全 文 ：第 ws卷 第 u期
u s s w年 v 月
林 业 科 学
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¤µqou s s w
桑粒肩天牛幼虫内切 p Βp t ow p葡聚糖酶
的纯化及性质
殷幼平 王中康 曹月青 何正波
k重庆大学生物工程学院 重庆 wsssvsl
摘 要 } 经丙酮沉淀 !˜¯·µ²ª¨¯ „¦„xw凝胶过滤 !±2≥ ³¨«¤µ²¶¨ 离子交换柱层析和聚丙烯酰胺凝胶制备电泳 o发现桑
粒肩天牛幼虫肠液中具有所有水解纤维素成分的三种消化酶 o并且每种酶都有不同数目的同工酶 ∀纯化出一种内
切 p Βp t ow p葡聚糖酶k∞Š p tl o其分子量为 uy ®∏o等电点约为 ³Œw1s ∀酶的最适反应温度为 wx ε o最适反应 ³‹ 为
x1u ~不耐热 oxs ε 处理 vs °¬±o酶活大大降低 ozs ε 处理 u«o几乎丧失全部活性 o显示出该酶适合动物肠道反应环境 o
是内源性酶 ∀
关键词 } 桑粒肩天牛 o内切2Β2t ow2葡聚糖酶 o纯化 o特性
中图分类号 }≥zt{1z 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kusswlsu p stsv p sw
收稿日期 }ussu p s{ p tu ∀
基金项目 }国家自然科学基金资助kv|zzsyutl ∀
Πυριφιχατιον ανδ Προπερτιεσ οφ Ενδο p Βp t ow p γλυχανασεφροµ Λαρϖαε οφ Απριονα γερµαρι
≠¬± ≠²∏³¬±ª • ¤±ª«²±ª®¤±ª ≤¤² ≠∏¨ ¬´±ª ‹¨«¨ ±ª¥²
k Σχηοολοφ Βιοενγινεερινγ oΧηονγθινγ Υνιϖερσιτψ Χηονγθινγwsssvsl
Αβστραχτ } ’±¨ ±¨§²p Βp t ow p ª¯∏¦¤±¤¶¨ k∞Šp tl º¤¶³∏µ¬©¬¨§·²¨¯ ¦¨·µ²³«²µ¨·¬¦¤¯ «²°²ª¨ ±¨ ¬·¼©µ²°·«¨ ª∏·¨¬·µ¤¦·²© Απρι2
ονα γερµαρι ¤¯µ√¤¨ ¥¼¤¦¨·²±¨ ³µ¨¦¬³¬·¤·¬±ªoª¨¯©¬¯·µ¤·¬±ªo¬²± ¬¨¦«¤±ª¨ ¦«µ²°¤·²ªµ¤³«¼¤±§³µ¨³¤µ¤·¬√¨ °„Š∞o¤±§¬·¶ ±¨½¼°¤·2
¬¦³µ²³¨µ·¬¨¶º¨ µ¨ ¬±√¨ ¶·¬ª¤·¨§q׫¨ ±¨½¼°¨ ¦²°³²±¨ ±·¶«²º¨ §«¬ª«¤¦·¬√¬·¼²±¶²§¬∏°¦¤µ¥²¬¼°¨ ·«¼¯¦¨¯¯∏¯²¶¨ k≤≤l q׫¨ °²2
¯¨ ¦∏¯¤µº¨ ¬ª«·²©∞Šp t º¤¶uy®∏¤±§·«¨ ¬¶²¨ ¯¨ ¦·µ¬¦³²¬±·k³Œl º¤¶¤¥²∏·w1s1 Œ·«¤§¤±²³·¬°¤¯ ·¨°³¨µ¤·∏µ¨ ²©wx ε ¤±§²³·¬2
