全 文 ：第 !" 卷 第 # 期
$ % & % 年 # 月
林 业 科 学
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百合 FN@78基因的克隆与表达分析!
陈6莉6辛海波6李晓艳6李晓昕6义鸣放
"中国农业大学农学与生物技术学院6北京 &%%$
关键词&6铁炮百合# FN@78# 克隆# 表达
中图分类号! ’8&<2!"" ;#!72$666文献标识码!-666文章编号!&%%& =8!<<#$%&%$%# =%&8< =%!
收稿日期& $%%# =%< =&%#修回日期&$%%# =&% =&7%
基金项目& 国家教委博士点基金"$%%<%%&#%%&!$ %
!义鸣放为通讯作者%
+$"*#*3 -*=KOB()//#"*8*-$;/#/"1GH(D3E .I6KIE 9LIX06.IKIL0PLE6.IKIL0[IE6CIbIEFNLEF
"=’/"0"’*70(4.;/);("%12 >4’)".91’/’0#! =941% 70(4.;/);(%/J143"(,4)#6>"4?410 &%%$
89/’(-.’&6-L1Y13EFSD U@+-0N$/FN@78F3E3ZLTU10E3R NO0J $4/4;5/’104*/’(;5UV51MDIS393LV3E, XPG-(*5
,D3F3E3U0ETITS3R 0N& >%$ X4 3EU0RIEFL4O0S3IE 0N!7! LJIE0LUIRT5,D3T3oH3EUIEFIERIULS3R SDLSSD3$/FN@78F3E3
TDLO3R DIFD1PD0J010FPZISD 0SD3O41LEST5G,Yf(GLEL1PTITTD0Z3R SDLS3[4O3TTI0E 0N$/FN@78F3E3U0H1R X3R3S3US3R IE
SD3O00S! XH1X LER 13LN! LER SD3O31LSIV3DIFD 3[4O3TTI0E 0UUHOO3R IE SD3O00SLER 13LN5cER3O9$e$ TSO3TT! SD33[4O3TTI0E
0N$/FN@78F3E3ZLTIEUO3LT3R ZISD SD3OLITIEF0N9$e$ U0EU3ESOLSI0E5
:); <"(=/&6 $4/4;5/’104*/’(;5# J0E0R3DPRO0LTU0OXLS3O3RHUSLT3F3E3"FN@78$# U10EIEF# 3[4O3TTI0E
66抗坏血酸"LTU0OXIULUIR!-T-$作为植物细胞内
重要的自由基清除剂!是通过参与一系列的氧化还
原反应而发挥抗氧化剂的功能% 单脱氢抗坏血酸还
原酶"J0E0R3DPRO0LTU0OXLS3O3RHUSLT3!b@9-G$在抗
坏血酸 =谷胱甘肽循环中!可以将氧化型抗坏血酸
"b@9-$还原为还原型抗坏血酸"-T-$!在维持植
物体内抗坏血酸的正常代谢和植物体氧化还原平衡
方面起着重要作用"(D3E ")%/5! $%%7# $%%>$%
百合" $4/4;5$作为主要的切花和盆花材料!在
国内外花卉市场上占有重要地位% 百合性喜冷凉湿
润气候!越夏的百合经常出现生长停滞’植株低矮’
花朵败育等现象!严重影响了切花质量!并造成百合
种球退化% 夏季高温已成为限制国内百合周年生产
的重要因素% 本研究采用 G-(*技术从铁炮百合
1白天堂, " $O/’104*/’(;5 1MDIS393LV3E,$叶片中
克隆得到 FN@78的 U@+-全长!并对其在不同组
织器官及氧化胁迫下时空表达特征进行了研究!为
通过基因工程的方法提高植物活性氧清除酶活性!
