全 文 ：第 49 卷 第 5 期
2 0 1 3 年 5 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 49，No. 5
May，2 0 1 3
doi:10．11707 / j．1001-7488．20130523
收稿日期: 2012 － 09 － 13; 修回日期: 2012 － 11 － 07。
基金项目: 国家林业公益性行业科研专项(201004029) ; 国家“十二五”科技支撑计划(2012BAD21B0502)。
* 杜红岩为通讯作者。
基于杜仲转录组序列的 SSR分子标记的开发*
黄海燕 杜红岩 乌云塔娜 刘攀峰
(中国林业科学研究院经济林研究开发中心 国家林业局杜仲工程技术研究中心 郑州 450003)
关键词: 杜仲; 转录组; SSR; 引物
中图分类号: S718. 46 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2013)05 － 0176 － 06
Development of SSR Molecular Markers Based on
Transcriptome Sequencing of Eucommia ulmoides
Huang Haiyan Du Hongyan Wuyun Tana Liu Panfeng
(Non-Timber Forest Research and Development Center of Chinese Academy of Forestry
The Eucommia Engineering Research Center of State Forestry Administration Zhengzhou 450003)
Abstract: To study the genetic diversity of Eucommia ulmoides without information of the whole genome，the SSR
primers were designed based on the transcriptome sequencing data (unpublished) from leaves and fruits of E． ulmoides．
The SSR loci were analyzed using microsatellite locus scan tool SSRIT to analyze 49 610 sequences，and we screened out
1 442 SSR loci which distributed in 1 334 sequences， accounting for 2. 9% of the transcriptome sequences． The
dinucleotide repeat is the most abundant repeat type，accounting for 69. 90% of the total number of SSRs． We observed
150 kinds of repeating units and found that the highest frequency is AG /TC，accounting for 32. 73% of the total number of
SSRs． Additionally，we found a small amount of CG repeats． A total 85 pairs of primers were designed and synthesized，
and the primers were verified by using 8 different excellent clones and among them 50 pairs of primers were able to amplify
products，of which 20 pairs of primers were polymorphic． This study had an important application value to analyze genetic
diversity of E． ulmoides by using SSR molecular markers．
Key words: Eucommia ulmoides; transcriptome; SSR; primer
简单重复序列 ( simple sequence repeat，SSR)，
又称微卫星，是广泛存在于真核和原核生物基因组