°¤¯ ³‹ ²©x1u1 ׫¨ ±¨½¼°¨ ¤¦·¬√¬·¼ º¤¶¶·¤¥¯¨¤·vz ε ©²µ¤·¯ ¤¨¶·u«o¥∏·§¨¦µ¨¤¶¨§µ¤³¬§¯¼ º«¨ ± ®¨ ³·¤·xs ε ¤±§¤¯°²¶·±²
¤¦·¬√¬·¼ º¤¶¯ ©¨·¤©·¨µ¬±¦∏¥¤·¨§¤·zs ε ©²µu«q„¯¯·«¨¶¨ ¶«²º¨ §·«¤·∞Šp t¦²°³²±¨ ±·º¤¶¶∏¬·©²µ·«¨ ¬±¶¨¦·¬±·¨¶·¬±¤¯ ±¨√¬µ²±2
°¨ ±·o¤±§¶«²∏¯§¥¨ ¤ ±¨§²ª¨ ±²∏¶ ±¨½¼°¨ q
Κεψ ωορδσ} Απριονα γερµαρι o∞±§²p Βp t ow p ª¯∏¦¤±¤¶¨ o°∏µ¬©¬¦¤·¬²±o°µ²³¨µ·¬¨¶
纤维素是地球上含量最丰富的碳水化合物 o它是由 Βp t ow p葡萄糖苷键连接而成的葡聚糖链 ∀纤维素
的降解一般是通过微生物的作用进行的 o一些昆虫也能消化食物中的纤维素成分k蒋书楠等 ot||y ~殷幼平
等 ousss ~…µ¨½±¤®ot||w ~Œ±²∏¨ ετ αλqot||z ~Œ·¤®∏µ¤ot||{ ~ ¤·¬±ot|{v ~• ¬¯¯¬¤°¶ot|z{l ∀桑粒肩天牛k Απριονα
γερµαριl是一种重要的林木害虫 o其幼虫钻蛀于树干中以木质纤维素为食 o导致树势衰弱 o严重影响林木生长
和产品质量 ∀本文通过对桑粒肩天牛幼虫肠道主要纤维素酶的分离纯化及其性质测定 o为从其消化生理方
面探讨新的防治策略提供理论基础 ∀同时 o纤维素酶的纯化为测定桑天牛主要纤维素酶的氨基酸序列 o推断
纤维素酶的基因序列 o进而为开发新的纤维素酶资源奠定基础 ∀
t 材料与方法
111 实验昆虫
天牛幼虫采于西南农业大学校园内 o寄主为桑树或构树 ∀解剖前使其饥饿 t天 o排除体内食物残渣 ∀
112 方法
t1u1t 粗酶液的制备 zx h酒精消毒天牛体表 o冰浴下解剖天牛 o取其肠道 o置于 s1st °²¯ ³‹ x1x乙酸 p乙
酸钠缓冲液中kt °#ªpt虫体重l o研磨后以 tu sssµ#°¬±pt离心 o取上清液即为粗酶液 ∀
t1u1u 酶的纯化 粗酶液中加入预冷丙酮 o使其终体积分数为 {s h os ε 放置 w «otx sssµ#°¬±pt冷冻离心取
沉淀备用 ∀凝胶过滤 }将丙酮沉淀的蛋白质溶于 s1st °²¯ ³‹ x1x ‹„¦p‘¤„¦缓冲液中 o上样于 ˜¯·µ²ª¨¯ „¦„xw
凝胶柱ku1y ¦° ≅ |s ¦°l o用平衡缓冲液进行洗脱 o收集与其他纤维素酶活性峰交叉较少的内切 p Βp t ow p葡
聚糖酶k ±¨§²p Βp t ow p ª¯∏¦¤±¤¶¨ o∞Šl活性峰洗脱液 o真空浓缩 ∀离子交换柱层析 }将上步浓缩液用 s1st °²¯
³‹ x1{ ‹„¦p‘¤„¦缓冲液透析平衡 o加到 ± p ≥¨ ³«¤µ²¶¨ 柱上kt1s ¦° ≅ tx ¦°l ∀用 xs °s1st °²¯ ³‹ x1{ ‹„¦p
