全 文 ：第 50 卷 第 8 期
2 0 1 4 年 8 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 50，No. 8
Aug．，2 0 1 4
doi:10．11707 / j．1001-7488．20140811
收稿日期: 2013 － 10 － 16; 修回日期: 2014 － 06 － 05。
基金项目: “973”项目(2012CB723008) ; 浙江省重大农业专项(2010C12011，2012C12908 － 2)。
* 汤定钦为通讯作者。
应用微卫星分子标记估算毛竹的异交率*
刘政捷 林 源 周明兵 汤定钦
(浙江农林大学 亚热带森林培育省部共建国家重点实验室培育基地 临安 311300)
摘 要: 选用自行开发引物的、具有较高遗传多态性的 8 个微卫星位点，分析来自独立的 3 株开花毛竹半同胞家
系各 50 个子代个体。结果表明: 位于 3 个不同地点的开花植株都能够通过与外源花粉杂合产生具有不同的微卫
星基因型特点的半同胞家系子代，各个家系子代内均存有一定的遗传多样性，估算的平均异交率约为 0. 089。这说
明毛竹主要以自交为主，并兼顾有一定比例的异交以确保其后代种群的遗传多样性。
关键词: 毛竹; 微卫星; 遗传多样性; 交配系统; 异交率
中图分类号: S718. 46 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2014)08 － 0076 － 06
Estimation of Outcrossing Ｒate in Phyllostachys edulis by
Microsatellite Polymorphism
Liu Zhengjie Lin Yuan Zhou Mingbing Tang Dingqin
(The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture Zhejiang A ＆ F University Lin’an 311300)
Abstract: Mating system is the basic property of plant populations and biological foundation for germplasm preservation
as well as genetic improvement． In this study we applied developed 8 microsatellite loci with high polymorphism to analyze
50 half-sib progenies from each of 3 independent flowering culms of Phyllostachys edulis． The results showed that flowering
culms in three different locations were fertilized with foreign pollen，which generated progenies with different microsatellite
genotypes and genetic diversity． The overall estimates of outcrossing rate tm of single-locus and t s of multi-locus for the
three culms were 0. 089，indicating that the reproductive system of P． edulis predominantly involved in self-fertilization
with a certain proportion of outcrossing to produce genetic diverse progenies． This is the first report so far on estimation of
outcrossing rate for monopodial bamboo species such as P． edulis by DNA molecular markers．
Key words: Phyllostachys edulis; microsatellite; genetic diversity; mating system; rate of outcrossing
植物有各种形式的有性和无性繁殖系统。有性
繁殖通过父母本间的染色体重组产生不同基因型的
子代，有利于维持子代种群的遗传多样性。然而，有
性繁殖的配子(种子)是一个脆弱的独立生命幼体，
易受环境的影响，往往容易在形成、萌发及以后的成
长过程中被淘汰。由根或茎派生出子分株的无性繁
殖是有利的，因为这些分株通常连接到母株获得营
养物质，更有利于安全成长发育成为独立的成熟生
物体(de Kroon et al．，1997)。然而，由于无性繁殖
只能产生基因型完全相同的分株，不能在种群中引
入新的基因型，因而依赖于营养再生的无性繁殖导
致种群遗传组成的均一性。