中的 1 ～ 6 个核苷酸串联重复单元，研究发现基因组
中平均每 50 kb 就有 1 个 SSR ( Morgante et al．，
1993; Kalia et al．，2011)，SSR 标记主要包括基因组
SSR 和表达序列标签 SSR(EST-SSR)。SSR 标记具
有多态性高、重复性高、共显性、易检测、操作简单、
无放射、所用时间较短、覆盖面广等优点，在 DNA 指
纹图谱的构建、遗传多样性分析、基因定位、分子标
记辅助育种等方面得到广泛应用(Morgante et al．，
1993; Milee et al．，2008; 罗冉等，2010)。SSR 分子
标记引物的开发是进行 SSR 分子标记研究的前提，
从基因组开发 SSR 标记的引物需要 cDNA 文库构
建、SSR 克隆筛选、测序等步骤，其步骤复杂、工作量
大、开发成本高等，从而限制了 gSSR 标记的发展
(程小毛 等，2011 )。表达序列标签 ( Expressed
Sequence Tag，EST)来源于基因的转录区，直接反映
基因的表达信息，虽然近年来在公共数据库中 EST
的数量剧增，但与转录组数据相比 EST 数据还是相
当缺乏。随着高通量测序技术的快速发展和测序成
本的降低，利用新一代高通量测序技术对植物全基
因组范围内进行测序，并产生丰富的转录组数据，其
中包含了大量的 EST 序列( Simon et al．，2009)。利
用转录组序列开发 SSR 标记既有 EST-SSR 标记的
优点，同时其海量的数据为 SSR 标记的开发提供了
比 EST-SSR 更全面的信息，提高了遗传多样性和分
子标记辅助育种研究的准确性。
杜仲(Eucommia ulmoides)为第四纪冰川侵袭后
残留下的古老树种，雌雄异株。中国为现存杜仲的
原产地，杜仲自然分布在我国的中亚热带到暖温带
地区。杜仲(2n = 34)是我国特有的优质天然橡胶
和中药资源，杜仲胶作为战略资源具有十分广阔的
第 5 期 黄海燕等: 基于杜仲转录组序列的 SSR 分子标记的开发
应用前景(杜红岩等，2000; 2009; 杜红岩，2010;
李芳东等，2001)。我国拥有世界 99% 的杜仲资
源，具有独特的资源优势。但目前杜仲的遗传背景
并不清晰，这给杜仲杂交育种、种质资源保存、新种
质挖掘等带来了很大困难，RAPD，AFLP，ISSR 等现
代分子生物学手段为杜仲遗传多样性、种质创新和
品种改良等研究带来很大便利(张檀等，1993; 王
瑷琦等，2006; 邓建云等，2006; Wu et al．，2011;
Kalia et al．，2011)。目前关于杜仲 SSR 标记，只有
Deng 等(2006)利用 FIASCO 法开发了 19 对具有多
态性的 SSR 引物，但杜仲为单科单种物种，经作者
验证这些引物还远远难以满足研究需要。在
GenBank 中 公 布 的 杜 仲 EST 序 列 只 有 29 条、
Nucleotide 只有 232 条(截止 2012 年 7 月)，这在很
大程度上限制了杜仲 SSR 标记的开发和利用。为
此，中国林业科学研究院经济林研究开发中心利用
高通量测序技术成功获得杜仲叶和果实的转录组数
据，本文对这些数据进行了系统分析，最终找到了适
用于杜仲 SSR 标记研究的引物，为进行杜仲遗传多
样性分析、雌雄株鉴定、分子标记辅助育种等奠定了
基础。
1 材料与方法
1. 1 材料 转录组测序样本为采自中国林业科学
研究院经济林研究开发中心院内‘华仲 6 号’
(Eucommia ulmoides‘Huazhong No． 6’)的叶子和幼
果，液氮速冻后送华大基因公司(北京)进行转录组
测序，共包含 49 610 条 Unigenes。
SSR 扩增所用的 8 份杜仲样品于 2012 年 5 月
取自中国林业科学研究院经济林研究开发中心杜仲
基因库(表 1)。样品取健壮、无病虫害的当年生杜
仲嫩叶，液氮速冻后保存于 － 80 ℃冰箱中备用。
表 1 杜仲试验材料①
Tab． 1 Eucommia ulmoides accessions used in this study
编号 No． 名称 Name of cultivar 来源 Source 经度 Longitude(E) 纬度 Latitude(N) 海拔 Elevation /m
1 10482X 江苏响水 Xiangshui，Jiangsu 119°8022″ 34°0756″ 7
2 10138C 北京 Beijing 116°181″ 39°592″ 53
3 10595C 河南郑州 Zhengzhou，Henan 113°4137″ 34°4623″ 96