‘¤„¦加 xs °t °²¯ ‘¤≤¯ k乙酸缓冲液配制l进行连续梯度洗脱 o测定各管收集液的 „u{s及 ∞Š酶活性 ∀收
集 ∞Š酶活性较高的部分 o用于 °„Š∞制备电泳 ∀聚丙烯酰胺凝胶制备电泳k°„Š∞l }除未加 ≥⁄≥外 o其余参
照莽克强等kt|zxl法进行 ∀分离胶浓度为 tu1x h o浓缩胶浓度为 w h o电泳结束后 o切下边缘 t ¦°宽的胶条
与含 ≤ ≤ p ‘¤的琼脂底物平板进行印迹 o活性带显色采用刚果红作染色剂 o参照 …¤µ·¯¨¼等kt|{wl方法进行 ∀
从剩余胶板上切下活性带相应位置处的胶条 o放置于装有 s1st °²¯ ³‹ x1x ‹„¦p ‘¤„¦缓冲液的透析袋内 o
进行电洗脱后用于分子量和等电点测定 ∀
t1u1v 纤维素酶活性测定 内切 p Βp t ow p葡聚糖酶k∞Šl !Βp t ow p葡萄糖苷酶活性测定分别以 t h的羧
甲基纤维素钠k≤≤ p ‘¤l !t h的水杨苷为底物k均用 s1st °²¯ ³‹ x1x ‹„¦p ‘¤„¦缓冲液配制l ∀取 s1x °
底物溶液 o加入 tss ˏ酶液 ovz ε 水浴反应 t «o水解产生的还原糖用 ≥²°²ª¼¬p ‘¨ ¶¯²±微量法测定k • ¬¯¯¬¤°¶ετ
αλqot|z{l ∀对照以缓冲液代替酶液 o其余步骤相同 ∀以测定条件下产生 t Λ°²¯#«pt还原糖的酶量定义为一
个酶活力单位 ∀比活为每 °ª蛋白质所含有的酶活力单位 ∀纤维二糖水解酶k≤…‹l活性测定参照 Œ±²∏¨ 等
kt||zl的方法进行 ∀以本实验条件下产生 s1t Λ°²¯#«pt对 p硝基苯的酶量定义为一个酶活力单位 ∀
t1u1w ≥⁄≥2聚丙烯酰胺凝胶电泳k≥⁄≥ p °„Š∞l 参照何忠效等方法kt||sl o采用 ×µ¬¶p ×µ¬¦¬±缓冲液系统进
行 ∀分离胶浓度为 tu1x h o浓缩胶浓度为 x h o银染染色 ∀
t1u1x 等电聚焦电泳kŒ∞ƒl 按何忠效等kt||sl薄层凝胶等电聚焦法 ∀凝胶薄层为 |ss °° ≅ tus °° ≅ s1x
°° o凝胶浓度为 z1x h o内含 u1x h两性电解质k³‹ v1x ∗ xl o聚焦在 ws ε 下进行 ∀电源电压 !电流最高值限定
为 t uss ∂ !vs °„ o恒功率 x • 聚焦 ∀聚焦完毕 o从凝胶两边切下 t ¦°宽的胶条 o切成 s1x ¦°小段 o依顺序放
于 s1x °离心管中 o分别加入 tss ˏ蒸馏水浸泡过夜 o用精密试纸测定 ³‹ o绘制 ³‹ p距离图 o测定等电点 o
其余凝胶做酶活和蛋白质染色 ∀
t1u1y 蛋白质浓度的测定 柱层析洗脱液蛋白质浓度以吸光度 „u{s表示 o采用 …µ¤§©²µ§方法kt|zyl ∀
u 结果与讨论
211 酶的纯化
图 t所示 o粗酶液经 ˜¯·µ²ª¨¯ „¦„ xw凝胶过滤层析后 o洗脱出 u个蛋白质峰 o≤…‹ !∞Š和 Βp t ow p葡萄糖
