用此遗传转化瘤
组织嫁接病苗时, 可减轻丛枝症状的严重度,延长病苗的存活时间和诱导病株生根, 这进一步证实
了泡桐在与植原体相互作用过程中激素代谢发生了变化。
关键词 : 根癌农杆菌; 泡桐丛枝病植原体; 病害症状; 异戊烯基转移酶基因 ( ip t) ; 多聚酶链式
反应( PCR)
中图分类号: S718. 83　　　　文献标识码: A
由植原体侵染引起的泡桐( Paulow nia spp. )丛枝症状,涉及病株体内激素代谢的紊乱, 其
中生长素和细胞分裂素所起的作用已引起关注 [ 1～3]。但受植原体病原尚不能人工培养等困难,
使与致病相关的分子生物学研究进展较慢。现在,已知多种病原微生物含有控制生长素和细胞
分裂素合成的基因,特别是对根癌农杆菌[ Agr obacterium tumef aciens ( Smith and T ownsend)
Conn] T -DNA 上与生长素和细胞分裂素合成相关的基因克隆及转化植株研究, 证明了其在
病菌致瘤过程中的关键作用 [ 4, 5]。根癌农杆菌侵染杨树( Populus spp. )引起茎部和根部肿瘤症
状[ 6] ,将这种含致瘤基因的 T -DNA 整合到毛白杨( Populus tomentosa Carr . )染色体上后可使
激素合成基因得以表达 [ 7, 8]。Haas 等[ 9]根据根癌农杆菌 T -DNA 的碱基序列设计了一对引物
CYT 和 CYT′,可扩增细菌的异戊烯基转移酶基因( ip t )片段。异戊烯基转移酶催化二甲基丙
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For est Resear ch　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
烯焦磷酸酯与腺苷单磷酸合成N 6-(
2-异戊烯基)腺苷 5-磷酸,此为细胞分裂素合成的关键步
骤。
本试验探讨了用杨树致瘤根癌农杆菌株接种感染植原体的丛枝和健康泡桐组培苗上对病
害症状和泡桐生长的影响, 以深入了解植原体对泡桐的致病作用机制。同时,采用此致病根癌
农杆菌遗传转化泡桐组培苗,研究根癌农杆菌 T-DNA 遗传转化泡桐的可行性和转化组织特
性,以期为开展泡桐基因转移打下良好的基础。
1　材料与方法
1. 1　感染植原体的泡桐丛枝组培苗和健康组培苗
植原体分离物来自山东兖州,保存在毛泡桐[ Paulow nia tomentosa ( T hunb. ) Steud]无性
系 C85-028上,引致典型的丛枝症状[ 1] ,将此分离物称之为 C85-028D。另外 2个感染植原体的
无性系为 C85-034D和 Q 4D, 用 C85-028D病组培苗经温度处理和茎尖培养结合处理获得的
脱毒苗为T 35-028。中林 3号泡桐[ P . elongata S. Y. Hu × P. f or tunei ( Seem. ) Hemsl. ]组
培苗来自北京中国林科院内成年树,健株编号为 ZH-3, 感染植原体后的丛枝病苗编号为 ZD。
感染植原体的甘薯丛枝病( Phy top lasma sp. )组培苗和健康对照由中国农科院植物保护所何
放亭惠赠。
泡桐组培苗和转化组织培养基包括MS基础培养基和愈伤组织诱导培养基( MS+ 4. 5 mg
·L - 1 6-BA+ 0. 2 mg·L - 1 NAA )和不定芽分化培养基( M S+ 2 mg·L - 1 6-BA+ 0. 2 mg·
L
- 1
NAA)。
1. 2　杨树根癌农杆菌株
A grobacterium tumef anciens CFCC1001株系由国家林业局林木菌种保藏中心提供,能引
致杨树及其它木本植物根茎部肿瘤[ 6] ,用 YEB琼脂培养基培养。
含构建重组质粒的对照农杆菌 AT -GUS 和 AT -TH 分别携带 GUS 报道基因和与抗病相
关的 HarpinEa基因,由中国农科院生物技术中心李汝刚先生惠赠,用含卡那霉素和利福平的