4 10004C 湖南江垭 Jiangya，Hunan 110°7723″ 29°5117″ 159
5 10599C 河南郑州 Zhengzhou，Henan 113°4137″ 34°4623″ 96
6 10592C 河南洛阳 Luoyang，Henan 112°2514″ 34°3956″ 159
7 10091C 江西南昌 Nanchang，Jiangxi 115°508″ 28°4533″ 45
8 12001X 湖北神农架 Shennongjia，Hubei 110°1046″ 31°2417″ 1 163
① 湖北神农架‘12001X’为一株树龄为 200 多年的杜仲雄株，疑似野生杜仲(邓建云等，2006)。The cultivar‘12001X’from Shennongjia in
Hubei Province，a staminiferous plant more than two hundred years old，could be the wild species(邓建云等，2006) ．
1. 2 方法 1) DNA 的提取 采用天根生物公司
(北京)新型植物基因组提取试剂盒提取杜仲基因
组 DNA，用 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的质
量，－ 20 ℃保存备用。
2)杜仲转录组 SSR 位点的鉴别及 SSR 引物设
计 对杜仲叶和果实的 49 610 条 Unigenes 利用在
线微卫星位点扫描工具 SSRIT ( simple sequence
repeat identification tool)(http: ∥www． gramene． org /
db / searches / ssrtool)查找 SSR 位点，查找标准: 二、
三、四、五、六核苷酸的最小重复次数分别为 9、7、5、
5、5 次，并且 SSR 位点侧翼序列长度≥50 bp。
用 Primer5 和 Oligo7 软件进行引物设计和评
价。设计引物时设置的主要参数为: GC 含量
40% ～ 70%，退火温度 58 ～ 63 ℃，引物长 18 ～ 25
bp，预期扩增产物长度 100 ～ 500 bp，且无二级结构
和二聚体。引物命名为 EU 加序号，如 EU-1。
3)SSR 引物筛选 挑选 85 对引物由金斯瑞生物
技术公司(江苏南京)合成以用于扩增，2 × Taq PCR
MasterMix 购自天根生物公司(北京)。PCR 反应体
系为 20 μL: DNA 模板 25 ng，2 × Taq PCR MasterMix
9 μL，上下游引物浓度 0. 4 μmol·L － 1，去离子水补足
20 μL。PCR 反应在 Mastercycler gradient(eppendorf)
上进行扩增: 94 ℃预变性 4min; 再进行 35 个循环，
每个循环包括 94 ℃变性 30 s，60 ℃复性 30 s，72 ℃延
伸 1min; 最后 72 ℃延伸 10 min。
PCR 扩增产物首先用 2%的琼脂糖凝胶电泳检
测有无特异性条带，有特异性条带的再用 6% 的非
变性聚丙烯酰胺凝胶在垂直板电泳仪 (美国 Bio-
Rad)中进行电泳分离，200 V 电压下电泳 200 ～ 240
min，电泳后用 Gelred 荧光染料(美国)染色 30 ～ 60
min，用复日 FR-980H 生物电泳图像分析系统(上海
复日)进行观察、拍照。
2 结果与分析
2. 1 杜仲转录组中 SSR 位点的分布特点 在杜仲
转录组的 49 610 条 Unigene 序列中发现1 442个 SSR
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林 业 科 学 49 卷
位点，分布在1 334条 Unigene 中，发生频率 (含有
SSR 的 Unigene 数量与总 Unigene 数量之比 ) 为
2. 69%。其中有 1 238 条 Unigene 序列只含 1 个
SSR 位点，含 2 个及 2 个以上 SSR 位点的 Unigene
序列有 96 条，SSR 的分布频率 ( SSR 的个数与总
Unigene 的数量比)为 2. 90%，杜仲转录组序列中平
均 26. 13 kb 就能发现 1 个 SSR 位点(表 2)。
表 2 杜仲转录组中 SSR 重复单元的分布特征
Tab． 2 Distribution of the SSR motifs in Eucommia ulmoides transcriptome
重复类型
Type of repeat
数量
Number
频率
Frequency(% )