从而提高植物的抗氧化胁迫能力!增强抗氧化代谢
的水平!提高植物的抗逆性提供理论依据%
>?材料与方法
&2&6材料6铁炮百合杂种系品种 1白天堂,组培
苗% 温度"$> s$$ ‘# 光照时间为 &! D)R =&%
&2$6G+-的提取及逆转录反应6取百合组培苗直
径 > JJ的小鳞茎及生长 7% 天的根’叶片!总 G+-
的提取采用 ,OIQ01法% 所提取的 G+-进行 &j琼脂
糖凝胶电泳!然后进行逆转录%
&276保守片段的克隆6根据 W3E?LEh 核酸数据库
中报 道 的 拟 南 芥 " 7(%&42’D,4,)9%/4%1% $ " +bY
&$%!! $’ 白 菜 " >(%,,4.% (%D% THXT45 D"U41"1,4,$
"-C%7#8<"$’水稻"R(#Q% ,%)43%$ "@<>8"!$’冰叶日
中花 "F","5&(#%1)9"5;5 .(#,)%/41;5$ "-k7%&>>7 $
FN@78的 JG+-序列!通过 @+-b-+设计保守区
兼并引物 fB& "W(+((M,-,W-GbW9((+W($和
fG&"W-W,-W--G,-,WW+-WG,-G,($% $> ’.反
应体系& &% dXHN3O$2> ’.!U@+- &2% ’.! $2>
JJ01).=& R+,f$2% ’.!&% JJ01).=&引物 fB& &2%
’.!fG& &2% ’.!L%M酶 %2$ ’.! RR9$e&827 ’.%
f(G反应程序为& #! ‘ > JIE# #! ‘ !> T!>& ‘
!> T!8$ ‘ #% T!7> 个循环# 8$ ‘延伸 &% JIE%
&2!6百合 FN@78基因 7]端和 >]端的克隆6根据
已克隆的百合 FN@78保守区片段!设计 $ 条
7]G-(*上 游 引 物 fB$ " ((,W--((,,WW,W(
-,W(($和 fB7 "W(,W,-WWWW-,W,(W((-($!以
-f&"((WW-,((,(,-W-W(WW((W(",$ &8 $引物进
6第 < 期 陈6莉等& 百合 FN@78基因的克隆与表达分析
行 逆 转 录! 以 -f$ " ((WW-,((,(,-W
-W(WW((W($为下游引物!进行巢式 f(G!对 7]端
进行扩增% 反应程序为& #! ‘ > JIE# #! ‘ !> T!
>$ ‘ !> T!8$ ‘ & JIE!7> 个循环# 8$ ‘延伸 &%
JIE% f(G反应体系同上%
根据已克隆的百合 FN@78保守区片段!设计 7
条 >]G-(* 下 游 引 物 fG$ " ((--W(,(--
W-((--,W,-,(($’ fG7 " ((,,W(,W-W,W(WW
W-(W,,($ 和 fG! " ((,,W(,W-W,W(WWW-(W
,,($!以fG$"((--W(,(--W-((--,W,-,(($特
异引物进行逆转录!对 U@+-模板进行加尾反应!再
以其为模板进行 f(G反应% f(G反应程序为& #!
‘ > JIE# #! ‘ !> T!>% ‘ !> T!8$ ‘ & JIE!7> 个
循环# 8$ ‘延伸 &% JIE% f(G反应体系同上%
bYb./G3V3OT3,OLETUOI4SLT3! L%M@+- 401PY
J3OLT3! GIX0EHU13LT3 )EDIXIS0O! ,3OJIEL1 @30[PY
EHU130SIRP1,OLETN3OLT3 " ,R,$! ,! @+- .IFLT3!
4b@&bI[SHO3!R-,f!@+-bLOh3O@.$%%%!限制性内切酶
均为 ,LhLOL生物公司产品% 大肠杆菌 "-,.9"(4.94%
.’/4$菌株 @9>/购自天根生物公司% 引物均由上海
生工合成%
&2>6序列测定6将所有 f(G产物凝胶电泳后回收
目的片段!与fb@&/!重组
质粒鉴定后送北京华大基因公司进行测序%
&2"6 G,Yf(G的表达分析 6 根据百合 FN@78
U@+-序列设计 & 对基 因特异 引物 b@9-GYB
" ,,,,WW(W,,(--WW-W(-W $ 和 b@9-GYG
"(-(((-(--(--(--,W,(-W($!以 7.)41 基因作
为内参!-USIEYB"-,WW--(,WW--,WW,,--W$ 和
-USIEYG"-,-W(--(-,-(-,-W(-WW$!采用半定
量 G,Yf(G方法研究 FN@78在根’鳞茎’叶不同组
织器官的表达模式!以及生长 7% 天的叶片在 %!