苷酶 v种酶活性成分都位于第 u个蛋白质峰内 ∀ ≤…‹与葡萄糖苷酶活性峰基本重合 o而 ∞Š酶活性峰与这
两种酶重合较少 ∀收集 ∞Š酶活性较高且另外两种酶含量较低的部分 o透析后冷冻浓缩 ∀再将此浓缩液上 ±
p ≥¨ ³«¤µ²¶¨ 离子交换柱进一步纯化 ∀从层洗脱曲线可见 o部分杂蛋白被除去 o∞Š酶仅一个洗脱峰k图 ul ∀
图 t 肠道纤维素酶凝胶过滤纯化
ƒ¬ªqt °∏µ¬©¬¦¤·¬²± ²©¦¨¯¯∏¯¤¶¨¶²± ˜¯·µ²ª¨¯ „¦„xw ª¨¯©¬¯·µ¤·¬²±
) υ ) 蛋白质浓度 „u{s °µ²·¨¬± ¦²±¦¨±·µ¤·¬²± „u{s
) ο ) 内切 p Βp t ow p葡聚糖酶 ∞±§²p Βp t ow p ª¯∏¦¤±¤¶¨
) ϖ ) 纤维二糖水解酶 Βp t ow p ª¯∏¦²¶¬§¤¶¨
) 3 ) 纤维二糖酶 ≤¨¯ ²¯¥¬²«¼§µ²¯¤¶¨¶
图 u ∞Š p t酶 ± p ≥¨ ³«¤µ²¶¨ 离子交换柱层析纯化
ƒ¬ªqu °∏µ¬©¬¦¤·¬²± ∞Š ±¨½¼°¨ ²± ± p ≥¨ ³«¤µ²¶¨
) ) ) 蛋白质浓度 °µ²·¨¬± ¦²±¦¨±·µ¤·¬²± k„u{sl
) τ ) ∞Š p t酶活性 ∞Š p t ∞±½¼°¨ ¤¦·¬√¬·¼
wst 林 业 科 学 ws卷
u1t1t °„Š∞制备 将离子交换所得样品进行 °„Š∞制备 o电泳结束后 o用底物平板印迹 ∀红色底物平板上
的透明带即为 ∞Š酶活性带k图 vl ∀在聚丙烯酰胺凝胶上与此透明带相对应的蛋白带即为 ∞Š酶 ∀从染色
结果可见 o粗酶液经分子筛和离子交换柱层析后所的活性峰仍然为一混合物 o°„Š∞染色后可见多条蛋白质
带 ∀电泳后切下与底物平板上的最大活性带相对应的凝胶 o电洗脱浓缩后测定其纯度得到单一酶带 o命名为
∞Š p tk见表 tl ∀
u1t1u 酶的纯度检测 经 ≥⁄≥ p °„Š∞及 Œ∞ƒ检测制备 °„Š∞分离纯化所得 ∞Š p t酶 o均呈现一条单带 o说
明此 ∞Š p t酶已达到电泳纯 o如图 w !x o测其分子量及等电点分别为 uy ®∏!³Œw1s ∀
表 1 桑粒肩天牛幼虫 ΕΓ − 1 酶的纯化
Ταβ . 1 Πυριφιχατιον οφλαρϖαλ ΕΓ − 1 φροµ Α . γερµαρι
∞Š2t酶分离纯化步骤
°∏µ¬©¬¦¤·¬²± ¶·¨³¶
蛋白质含量
°µ²·¨¬± ¦²±·¨±·Π°ª
比活
≥³¨¦¬©¬¦¤¦·¬√¬·¼Πk˜#°ªptl
纯化倍数
°∏µ¬©¬¦¤·¬²±©²¯§
收率
• ¦¨²√ µ¨¼ ²©¤¦·¬√¬·¼Πh
粗酶 ≤µ∏§¨ ±¨½¼°¨ t|v v1xt t tss
丙酮沉淀 „¦¨·²±¨ ³µ¨¦¬³¬·¤·¬²± tsu w1tv t1t{ yu
凝胶层析 ˜¯·µ²ª¨¯ „¦„xw ª¨¯©¬¯·µ¤·¬²± tu ts1x u1|| t{1y
分子筛层析 ± p ≥¨ ³«¤µ²¶¨ ¬²± ¬¨¦«¤±ª¨ t1x ys tz1t tv1u