YEB培养基培养。
1. 3　野生致瘤型 Agrobacterium tumef anciens接种处理组培苗和转化泡桐组织
用具柄的无菌解剖刀直接挑取菌落,涂于组培苗茎部的切口上(包括去顶切口和未去顶的
伤口) , 于正常光照下培养, 30 d 左右切取伤口长出的愈伤瘤组织于含 1 000 g·mL - 1羧苄青
霉素的 MS 培养基中光照培养,每隔20～30 d转移至相同的新培养基上连续继代 1～4次。最
后挑取无菌转化瘤组织,切成 5 mm 左右的小块在不含激素和抗生素的 MS 培养基上 1～2月
继代培养 1次。
1. 4　根癌农杆菌转化瘤组织嫁接病、健组培苗
在组培苗的主茎的不同部位向下斜切 0. 1～0. 2 cm 深度的切口,将转化瘤组织切成约 1
mm 的小片,夹持在切口内,然后光照培养。
1. 5　ipt引物的设计和 PCR 扩增
设计并合成的一对扩增 ip t 基因片段的引物为 CYT : 5′-GAT CGG GTC CAA T GC
TGT -3′( 8867～8884) , CYT′: 5′-GAT AT C CAT CGA T CT CT T-3′( 9298～9276)。细菌模板
DNA 制备时取菌落或菌液, 加入 100 L 细菌 DNA 抽提液( 20 mmol Tris-Cl , pH 8. 0, 1
mmol EDTA , 1 mmol NaCl, 0. 5% T riton X-100)。100 ℃处理 2 min,冰浴2 min, 10 000 r·
min
- 1离心 1～2 m in, 取上清液作为细菌模板。病、健组培苗和遗传转化瘤组织模板DNA 的抽
提按标准 CT AB法[ 10] ,材料先加研磨液研磨,然后离心( 12 000 r·min- 1, 20 min) ,取沉淀加
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DNA 抽提液抽提 DNA, 然后用蛋白酶 K /十六烷基三已基溴化铵( PK/ CT AB)抽提染色质
DNA。
PCR扩增条件为 94℃ 45 s, 52℃ 80 s, 72 ℃ 90 s, 30循环, 72 ℃ 保温 10 m in。
图 1　杨树根癌农杆菌 T -DNA 遗传转化泡桐结果
　　　A. T35-028去顶接种根癌农杆菌诱致肿瘤; B. 感染植原体的
C85-034D 接种根癌农杆菌后, 致瘤不明显, 丛枝症状减轻 (右
枝) ,未接菌枝,丛枝症状严重(左枝) ; C. T 35-028遗传转化瘤
形态,在 MS 培养基上生长; D . AT-ZH 嫁接 ZH 主茎中部引起
茎叶枯萎; E. AT -ZH 嫁接 ZH 茎基部引起根芽丛生; F. AT -
ZH 嫁接 C85-028D,初期症状减轻,后期随瘤组织体积增大,丛
枝症状再加重。图中箭头示接菌或嫁接部位。
2　结果与分析
2. 1　泡桐病、健组培苗对接种根癌
农杆菌的反应(图 1)
分别用根癌农杆菌菌液伤口接
种健康组培苗 T 35-028和 ZH 时, 无
论是去顶接菌或是基部切口接菌皆
诱导较大的淡绿色瘤状组织;至 30 d
直径可达0. 85 cm。生长35～40 d后,
瘤组织生长速度减慢, 且表面变褐,
有水渍状菌浓出现。已感染植原体且
表现严重丛枝症状的病组培苗 C85-
028D接种此菌时未产生明显的瘤状
组织, 接种轻症苗时出现较小的瘤状
组织; Q 4D病苗能在接种伤口处产生
较小的瘤状组织,至 30 d瘤组织直径
仅为0. 25 cm 左右; C85-034D仅在接
种伤口处有微突起, 未形成明显的瘤
状组织。
接种根癌农杆菌后,对丛枝病组
培苗会产生症状减轻效应, 包括丛枝
叶片增大、节间伸长及生根等, 而对
健苗生长的促进作用不明显, 甚至出
现抑制作用。
2. 2　泡桐遗传转化瘤的生长和分化
特点
根癌农杆菌接种健株 T 38-028
和 ZH 20～30 d 后, 切取淡绿色瘤状