毛竹 (Phyllostachys edulis) 具有非常发达的地
下鞭系系统，通过地下鞭系横走地下，由其上的笋芽
萌发在地上形成秆或分株克隆(萧江华，1983)。在
有性 繁 殖 方面，毛竹 与多 数竹 子一 样 属 一 稔
(monocarpic) 植物，需间隔 60 年以上才能完成开花
( Janzen，1976; Watanabe et al．，1982)。因此，在完
成开花结实的 60 多年间，由种子实现再生罕有发
生。种群的发展主要靠无性繁殖，通过地下鞭系系
统延伸形成了地下鞭系相连，地上由同一克隆(秆)
组成连绵几十米甚至更远的顶极群落。在开花毛竹
林后 续 演 替 群 落 中 存 在 着 遗 传 多 样 的 基 株
( genets)，表明了有性繁殖保持毛竹种群的遗传多
样性 ( Isagi et al．，2004)。迄今为止毛竹开花特性
的研究报道不多，除大家普遍认可的开花间隔时间
第 8 期 刘政捷等: 应用微卫星分子标记估算毛竹的异交率
长、大面积同时开花等竹子开花特性外 (Watanabe
et al．，1982; Liao，1990; Isagi et al．，2004)，多是各
地出现开花现象的新闻报道，育种上的应用更为
罕见。
自 20 世纪 90 年代末以来，广西壮族自治区桂
林市周边地区连续多年发生零星毛竹林开花，为研
究毛竹开花的生物学特性提供了很好的试验材料。
本研究采用具有共显性遗传、选择中性、多态性高、
在不同的基因组中随机分布、易于被扩增等优点的
微卫星 (microsatellites) 标记技术，分析了从桂林市
周边 3 个县的 3 株开花毛竹收集得到的半同胞家系
子代，以期了解毛竹的交配行为及其对维持其种群
遗传多样性的作用，同时为毛竹实生苗选择育种奠
定理论基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
近几年在广西壮族自治区有小范围毛竹零星开
花的报道，主要地点包括荔浦、灵川和灌阳等县。于
2011 年，在这 3 个县开花毛竹林现场各选定 1 株开
花毛竹(株间相隔 30 ～ 100 km)，分别收集半同胞种
子共 3 份(表 1)。种子于实验室培养箱内发芽，统
计发芽率(国标种检 2772 － 81); 培养到 3 叶期，随
机各抽取 50 株幼苗，应用改良 CTAB 法 (Doyle et
al．，1987) 提取基因组 DNA，作为模板供 PCＲ 扩增。
表 1 取样地及分析样本信息
Tab． 1 Information on progeny populations and their sampling sites
子代种群
Population
采样
地点
Sampling site
位置
Location
DNA
样本数
Sample
number
发芽率
Germination
percentage(% )
采样地间的直线距离
Distance between
sampling sites / km
荔浦
Lipu
荔浦县蒲芦乡
Pulu，Lipu county
24°320. 11″N
110°1342. 16″E
50 15. 3 荔浦与灵川
Between Lipu and Lingchuan: 92. 6
灵川
Lingchuan
灵川县海洋乡
Haiyang，Lingchuan county
25°1831. 64″N
110°3340. 88″E
50 20. 4 荔浦与灌阳
Between Lipu and Guanyang: 101. 2
灌阳
Guanyang
灌阳县洞井瑶族乡
Dongjing，Guanyang county
25°1443. 43″N
110°516. 46″E
50 40. 1 灵川与灌阳
Between Lingchuan and Guanyang: 30. 1
1. 2 试验方法
1. 2. 1 SSＲ 分析与基因分型 本课题组先前已开
发了近 100 个毛竹的微卫星分子标记，分析毛竹
2010 年混合种批( seedlot)发现有 22 位点上存在有
多态性 (Tang et al．，2010; Lin et al．，2014)。本文选
用其中 8 个多态性 (多态信息含量 polymorphism
information content，PIC≥0. 36) 较高的位点作为分
析工具，具体信息见表 2。
PCＲ 反应体系总体积为 20 μL，其中包括 10 ×
Buffer 2 μL，MgCl2 (25 mmol·L
－ 1 ) 1. 2 μL，dNTPs
(各 dNTP 均 2. 5 mmol·L － 1) 1. 6 μL，Taq 聚合酶 (5
U·μL － 1 ) 0. 2 μL，DNA 模板 1 μL (50 ng·μL － 1 )，
上、下游引物 (10 μmol·L － 1) 各 0. 5 μL。PCＲ 反应
程序为: 94 ℃预变 5 min; 94 ℃45 s、复性 45 s (各
引物对应退火温度，表 2)，72 ℃ 1 min，35 个循环;
最后 72 ℃延伸 10 min 后 4 ℃保存。在 PCＲ 产物中
加入变性缓冲液，95 ℃变性 5 min 后用 4% 变性聚
丙烯酰胺胶(厚度 0. 4 mm) 和 1 × TBE 电泳缓冲液