制备电泳 °µ¨³¤µ¤·¬√¨ °„Š∞ s1tt tyv wy1w u1yw
212 酶的性质
收集桑粒肩天牛肠道酶液凝胶过滤 ∞Š酶活性峰处的洗脱液 o用于酶的性质测定 ∀
u1u1t ∞Š酶最适反应温度及热稳定性 以 s1t °²¯ ³‹ x1y ‘¤u ‹°’w p s1sx °²¯ 柠檬酸缓冲液配制的 t h
≤≤ p ‘¤溶液为底物 o分别在不同孵育温度下测定 ∞Š酶的活性 ∀图 y显示 o∞Š最适反应温度为 wx ε ∀
将酶液在 us !vz !xs !zs ε 下分别水浴预处理 vs !ys !tus °¬±后 o在 vz ε 测定 ∞Š酶的酶活力 o以未经预处
理酶液活力为 tss o计算不同处理后剩余酶活力 ∀us ε !vz ε 处理 u «o酶活损失不大 ~xs ε 处理 vs °¬±o酶活
急剧下降 ~zs ε 处理 u «o酶已几乎全部失活k图 zl ∀
u1u1u ∞Š酶最适反应 ³‹ 以柠檬酸缓冲液k³‹ u1y ∗ {1sl按每 s1y ³‹梯度间隔配制的 t h ≤≤ p ‘¤溶液
为底物 o测定酶的活性 o测得桑粒肩天牛 ∞Š酶最适作用 ³‹为 x1u o如图 { ∀
图 v ∞Š p t酶 °„Š∞银染及印记染色
ƒ¬ªqv ‘¤·¬√¨°„Š∞ ¤±§³µ¬±·¦«µ²°¤·²ªµ¤³«¼ ²© ∞Š p t
¤}蛋白质银染 …¤±§¶²©³µ²·¨¬±~
¥}酶活性染色 …¤±§²© ±¨½¼°¨¤¦·¬√¬·¼q
图 w ∞Š p t ≥⁄≥ p °„Š∞银染蛋白质谱带
ƒ¬ªqw °∏µ¬©¬¨§∞Š p t ²©≥⁄≥ p °„Š∞
¤}纯化的 ∞Š p t酶 °∏µ¬©¬¨§∞Š p t ~
¥}蛋白质标准 °µ²·¨¬± °¤µ®¨µ¶q
图 x ∞Š p t酶 Œ∞ƒ银染
ƒ¬ªqx Œ∞ƒ ²©³∏µ¬©¬¨§∞Š p t
图 y 温度对 ∞Š酶的影响
ƒ¬ªqy ∞©©¨¦·²©·¨°³¨µ¤·∏µ¨ ²± ∞Š
图 z ∞Š酶的热稳定性
ƒ¬ªqz ∞©©¨¦·²©·¨°³¨µ¤·∏µ¨ ²± ¶·¤¥¬¯¬·¼ ²© ∞Š
) σ ) us ε ) υ ) vz ε ) ω ) xs ε ) π ) zs ε
图 { ³‹对 ∞Š酶的影响
ƒ¬ªq{ ∞©©¨¦·²©³‹ ²± ∞Š
xst 第 u期 殷幼平等 }桑粒肩天牛幼虫内切 p Βp t ow p葡聚糖酶的纯化及性质
213 讨论
关于昆虫纤维酶的种类 o至今仍有很大争议 ∀有人认为纤维素的消化需要 ∞Š酶 !≤…‹ !Βp t ow p葡萄糖
苷酶 v种酶的协同作用 o缺一不可kŒ·¤®∏µ¤ ετ αλqot||{ ~¤µ·¬± ot|{vl ~也有的认为 ≤…‹并非必需 o∞Š酶具有
≤…‹的作用 o仅依靠 ∞Š酶和 Βp t ow p葡萄糖苷酶便可将纤维素水解为单糖kŒ·¤®∏µ¤ot||{ ~≥¦µ¬√¨ ±¨ µετ αλqo
t|{|l ∀桑粒肩天牛肠道中可以检测到 v种纤维素酶活性 o但 ≤…‹酶活性很弱 o其在天牛对纤维素的消化中