组织,切成直径约 0. 2～0. 4 cm 小块,
移入含羧苄青霉素的无激素 MS固体
培养基上, 20 d 左右瘤组织开始迅速
生长, 继续在含羧苄青霉素的 MS 培
养基上继代培养2～4次,获得了无菌
的 T 35-028 和 ZH 的遗传转化组织,
简称A T-T 35和 AT -ZH。此转化组织可在 MS 培养基上迅速生长,但正常泡桐不定芽分化培
养基( M S+ 2 mg·L - 1 6-BA+ 0. 2 mg·L - 1NAA)不能使此转化瘤组织分化不定芽。经激素
诱导( M S+ 4. 5 mg·L- 1 6-BA+ 0. 2 mg·L - 1 NAA)形成的未转化的泡桐愈伤组织切块不能
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在无激素的 MS 培养基上维持生长,并逐渐变褐枯死。由于已知此菌在 T-DNA上携带了合成
细胞分裂素和生长素的基因,故由此肯定细菌的 T -DNA 已被整合到泡桐染色体上[ 4, 5, 8]。
在 MS培养基上,无性系 ZH 和 T 35-028的瘤状组织生长和形态存在明显差异,前者由疏
松的小球状组织构成, 开始为绿色至淡绿色,在继代培养过程中逐渐失去叶绿素产生能力而变
成乳白色至灰白色;后者瘤组织为较致密的整体,呈淡绿色至浅褐色。出现这种差异的原因可
能与无性系特性或与 T-DNA被整合到泡桐染色体的拷贝数有关。在最初的继代培养过程中,
常出现部分切块瘤组织枯死现象;后期的继代培养过程中, 死亡外植体的比例逐渐减少,推测
为未转化嵌合细胞因激素供应不足而死亡。无叶绿素的瘤状组织,通过改变培养基中6-BA 和
NAA 的浓度和比例,可使之变成绿色或浅绿色, 但不能获得分化不定芽的能力。
2. 3　用 T-DNA转化瘤组织嫁接组培苗对症状的影响
将切块瘤组织分别插接到泡桐病、健组培苗茎中部或茎基部的切口上,瘤组织可存活或生
长,但瘤组织生长速度明显低于在 MS培养基上的生长速度。当病株茎中部嫁接的瘤组织生长
到一定体积后,常导致接口坏死现象,而嫁接到茎基部时则接口坏死不明显。瘤组织嫁接初期
可明显减轻丛枝症状严重度,延长病苗存活时间,表现为节间伸长、叶片增大并有毛根分化等。
后期则出现两种不同情形: 一是随着瘤组织的增大, 丛枝症状加重,二是瘤组织增长缓慢,丛枝
症状进一步减轻。健株接上瘤组织后出现从嫁接部位沿主茎向上和向下持续性茎叶枯死。在
嫁接瘤组织的部位,病苗和健苗都常出现毛状气生根分化现象(图 1-E、F)。
以上现象皆从不同侧面暗示了根癌农杆菌瘤组织中的激素对泡桐病与健苗都产生了不同
的影响。由于健株本身的激素代谢是相对平衡的,根癌农杆菌瘤组织中激素的无控制分泌会打
破被嫁接的健株正常代谢平衡而引起“中毒”症状[ 11, 12]。而嫁接的瘤组织恰好在一定程度上补
偿了病株因植原体侵染而导致的激素水平的降低。譬如将瘤组织接于病株 ZD主茎基部后,虽
然根癌农杆菌瘤组织一直未有明显的增大,但却一直保持生活状态,而病株的丛枝症状有明显
减轻,并出现根的分化。说明了瘤组织激素对被嫁接的组培苗产生了直接的效应。
2. 4　ipt基因片段 PCR 扩增结果(图 2-A、B)
用 CYT 和 CYT′引物对,可由杨树根癌农杆菌 DNA 为模板扩增出 427 bp 的 ip t基因片
段,与已报道的结果一致[ 9, 13] ,但未能从已去掉 T -DNA 上激素合成基因的工程菌株 AT-GUS
和 AT -TH 扩增出此特异片段 [ 14]。同时遗传转化的泡桐瘤组织 AT -ZH 和 AT-T 35也扩增出
此特异片段,这进一步从分子水平上验证了 T-DNA 已被整合到泡桐的染色体上, 以及 T-
DNA 中含有激素合成基因的判断。
用此引物, 以泡桐和甘薯健康组培苗和感染植原体的丛枝组培苗总 DNA(包括植物和植
原体 DNA)为模板 PCR 均未扩增出与 ip t基因片段一致的 427 bp 的 PCR 产物,表明植物和
植原体可能不含有与根癌农杆菌一致或相近的 ip t基因。