平均距离
Average distance / kb
平均长度
Average length / bp
主要重复单元
Main repeat motif
二核苷酸 Dinucleotide 1 008 2. 03 37. 38 23 AG /TC，CT /GA，AC /TG，CA /GT，AT /TA，CG /GC
三核苷酸 Trinucleotide 329 0. 66 114. 52 24
AGA /TCT，AAG /TTC，CTT /GAA，CTC /GAG，
AGG /TCC，CCA /GGT，CCT /GGA，ACC /TGG
四核苷酸 Tetranucleotide 40 0. 08 941. 95 22
ATAC /TATG，AAAT /TTTA，AGAT /TCTA，
ATAA /TATT，CTCC /GAGG
五核苷酸 Pentanucleotide 9 0. 02 4 186. 42 28
ACAAG，ATGCT，ATTTT，CCTAA，CTTAA，
GTTTG，TTAAT，TTTGA，TTTTG
六核苷酸 Hexanucleotide 56 0. 11 672. 82 32 AAACCA，AATTCA，TTTTGT
合计 Total 1 442 2. 90 26. 13 23
杜仲转录组中 SSR 的主要重复类型是二核苷
酸重复，占 SSR 总数的 69. 90% ; 其次是三核苷酸
重复，占 SSR 总数的 22. 82% ; 四、五、六核苷酸重
复类型的数量很少，总计 7. 28% (图 1)。
图 1 SSRs 不同重复单元
Fig． 1 Types of SSR motifs
杜仲转录组 SSR 位点的序列长度分布从 18 ～
92 个碱基不等，平均长度 23 bp，二、三、四、五、六核
苷酸重复的平均长度分别为 23、24、22、28、32 bp(表
2)。重复序列长度 18 ～ 24 bp 的最多，占 72. 95% ;
其次是长度 25 ～ 39 bp 的序列重复，占 24. 89% ; 大
于 40 bp 的重复序列仅 2. 15% (图 2)。
杜仲转录组 SSR 重复单元的重复次数分布在
5 ～ 46次之间。其中 5 ～ 10 次重复的有 946 个 SSR，
占 65. 60% ; 11 ～ 15 次重复的有 395 个 SSR，占
27. 39% ; 15 ～ 20 次重复的有 82 个 SSR，占 5. 69% ;
大于 20 次重复的仅有 19 个 SSR，占 1. 32% (图 3)。
二核苷酸单元最多重复 46 次，三核苷酸单元最多重
复 17 次，四、五核苷酸单元最多重复都为 8 次，六核
苷酸单元最多重复 7 次。
图 2 SSR 重复长度分布
Fig． 2 Distribution of the length of repeats
图 3 SSR 重复次数分布
Fig． 3 Distribution of the number of repeats
2. 2 杜仲转录组 SSR 分布特征 1 442个 SSR 位
点共包含 150 种重复单元，二、三、四、五、六核苷酸
重复各有 11、48、29、9、53 种。
出现频率最高的 2 个重复类型是 AG /TC，
CT /GA，分别占总 SSRs 的 32. 73%，26. 07%，共计占
58. 80% ; 其次是 AC /TG 和 AGA /TCT，分别占总
SSRs 的 4. 79%，3. 74%。在 二 核 苷 酸 重 复 中，
AG /TC，CT /GA 出现的次数最多，共占二核苷酸 SSRs
871
第 5 期 黄海燕等: 基于杜仲转录组序列的 SSR 分子标记的开发
的 84. 13% ; 同时在二核苷酸重复中还发现了少量的
CG 重复，占二核苷酸 SSRs 的 0. 10% (图 4)。
图 4 二核苷酸重复中不同重复单元的比例
Fig． 4 Percentage of different motifs in dinucleotide repeats
2. 3 杜仲转录组 SSR 平均分布距离 杜仲转录组
SSRs 出现的频率较低，重复单元的类型较丰富。从
杜仲转录组 49 610条 Unigenes 中筛选出 1 442个
SSRs，分布于1 334条 Unigenes 中，平均分布距离是
26. 13 kb，出现频率为 2. 9%，与已公布木本植物的
SSR 分布频率相比明显偏低。设定的 SSR 长度不
同，SSRs 的分布频率将有所变化，如，李小白等
(2007)研究发现把油菜(Brassica napus)EST-SSR 最
小 SSR 长度标准由 12 bp 增加到 20 bp，EST-SSR 的