电泳分离。用美国 C． B． S． 测序胶电泳系统进行电
泳，100 W 预电泳 30 min 后上样，60 W 恒功率电泳
约 1. 5 h，用银染法 (Panaud et al．，1996) 显示微卫
星片断，再用相机拍照，记录统计上述 3 个半同胞家
系子代各 50 个个体在分析位点上的基因型。
1. 2. 2 数据分析 采用基于牛顿拉普森(Newton-
Ｒaphson)算法、适用于共显性标记的多位点异交率
分析软件 MLTＲ(Ｒitland，1986; 2002) (版本 2. 4，
http:∥ genetics． forestry． ubc． ca / ritland / programs．
html)对交配系统各个参数进行估计。按软件输入
要求列出分析个体及其在各个位点上基因型矩阵，
统计遗传多样性等常规参数; 采用最大期望法
( expectation maximization method)，经过 100 次重复
取样 ( bootstraps) 估计试验种群的参数: 单位点
( ts，single-locus outcrossing rate)、多位点( tm，multi-
locus outcrossing rate ) 异 交率 和近 交 系数 ( F is，
inbreeding coefficient ) 等，分析毛竹的 交配 系统
特性。
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林 业 科 学 50 卷
表 2 微卫星基因分型的位点信息
Tab． 2 Information of SSＲ loci used for genotyping
位点
Locus
登录号
GenBank No．
重复类型
Motif
PCＲ 产物
PCＲ product / bp
引物序列
Primer sequence
退火温度
Annealing temperature /℃
PBM044 GU644384 (AG) 19 171
5’-AAGGCCCACGTTGCCAGAC-3’
5’-GTTCCCGTTGATGCCCCAC-3’
58. 0
PBM069 GU644409 (CCG) 8 101
5’-CCCTTTCCCTTCAACAACAA-3’
5’-TACCGATCCATGGCTCCTT-3’
57. 4
PBM075 GU644415 (GAA) 8 101
5’-AGTTTCCTTCTTTCCTTCCTTCCGTGGTG-3’
5’-CGGCATTTGCGATTTGTGC-3’
53. 2
PBM080 GU644420 (AG) 16 116
5’-CGAGGTTCTTGGGCTCAGTT-3’
5’-ACACGCCTCCAATAAAACAAAC-3’
52. 8
PBM084 GU644424 (TC) 17 (AC) 19 201
5’-CTTCTCATGGGGTCAGCTACTC-3’
5’-ATCACTTCTGCGATCTTGGTC-3’
52. 2
PBM087 GU644427 (CCT) 5 -(CGC) 9 166
5’-ACCCCAAGCATCCCCAAAA-3’
5’-CCGCAGGGAAGTCGAAGGTC-3’
59. 0
PBM091 GU644431 (AG) 14 126
5’-ATAGAGGCATACAGCCGCAGAC-3’
5’-TAGGCACGGCATCACGGAC-3’
56. 3
PBM095 GU644435 (CCT) 8 119
5’-TTATTAGTCGAGTTTGGGTCTCC-3’
5’-GGTGAACGGCATGGCTGCT-3’
55. 2
2 结果与分析
2. 1 遗传多样性
选用 8 个多态性较高 (PIC≥0. 36) 的位点(表
2)作为分析工具，检测 3 株开花毛竹(相互间隔大
于 30 km)上收集得到的自由授粉半同胞种子(2011
年度) 种群的遗传多态性(图 1 和表 3)。结果显
示: 3 个半同胞种群内存有遗传多态性，在 8 个 SSＲ
位点平均有效等位基因数( A e )为 1. 54，Shannon 指
数( I)平均为 0. 282，多态信息含量 ( PIC)平均为
0. 157(均小于 0. 25)，为低度多态基因座，种群遗传
多态度整体偏低; 3 个种群在 Nei 基因多样性指数
(H)、预期杂合度 (H e)等多态性指标上有差异，其
中荔浦种群最小，灵川种群居中，灌阳种群最大。
图 1 毛竹半同胞子代 (部分) 在 PBM069 位点上的基因型多态性
Fig． 1 Polymorphism of half-sib offsprings ( partial) in locus PBM069
M: 10 bp size marker; 1 － 27: 灵川半同胞子代个体 Half-sib offsprings from Lingchuan．
表 3 毛竹半同胞种群的遗传多态性
Tab． 3 Genetic diversity of half-sib populations in P． edulis
种群
Population
多态性位点
Percentage of
polymorphic
locus (P) (% )
平均有效
等位基因数
Average number