用植物总 DNA 为模板进行PCR 时,常扩增出1至多条分子量大于427 bp DNA 片段;此
类片段在不同泡桐无性系、泡桐病株和健株及甘薯病株和健株中都会出现,故为非特异性扩增
产物。由于这些片段的分子量与 427 bp靶序列区别明显,且含量较低,故不影响对阳性结果的
判别,并可以通过调整模板 DNA 及 T aq DNA 酶加入量和减少电泳加样量等加以消除。
3　讨　论
本研究从根癌农杆菌接种已感染植原体的组培苗和健康组培苗表现致瘤性的差异,和遗
传转化瘤组织嫁接病、健组培苗对症状和生长影响的分析,推断根癌农杆菌 T -DNA 与细胞分
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图 2　用 PCR 检测杨树根癌农杆菌异戊烯基转移酶基因
胶板 A 和 B PCR 结果:泳道 A-1和B-1,分子量标准 DNA/ E coRI/ HindⅢ; A-2和 B-2.根癌农杆菌 427
bp扩增产物; A-3、A -4和 B-3. AT-GUS ; A-5和 B-4. AT -T H; A-6.甘薯健组培苗; A-7.甘薯丛枝病组
培苗; B-5.泡桐健康组培苗; B-6.泡桐丛枝病组培苗; B-7. AT -T35; B-8. AT-ZH.
裂素和生长素合成相关基因已被整合到泡桐的染色体上,并获得了稳定表达。
作者对感染植原体的泡桐体内的激素代谢变化研究结果已经发现,病组织中的游离 IAA
含量的下降是丛枝症状产生的重要原因,而 IAA 含量的降低又与病原定殖部位的过氧化物酶
-IAA 氧化酶的升高密切相关[ 1]。因而,本研究中出现感染植原体的病组培苗接种农杆菌时致
瘤能力下降和嫁接遗传转化瘤后丛枝症状减轻现象,可能不仅与健株组织的叶片大,光合作用
正常,有利于瘤组织生长物质的供应有关, 而且更与丛枝病苗整株生长素水平低于健株有直接
关系[ 1, 16]。虽然接种的根癌农杆菌也已使病组织细胞转化,并具备了合成生长素和细胞分裂素
的能力,但因病苗对转化细胞中合成激素的较强转移和具有的吸收库作用以及持续的 IAA 氧
化作用,导致病株难以像健株泡桐那样在伤口处积累足够致瘤所需的激素浓度或比例。而用转
化瘤组织嫁接染病的丛枝组织时,瘤组织合成和分泌的生长素和细胞分裂素能在一定程度上
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逆转因植原体作用而导致的内源激素水平的降低作用, 产生了与植物生长调节剂处理泡桐组
培病苗类似的效应 [ 16]。
关于植原体自身是否具有激素合成基因问题迄今尚无定论。本研究试图用根癌农杆菌专
化的 ip t基因引物、以植原体总 DNA 为模板进行 PCR来揭示植原体的类似基因信息, 但反复
的试验结果皆未能证明泡桐丛枝病植原体含有与根癌农杆菌类似的 ip t基因结构。虽然近来
的分子生物学研究已检测到植原体存在染色质外 DNA ,包括相似其它细菌的质粒结构 [ 17, 18] ,
但对这些染色质外 DNA 的特性和功能仍一无所知。因而, 下一步将用克隆的 ip t 等基因片段
制备相应的探针,用于植原体的染色质 DNA 和染色质外 DNA 的进一步鉴定,这对于深入揭
示植原体的致病机制具有重要意义。
本研究首次直接证明了通过根癌农杆菌转化途径可以将外源 DNA 导入泡桐细胞,但试
验未能从此遗传转化瘤获得转化植株。根据泡桐易于组培和植株再生的特性 [ 15] , 作者正在着
手开展用剔除激素合成基因的根癌农杆菌工程菌株建立标准的泡桐遗传转化体系和抗病相关
基因转移研究。建立的 PCR检测致病根癌农杆菌技术,为快速准确鉴定此病害提供了可靠的
手段,也可用于土壤和各种植物组织中致病根癌农杆菌的检测与鉴定,比常规的细菌致病力测
定方法节省时间和费用,结果与细菌的接种致瘤性完全一致[ 9, 19]。
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294.