频率从 15. 58%降低到 11. 61%，但仍高于杜仲转录
组 SSRs 的出现频率。当把杜仲转录组 SSR 查找的
标准设定为二核苷酸重复次数≥7，三核苷酸重复次
数≥6，四、五、六核苷酸重复次数≥5，并且 SSR 位
点侧翼序列长度≥ 50 bp 时，SSR 出现的频率为
6. 54%，平 均 分 布 距 离 为 11. 61 kb，高 于 杨 树
( Populus ) 14. 0 kb ( Cardle et al．， 2000 )、柑 橘
(Citrus) 5. 7 kb ( Chen et al．，2006 )、银杏 ( Ginkgo
biloba) 12. 02 kb (樊洪泓等，2009 )，低于茶树
(Camellia sinensis)3. 68 kb(杨华等，2011)、北美鹅
掌楸 ( Liriodendron tulipifera ) 8. 5 kb ( Xu et al．，
2010)、橡胶树 (Hevea brasiliensis) 3. 93 kb (安泽伟
等，2009) 等木本植物(图 5)。
图 5 杜仲与其他树种 SSR 平均分布距离对比
Fig． 5 Comparison of the SSR average distance between
Eucommia ulmoides and other tree species
E． 1: 杜仲 Eucommia ulmoides ; E． 2: 杜仲 Eucommia ulmoides ;
P． : 杨树 Populus; G． : 银杏 Ginkgo biloba; C． 1: 茶树 Camellia
sinensis; C． 2: 柑 橘 Citrus; L． : 北 美 鹅 掌 楸 Liriodendron
tulipifera; H． : 橡胶树 Hevea brasiliensis．
2. 4 杜仲转录组 SSR 引物的有效性检测 合成 85
对 SSR 引物，SSR 位点包括 2 ～ 6 核苷酸重复单元。
选用 8 份差异较大的杜仲资源的核 DNA 为模板对
85 对引物进行扩增检测。85 对引物中有 50 对引物
扩增出特异性条带，扩增效率 59% ; 其中有 5 对引
物扩增片段与预期产物片段大小不符，剩余 45 对引
物中有 20 对引物的扩增产物具有多态性(表 3)，占
设计引物总数 23%。引物 EU-12，33，69，108 在 8
个优良无性系之间的扩增的 PAGE 效果图见图 6，4
对引物的目的片段长度分别在 150 ～ 200 bp，180 ～
230 bp，100 ～ 150 bp，100 ～ 150 bp 之间。
图 6 引物 EU-12，33，69，108 在 8 个优良无性系间的多态性
Fig． 6 Polymorphism of primer EU-12，33，69，108 showed in different excellent clones of Eucommia ulmoides
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表 3 SSR 引物序列及重复类型
Tab． 3 SSR primer sequences and repeat types
编号 No． 引物序列 Primer sequence (5— 3) SSR 类型 SSR motif 产物大小 Size / bp
EU-12
F: GGACAAATGCACCACCAAGA
R: CATGCTACAAGTCACCAAAGTAAGG
(CA) 11 156
EU-14
F: TCTTTGGTGGCCTTCCTCTG
R: TGGCATCGTCCCTCTTCATAC
(TC) 14 139
EU-15
F: CGTTGCCTGGTTTGGTTGC
R: GGCGGTGACGATGGTTGG
(GA) 13 183
EU-26
F: AACAACCAGACCCTGAACACC
R: GCATCCATCTCCTTCTCCAAT
(AT) 11 207
EU-27
F: CAACCAGACCCTGAACACCA
R: TCTGTATGCCCTTTGTACCTCC
(AT) 11 161
EU-28
F: AAAAGGAAGAGTGCGGTGAGG
R: CCGTGAAGCAGGTGAGTTGTT
(AGA) 7 252
EU-29
F: ACCCATCAGCCATCCATTCC
R: TTCGTAGTCCCGTGAAGCAG
(AGA) 7 125
EU-33
F: GTTTGCTGCTCTGTGCATGTTG
R: CATTGGTGTCATTGCTCCTTTCT
(GTT) 8 196