of effective allele
(Ae )
Shannon 指数
Shannon
index ( I)
Nei 基因
多样性指数
Nei’s
heterozygosity
(H)
预期杂合度
Expected
heterozygosity
(H e )
多态信息含量
Polymorphism
information
content(PIC)
荔浦 Lipu 62. 5 1. 30 0. 168 0. 113 0. 115 0. 109
灵川 Lingchuan 75. 0 1. 59 0. 306 0. 213 0. 216 0. 162
灌阳 Guanyang 75. 0 1. 73 0. 371 0. 262 0. 267 0. 199
平均 Mean 70. 1 1. 54 0. 282 0. 196 0. 199 0. 157
2. 2 异交系数等参数的估计
具体分析毛竹半同胞种群在最富有多态性的 8
个位点中基因型表现(表 4)。从表 4 可看出: 3 个
种群在 PBM044，PBM080，PBM095 位点上均表现出
87
第 8 期 刘政捷等: 应用微卫星分子标记估算毛竹的异交率
基因型多态性，荔浦种群在 PBM069，PBM075 和
PBM087 位点上未有多态基因型出现，灵川种群在
PBM087 位点上有特有的多态基因型表现而在
PBM075 和 PBM084 位点为单一基因型，灌阳种群在
PBM087 和 PBM091 上呈单一基因型表现。这些结
果说明，位于 3 个不同地点的开花植株都能够通过
与不同的外源花粉杂合，产生具有不同微卫星基因
型特点的遗传上多态的半同胞子代个体。利用这 8
个多态微卫星位点来估算毛竹的异交率等相关遗传
参数(表 4)。理论上所有子代个体至少含有 1 个来
自母本的等位基因，分析发现在 3 个位点上共有 9
个基因型不含有共同等位基因 (推测的母本基因
型，约为 0. 25% )，剔除这类子代个体数据。毛竹通
过地下鞭芽繁育，如地下鞭芽繁育的日本倭竹
(Sasa cernua ) 会出 现芽突变 ( Kitamura et al．，
2009)，产生微卫星基因型的变化，其突变率可达
4. 4% (Kitamura et al．，2011)。另外毛竹林的寿命
可达近 70 年，在长寿命植物如深山犬樱 ( Prunus
ssiori) 和北美乔柏 (Thuja plicata) 上发现微卫星位
点上产生突变基因型 ( Nagamitsu et al．，2004;
O’Connell et al．，2004)。3 个不同地点开花毛竹的
异交率 tm(多位点)和 ts (单位点)均表现出一定的
差异，荔浦和灵川为 0. 067 左右，灌阳为 0. 133 左
右，总体平均值均为 0. 089; 近交系数估算均值为
0. 181，表明家系子代中的纯合体过剩。本课题组也
曾采用同一方法分析了 2010 年开花的灵川和灌阳
的 2 个子代家系的材料(位于本文所研究的开花材
料不远)，其分析结果与本文的结果相近。这说明
毛竹交配系统主要以自交为主，兼顾有一定比例的
异交以确保其种群后代的遗传多样性。
表 4 毛竹异交系数等相关参数的估算及其在各个位点上的遗传多态性①
Tab． 4 Estimated outcrossing rates and relative parameters for each of three P． edulis flowering culms at 8 loci
样地 Site tm ts F is
基因型 Genotype
PBM044 PBM069 PBM075 PBM080 PBM084 PBM087 PBM091 PBM095
荔浦 Lipu 0. 067 (0. 0) 0. 066 (0. 0) 0. 157 p p p p p
灵川 Lingchuan 0. 067 (0. 0) 0. 067 (0. 0) 0. 186 p p p p p p
灌阳 Guanyang 0. 133 (0. 0) 0. 135 (0. 0) 0. 200 p p p p p p
平均 Mean 0. 089 (0. 0) 0. 089 (0. 0) 0. 181
①括号内为标准差; “p”表示基因型多态性; ts和 tm为单位点和多位点估算的异交率; F is为近交系数。Standard errors are in parentheses，
“p” indicates polymorphism， ts and tm are outcrossing rate estimated from single-locus and multi-locus data， respectively，and F is is inbreeding
coefficient．
3 讨论
迄今有关毛竹林种群形成的研究不多，形成机
制尚无定论。一般认为毛竹林每间隔 67 年就会同
时开花后大面积死亡，结实的毛竹种子在经历鼠类、
鸟类等吞食和萌发早期的高死亡率后，少数种子成
苗成秆并通过其地下鞭系系统延伸形成克隆分株而
恢复毛竹林种群 ( Janzen，1976; Watanabe et al．，
1982)。在开花后复兴的毛竹林中发现有多种不同
(AFLP)基因型的基株共存，并且具有不同的开花时