Effects of Agrobacterium tumef aciens on the Symptoms of
Paulownia sp. Plantlet in Vitro Cultured
T IAN Guo-z hong1, ZHU Shui-f ang 2, LUO Fei 1, L I H uai-f ang3 , QIU W ei-f an
3
( 1. Research Inst itute of Forest E cology, Environment and Protect ion, CAF, Beijing　100091, China;
2. Plan t Quaran tine Inst itute, M inis t ry of Agricul ture, Beijin g　100029, Ch ina;
3. C ol lege of Plant Protect ion, C hinese Agricultural University, Beijing　100094, Chin a)
Abstract: By using A grobacterium tumef aciens isolated f rom poplar crow n gal l disease w ith
the hormone-pr oducing genes in the T -DNA to inoculate healthy and infected Paulow nia
plant lets w ith phytoplasma, it is show ed that tumorigensis o f diseased plant lets dropped
apparent ly and the symptoms of w itches broom suppr essed to some ex tent . The T -DNA
was t ransformed into Paulow nia result ing in tumor fo rmat ion independent of ex ogenous
hormone addit ion and keeping subcultur e of tumor tissues for mo re than 2 years, thus
conf irming that the tumo r tissues gained the ability to synthesize cytokinin and aux in by
itself . Based on the conserved sequence of isopentenyl adenosine t ransferase gene ( ip t ) o f
A grobacterium tumef aciens Opine pTil 5955 st rain, a pair o f DNA primers ( CYT and CYT′)
w er e designed and synthesed. A 427 bp polymerase chain reaction ( PCR) product , the same
size as the ip t gene fragment of pTil 5955 w as amplif ied in associat ion w ith A grobacterium
tumef aciens st rain causing poplar stem gall disease rather than recombinant plasmid w ithout
this g ene. T he specif ic fragment of 427 bp was also ampl if ied using the DN A ex tracts fr om
transfo rmed tumor t issues o f two Paulow nia clones ( AT -ZH and A T-T 35 ) w ith the
A grobacterium tumef aciens as templates, therefor e further v erifying the insert of T -DNA to
the chromosome DNA o f Paulow nia and Paulow nia can be surely t ransformed through
A grobacterium tumef aciens Ti plasm id vector . T he specif ic 427 bp product was not amplified
by using total DNA extracts o f bo th in vitr o cultur ed healthy and infected paulow nia and
sw eetpotato infected with phytoplasmas as templates. When the t ransformed tumo r t issues
w er e graf ted onto the infected in vi tro cultured Paulow nia plantlets w ith phytoplasmas, the
symptoms of w itches bro om reduced apparent ly , including reduced sever ity , pro longed
survival t ime and increased roo ting ability of the plant let , w hich, on other aspect , suggests
the involvement o f the hormone metabolism in paulow nia-phy toplasma interaction.
Key words: A grobacter ium tumef aciens; Paulow nia w itches br oom phytoplasma; disease
symptom; isopentenyl adenosine t ransferase gene ( ip t) ; polymerase chain react ion ( PCR)
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