EU-41
F: CTTCCTGGGTGCCTGTTTCT
R: CCATTGTTGTCTGTGCTCTGCT
(TC) 13 107
EU-49
F: CCCTTTCCGATTTGCTGTATT
R: GAACAAGGTAATGTGCGGTCTG
(TC) 9 255
EU-53
F: CTGGCTTCCTCCTCTTCTTCG
R: ATTTGCGGTTGGCTGGTC
(TCT) 12 152
EU-54
F: CGAGAAATCCAAACCCAAATC
R: CCCGCCAATACTCCCAGAC
(TC) 9 349
EU-55
F: TTTTCATCTGGGTTTGCTTCTG
R: CCATAGCCTTTCCCTTTCACG
(AG) 11 174
EU-56
F: TGCCCGCTCTACAAACACC
R: CTCGAAGCATTAGCCATCTCC
(GAA) 7 335
EU-58
F: AATTTCGCATCCTTCTTCTGG
R: CTGACCTTCGCTGCTCTGTG
(TC) 16 170
EU-61
F: CTCTGCTTCCTCATCCTCGTT
R: AGCCACCGTCGCTCAAAC
(CT) 12 391
EU-69
F: TGGACACGGAAACCAATAACA
R: TCATCTCCTCCAGCCTTGAATA
(AG) 12 109
EU-72
F: CCGTTGTTGCCGAGGTTC
R: ATAATCAAAGGTGTCGCCAGTAG
(GA) 9 285
EU-82
F: CCTTACACCAACCGTTCTCATAC
R: GGGACACTCGCACCTTGAC
(TCT) 7 127
EU-83
F: TGGGTACGAAGTGAGTGAATGTG
R: TTGGAAATGTGCGAGTGAGG
(TCT) 7 178
3 讨论
杜仲转录组中微卫星的种类较为丰富，2 ～ 6 核
苷酸重复类型都有出现，主要重复类型为二、三核苷
酸重复，占 SSR 总数的 92. 72%，四、五、六核苷酸重
复类型的数量很少，总计 7. 28%。大多数植物的
SSR 主要以二、三核苷酸重复为主，但优势的重复单
元有差别。杜仲转录组中最常见的 SSR 重复类型
是二核苷酸重复，这一结果与拟南芥 ( Arabidopsis
thaliana )、花 生 ( Arachis hypogaea )、甜 菜 ( Beta
vulgaris)、梨 ( Pyrus) 和葡萄 ( Vitis vinifera)等一致
(Wei et al．，2011)。在二核苷酸重复单元中 AG /TC
(占总 SSRs 的 32. 73% )占主导地位，这与报道的多
数植物情况相同，同时也发现了一次 CG 重复，表现
出了明显的偏倚性。杜仲转录组 SSRs 出现的频率
较低，这一方面由物种的特异性引起，另一方面也与
搜索条件有很大的关系。
杜仲转录组 SSRs 出现的频率较低，但是重复单
元的类型较丰富，平均分布距离为 26. 13 kb，出现频
率为 2. 9%。当降低 SSR 查找标准，发现杜仲的出
现频率有所提高，但仍低于很多木本植物的 SSR 出
现频率。因此在进行物种间 SSRs 频率对比时应注
081
第 5 期 黄海燕等: 基于杜仲转录组序列的 SSR 分子标记的开发
意查找参数的设定，不同的查找参数其结果相差也
很大，应根据需要合理设置查找参数。
在合成的 85 对引物中有 3 对引物扩增片段与
预期产物片段大小不符，大于预期产物片段长度，这
可能与扩增片段中插入内含子有关，属于无效扩增
(Saha et al．，2004)。有多态性的 20 对引物的片段
大小在 100 ～ 400 bp，其中长度在 100 ～ 250 bp 之间
的引物有 14 对，占 70%。因此，建议在设计 SSR 标
记引物时要注意引物长度控制在 100 ～ 250 bp 之
间，多态性较高，扩增效果也较好。这 20 对具有多
态性的引物重复单元为二、三核苷酸重复，因此在设
计 SSR 引物时要侧重于含低级单元的序列，同时也
验证了低级单元 SSR 的多态性普遍比高级单元的
高(Dreisigacker et al．，2004)这一推断。
本研究表明利用杜仲转录组数据开发 SSR 标
记是可行的，本研究开发的引物将为杜仲遗传多样
性分析、分子标记辅助育种、育种群体的建立等奠定
基础。
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(责任编辑 徐 红)
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