%2>!>!>%!&%% JJ01).=& 9$e$ 溶液中胁迫处理 & D
后的表达情况%
F?结果与分析
$2&6百合单脱氢抗坏血酸还原酶基因 FN@78全
长 U@+-序列的克隆6以百合叶片提取的 G+-逆
转录的 U@+-为模板!以 fB& 和 fG& 为引物!进行
保守区的 f(G扩增"图 &$% 经测序其核苷酸序列
大小为 #$% X4!同源序列比对结果显示!与水稻相似
性达 88j!与白菜相似性达 8!j!与拟南芥相似性
达 8$j%
根据该保守区片段!利用 $ 条 7]G-(*上游引
图 &6FN@78基因中间片段电泳图谱
BIF5&6*13USO04D0O3TIT0NFN@78NOLFJ3ES
b& @+-分子量 @.$%%%# && 扩增产物% 下同%
b& bLOh3O@.$%%%# && f(G4O0RHUS5,D3TLJ3X310Z5
物 fB$ 和 fB7!进行 $ 轮 f(G扩增!测序结果表明
该 7]G-(*产物大小为 >#8 X4"图 $$% 结合保守区
片段设计 7 条下游引物!用基因特异引物 fG$ 进行
逆转录!fG7 和 fG! 分别进行 >]端第 & 轮和第 $ 轮
f(G扩增!经测序该 >]端核苷酸序列大小为 &#% X4
"图 7$%
图 $6FN@78基因 7]片段巢式 f(G扩增电泳图谱
BIF5$6*13USO04D0O3TIT0NE3TSf(G0NFN@78F3E37]3ER
图 76FN@78基因 >]片段巢式 f(G扩增电泳图谱
BIF576*13USO04D0O3TIT0NE3TSf(G0NFN@78F3E3>]3ER
$2$6百合 b@9-G序列分析6将克隆得到的保守
区片段!7]端核苷酸序列和 >]端核苷酸序列拼接!获
得了百合单脱氢抗坏血酸还原酶基因 FN@78& >%$
X4 的全长 U@+-!其中开放阅读框 "eGB$有 & 7%>
#8&
林 业 科 学 !" 卷6
X4"图 ! $!编码 !7! 个氨基酸! >]c,G有 $" X4!
7]c,G有 &8& X4% 从氨基酸序列同源性比较图谱可
以看出"图 >$!百合与水稻和冰叶日中花的相似性
最高!分别达到 <7j和 <$j# 与白菜和拟南芥的相
似性也分别达到 8"j和 8!j% 系统进化树分析也
表明该基因与水稻和冰叶日中花的亲缘关系较近
"图 "$!将其命名为 $/FN@78%
$276百合 FN@78在不同器官的 G,Yf(G表达分析
采用 G,Yf(G方法对百合的根’鳞茎’叶片进行了相
对定量分析!从图 8 可以看出!在内参 7.)41 扩增产
物比较一致的情况下!FN@78在根’鳞茎’叶组织里
都有表达!但在根和叶中的表达量较高%
图 !6FN@78基因 (@’ 序列 f(G扩增电泳图谱
BIF5!6*13USO04D0O3TIT0N(@’ 0NFN@78
图 >6百合 b@9-G与几种植物蛋白氨基酸序列的同源性比较
BIF5>690J010FPU0J4LOIT0E 0NLJIE0LUIR T3oH3EU3TL1IFEJ3ES0N.I1Pb@9-GZISD 0SD3O41LEST
.1& 百合 $4/4;5/’104*/’(;5# ?O& 白菜 >(%,,4.% (%D% THXT45D"U41"1,4,"-C%7#8<"$ #
-S& 拟南芥 7(%&42’D,4,)9%/4%1%"+bY&$%!!$ # eT& 水稻 R(#Q% ,%)43% kL40EIULWO0H4"@<>8"!$ #
bU& 冰叶日中花 F","5&(#%1)9"5;5.(#,)%/41;5"-k7%&>>7$5下同% ,D3TLJ3X310Z5
$2!6百合 FN@78在氧化胁迫下的 G,Yf(G表达分
析6从图 < 可以看出!在不同浓度的 9$e$ 处理 & D
后!随着 9$e$ 浓度的增加!FN@78在百合叶片中
表达量随之增加% FN@78表达量在 %2> JJ01).=&
9$e$ 时!较对照没有明显变化# 9$e$ 浓度达到 >
JJ01).=& 以上时!FN@78表达量明显增加# &%%
JJ01).=& 9$e$ 时!FN@78表达量最大%
C?结论与讨论
近年来有关各种环境胁迫因子对植物的伤害!