究竟起多大作用 o还有待于进一步研究 ∀凝胶过滤 ∞Š酶和 ≤…‹的活性峰重合很少 o而 Βp t ow p葡萄糖苷酶
与 ≤…‹活性峰几乎完全重合 ∀离子交换柱层析还显示 o几种纤维素酶都有不同数目的同工酶 ∀
天牛消化纤维素酶的来源一直有争议 ∀本研究说明桑粒肩天牛的 ∞Š p t酶的热稳定性 !最适作用温
度 !最适反应 ³‹ 等等均无极端要求 o与真菌等微生物的纤维素酶有很大区别k崔福锦等 ot|{w ~蒋书楠等 o
t||yl ~曹月青等kusstl从桑粒肩天牛前中肠肠液分离到一株兼性厌氧纤维素分解菌 o其分解纤维素的能力
较强 o但数量较少k约每条虫体含 v ≅ tsv 个l o且仅在部分天牛个体中分离到 o没有纤维素分解菌的天牛 o并
不影响其消化纤维素的能力和生长发育 ∀以该菌培养产生的纤维素酶热稳定性大大高于天牛纤维素酶 o
zs ε 处理 u «o仍可保持 ys h以上的残存酶活tl o显示本研究纯化出的 ∞Š酶适合动物肠道反应环境 o是内源
性酶 ∀
tl曹月青 q桑粒肩天牛幼虫纤维素酶的分布 !来源及分离纯化 q重庆 }西南农业大学植保系 ousss
在 ∞Š p t酶凝胶制备电泳纯化过程中 o酶在凝胶上的准确定位是重要的一步 ∀前人的研究中通常采用
等电聚焦电泳 o将 ≤≤ p ‘¤加入凝胶 o电泳后染色 o确定目标蛋白质在凝胶上的准确位置 ∀尽管 ≤≤ p ‘¤
是水溶性纤维素 o但因其分子量较大 o在聚丙烯酰胺凝胶中分散较差 o染色效果常常不好 ~同时由于两性电解
质 ³‹范围的限制 o等电点偏酸 !偏碱的蛋白质分离效果都不好 o本研究中采用了非变性聚丙烯酰胺凝胶电
泳 o电泳结束后将凝胶紧贴在含 ≤≤ p ‘¤的底物平板上反应显色 o既消除了 ³‹ 的限制 o保持了 ∞Š酶的活
性 o又能在底物平板上显示 ∞Š酶的原始谱带位置 o是 ∞Š酶纯化及在凝胶上定位的一种较为理想的方法 ∀
天牛是少数能自身分泌纤维素酶消化食物中纤维素成分的动物类群之一 ∀天牛能蛀入树木内取食木质
纤维 o其纤维素酶在天牛肠道中能稳定有效地作用于食物中的纤维素成分 o对天牛的正常生理代谢起着重要
作用 o有望成为天牛防治新的分子靶标 ∀对天牛纤维素酶的研究 o将为从消化机理入手的新型害虫防治策略
提供理论基础 ∀同时天牛纤维素酶有可能成为一种新的酶资源和基因资源 o为提高动物的食物利用率服务 ∀
参 考 文 献
曹月青 o殷幼平 o董亚敏等 q桑粒肩天牛肠道纤维素分解细菌的分离和鉴定 q微生物通报 ousst ou{ktl }{ p tt
崔福锦 o那 安 o马建华 q不同真菌纤维素酶一些生物化学性质的比较 q真菌学报 ot|{w ovktl }x| p yw
何忠效 o张树政 q电泳 q北京 }科学出版社 ot||s
蒋书楠 o殷幼平 o王中康 q几种天牛纤维素酶的来源 q林业科学 ot||y ovukxl }wwu p wwy
莽克强 o徐乃正 q聚丙烯酰胺凝胶电泳 q北京 }中国科学出版社 ot|zx