间，即不同基株的开花年度不同造成整个毛竹林种
群的开花可延续几年的现象 ( Isagi et al．，2004)。
本研究的采样地均位于人迹罕至的深山老林，没有
人为经营的记载，据采毛竹种子的山民介绍在采种
地的周边出现了持续几年的零星毛竹林开花。本文
分析了 3 个独立的半同胞家系的子代材料，结果表
明: 在半同胞家系内存在着一定程度的微卫星标记
多样性，同一家系子代个体中含有多种基因型的基
株。可以据此推测采样的这 3 片毛竹林种群很有可
能按上述的方式演化而来的，同时在开花后复兴的
同一片毛竹林中有多个基因型基株存在 ( Isagi
et al．，2004) 也是形成同一家系子代个体中含有多
种基因型的原因。
在半同胞家系中形成遗传多样子代的直接原因
是由于外来花粉的影响，这种影响通过携带着新基
因型的外来花粉与母株雌性配子的杂合 (异交，
outcrossing) 产生新基因型的杂合子代，而这种影响
的程度取决于异交的程度即异交率 ( outcrossing
rate)。因此通过异交率等参数研究竹子交配系统，
不但能了解竹子繁育生物学特性，也能阐明竹子种
群的遗传多样性和遗传结构，以制订育种改良策略。
目前对竹子的交配系统研究不多，通过野外观察和
人工授粉试验研究推测赤竹属 ( Sasa)竹种以自交
亲和性占主导地位 (Nishiwaki et al．，1990)，南美原
产 的 偏 穗 竹 属 ( Merostachys ) 竹 种 Merostachys
riedeliana 的自交率也可达 0. 99 ( Guilherme et al．，
2001)。本文基于 8 个多态 SSＲ 位点的分析结果也
支持上述的推测，估算的毛竹异交率为 0. 089。这
个结果略低于 Kitamura 等(2011) 报道的日本倭竹
在 6 个多态位点估算的异交率 0. 148。这些初步结
果表明: 毛竹与赤竹属、偏穗竹属的竹种一样，是一
种以自交为主导的、稍有兼顾异交的、具有较高自交
97
林 业 科 学 50 卷
亲和性的物种。同属禾本科 (Gramineae) 的野生稻
(Oryza rufipogon)1 年生品种多以自交 ( tm = 0. 04)
为主，多年生品种则为混合交配 ( tm = 0. 55 )
(Morishima et al．，1990)。
竹子按照其地下鞭系系统的延伸方式可分为散
生、丛生和混生 3 种类型 (Das et al．，2008)。毛竹
属于散生竹种，与丛生竹 M． riedeliana 和混生竹日
本倭竹相比，其地下鞭系系统具有更强、更远的延伸
能力，因而能够在远离母株 (秆)的地方繁殖克隆分
株 (秆)，从而增加竹林种群中同一基因型个体的数
量和比例。其结果也就如在野生稻报道的那样: 在
小范围内增加了同一克隆个体间的自交概率而降低
了异交的概率 ( Song et al．，2003)。事实上毛竹确
实具备一些适合于异交的生物学特性，如开花时其
柱头呈三瓣状、伸长超出内稃外露，似乎更容易接受
外来的花粉 (Liao，1990); 花粉直径在竹类植物中
属于较大的，刚竹属 ( Phyllostachys)的竹种多在 50
μm 以上 (张文燕等，1989)，相比较于其他禾本科
植物的花粉属于较大的 ( Shimakura et al．，1973);
在广西壮族自治区桂林市周边的采种地现场以及移
栽的开花竹种质资源圃，均能观察到蜜蜂授粉过程，
Guilherme 等(2001) 在 M． riedeliana 也报道过这种
虫媒授粉现象。此外，毛竹具集群开花 ( gregarious
flowering) 特性，在本研究收集供试种子的毛竹林中
虽只出现小范围(面积)开花，但开花的分株几乎是
整株开花产生了高密度的花粉，也有利于异交的发
生 (Nishiwaki et al．，1990)。另一方面，毛竹的种子
发芽率整体偏低，特别是没有人工防虫处理的荔浦
种群只有 15. 3% (表 1)。Liu 等(2005)的研究表
明: 普通野生稻种子的萌发与其基因型有关，存在
非随机种子萌发的现象。本试验中毛竹种子发芽率
与其遗 传 多样 性有一定程度的关联性 ( r2 =
0. 91＊＊＊)，近交系数估算均值为 0. 181，表明家系子
代中的纯合体过剩。如若出现自交衰退，种子萌发
阶段会因对纯合子的自然选择，造成种群中的纯合
体下降、杂合体的比例上升 ( Suso et al．，2008)。偏
低的发芽率会加剧这种选择，使得分析材料中的杂
合体比例增加而导致其异交率被高估。
本研究首次通过 DNA 分子标记技术估算了散
生竹种的异交率，高效、多态的微卫星标记有利于准
确鉴别外来花粉的基因流动，选用相隔大于 30 km
的 3 株野生开花植株的家系子代作为分析材料有望
克服毛竹克隆生长的弊端。分析结果揭示的毛竹交
配系统生物学特性为其种质资源保存策略制定以及
遗传育种研究奠定了基础，但准确阐明毛竹的生殖
特性还需对分布更为广泛的种群(家系)、更多的子
代个体进行分析，并综合各类相关参数。
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(责任编辑 徐 红)
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