都证明主要是由于逆境条件下大量产生的活性氧所
致% 高温等逆境条件下!植物细胞内自由基的产生
和清除系统的平衡受到破坏!积累的自由基伤害膜
系统!进而造成蛋白质变性’核酸降解% 在植物中活
性氧会引起植物代谢失活’细胞死亡’光合速率下
降’同化物的形成减少!甚至造成植物品质下降和产
量减低等严重后果"B0P3O")%/5! $%%%$%
抗坏血酸在生物体中具有重要的抗氧化作用和
代谢功能"fLV3S")%/5! $%%>$% 抗坏血酸与植物的
%<&
6第 < 期 陈6莉等& 百合 FN@78基因的克隆与表达分析
图 "6百合 b@9-G与几种植物蛋白氨基酸
同源序列的聚类分析
BIF5"6(1HTS3OIEF0NSD3R3RHU3R LJIE0LUIR T3oH3EU3T0Nb@9-G
ZISD D0J010F0HTLJIE0LUIR T3oH3EU3TLJ0EF.I1PLER 0SD3O41LEST
图 86百合不同组织 FN@78G,Yf(G
BIF586,D3G,Yf(G3[4O3TTI0E 0NFN@78
G&根 G00S# ?& 鳞茎 ?H1X# .& 叶 .3LN5
图 <6不同 9$e$ 浓度处理百合叶片 FN@78G,Yf(G
BIF5<6,D3G,Yf(G3[4O3TTI0E 0NFN@78IE 13LN
HER3ORIN3O3ESU0EU3ESOLSI0E 0N9$e$
抗逆性呈正相关!增加细胞内的抗坏血酸含量!能增
强植物对炎热’寒冷和盐碱等逆境的耐受能力% 一
方面!-T-可以直接清除植物体内因氧代谢’光合及
环境胁迫等产生的活性氧 "Ge’ $!如单线态氧
" &e$$’超氧阴离子"e
(
)
$ $及羟基自由基")e9$等#
另一方面!-T-能维持另一重要抗氧化剂维生素 *
的还原态!而由光合作用’光呼吸或其他氧化胁迫产
生的 9$e$ 可以通过 -fK的作用并伴随 -T-氧化
为不稳定的单脱氢抗坏血酸 "b@9-$ 得以还原
"-TLRL! &##8# 张磊!$%%8$% b@9-既可在定位于
质膜内侧的 b@9-还原酶"b@9-G$作用下还原为
-T-!也可发生非酶歧化反应生成脱氢抗坏血酸
"@9-$% b@9-G作为调控 -T-氧化还原态的关
键酶在植物抗氧化及 -T-再生过程中有重要的作
用!它可以提高 -T-在氧化型和还原型之间循环的
效率!降低了对 -T-的从头合成的需要%
目前已经从黄瓜"=;.;54,,%)43;,$’豌豆"<4,;5
,%)43;5$’番茄"$#.’D"(,4.’1 ",.;/"1);5$’拟南芥和水
稻等植物中克隆到 FN@78的 U@+-" ’LE0")%/5!
&##!# bHOSDP")%/5! &##!$!然而在众多的抗氧化酶
中!之前的大部分研究集中在 WG和 -fK!关于
b@9-G的研究!多集中在逆境下酶活性等生理指
标的测定 "?I10R3LH ")%/5! &##<# (3OVI1L")%/5!
$%%8 $! 在 分 子 水 平 上 研 究 的 很 少% WOLESQ等
"&##>$报道番茄 FN@78基因在创伤下其 JG+-表
达水平增加# C00E 等 "$%%!$研究表明在 9$e$’水
杨酸’百草枯’臭氧等氧化胁迫下!油菜 ">(%,,4.%
1%D;,$FN@78基因的表达量随之增加% 本试验中
克隆的百合 FN@78基因同样受氧化胁迫诱导而表
达!这说明 b@9-G在植物活性氧清除系统中的重
要性!因此能否通过转基因对其进行过表达!通过提
高 b@9-G的活性来增加 -T-的含量!进而增强植
物对氧化胁迫的抗性!有待于进一步的深入研究%
参 考 文 献
张6磊5$%%82拟南芥维生素 (的代谢工程5上海&复旦大学博士学
位论文5
-TLRL l5 &##82,D3 O013 0N LTU0OXLS3 43O0[IRLT3 LER
J0E0R3DPRO0LTU0OXLS3O3RHUSLT3IE 9$e$ TULV3EFIEFIE 41LEST"
’ULERL1I0TkW5e[IRLSIV3TSO3TTLER SD3J013UH1LOXI010FP0N
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O3RHUSLT3NO0J UHUHJX3O& LDIFD R3FO330ND0J010FPIE S3OJT0N
LJIE0 LUIR T3oH3EU3 X3SZ33E SDIT 3EQPJ3 LER XLUS3OIL1
N1LV03EQPJ3T5f1LES(31fDPTI01!7>"7$ & !$> =!785
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J0E0R3DPRO0LTU0OXLS3O3RHUSLT3F3E3NO0J>(%,,4.% .%5D",)(4,LER
LEL1PTIT0NISTJG+-13V31IE O3T40ET3S00[IRLSIV3TSO3TT5?I0UDIJIUL
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