殷幼平 o曹月青 o何正波等 q桑粒肩天牛三种纤维素酶的分布与来源 q林业科学 ousss ovykyl }{u p {x
…¤µ·¯¨¼ × ⁄oŽ¤·«¯¨¨ ±  o⁄²∏ª¯¤¶∞ ∞q„ ° ·¨«²§©²µ·«¨ §¨·¨¦·¬²± ¤±§§¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²± ²©¦¨¯¯∏¯¤¶¨ ¦²°³²±¨ ±·¶¬± ³²¯¼¤¦µ¼¯¤°¬§¨ ª¨¯q „±¤¯¼·¬¦¤¯ …¬²¦«¨ °¬¶·µ¼o
t|{w otws }txz p tyt
…µ¤©²µ§   q„ µ¤³¬§¤±§¶¨±¶¬·¬√¨ ° ·¨«²§©²µ·«¨ ∏´¤±·¬·¤·¬²± ²© °¬¦µ²ªµ¤° ∏´¤±·¬·¬¨¶²©³µ²·¨¬± ∏·¬¯¬½¬±ª·«¨ ³µ¬±¦¬³¯¨²©³µ²·¨¬±p §¼¨ ¥¬±§¬±ª „µ¤¯ q…¬²¦«¨ ° o
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Œ±²∏¨ × o ∏µ¤¶«¬°¤Žo„½∏°¤Œ ετ αλq≤¨¯ ∏¯¯²¶¨ ¤±§¬¼¯¤± ∏·¬¯¬¶¤·¬²±¬±·«¨ ²¯º µ¨·¨µ°¬·¨ µ¨µ¬¦∏¯¬·¨µ°¨ ¶¶³¨µ¤·∏¶¤qŒ±¶¨¦·°«¼¶¬²¯ ot||z owv }uvx p uwu
Œ·¤®∏µ¤≥ o„®¬² ∞oפ±¤®¤ ‹ q°¤µ·¬¤¯ ³∏µ¬©¬¦¤·¬²±²©¦¨¯¯∏¯¤¶¨ ©µ²° Χοπτοτερµεσφορµοσανυσ ≥«¬µ¤®¬¤±§¦«¤µ¤¦·¨µ¬½¤·¬²±²©«¼§µ²¯¼¶¬¶³µ²§∏¦·¶©µ²° ¦µ¼¶·¤¯ ¬¯±¨ ¦¨ 2¯
∏¯¯²¶¨ ¥¼·«¨ ¦¨¯¯∏¯¤¶¨¶q³± ∞±√¬µ²± ∞±·²°²¯ ²²¯ ot||{ o| }tw{ p txz
¤µ·¬±   q≤¨¯ ∏¯¯²¶¨ §¬ª¨¶·¬²±¬±¬±¶¨¦·¶q≤²°³ …¬²¦«¨ ° °«¼¶¬²¯ ot|{v ozx„kvl }vtv p vuw
≥¦µ¬√¨ ±¨ µ„  o≥¯ ¤¼·²µ o •²¶¨ ‹ „ q≥¼°¥¬²±·2¬±§¨ ³¨ ±§¨ ±·§¬ª¨¶·¬²± ²© ¦¨¯¯∏¯²¶¨ ¤±§¶·¤µ¦«¬± Πανεστηια χριβρατα ¶¤∏¶¶∏µ¨ o¤± ¤∏¶·µ¤¯¬¤± º²²§2 ¤¨·¬±ª¦²¦®2
µ²¤¦«qŒ±¶¨¦·°«¼¶¬²¯ ot|{| ovxktul }|vx p |wt
• ¬¯¯¬¤°¶o ∂¬¯¯¤µ²¼¤ ‹ o°¨ ·¨® ƒ qΑ2ª¯∏¦²¶¬§¤¶¨ µ o ¶ ¤±§ · ©µ²° ¶¨ §¨¶²© Τριφολιυµ ρεπενσq…¬²¦«¨ ° ot|z{ otzx }tsy| p tszz
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