全 文 ：第 wu卷 第 |期
u s s y年 | 月
林 业 科 学
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国槐离体再生及抗虫基因 σχκ的转导 3
张晓英t 王华芳t 朱 祯u 王天祥t 尹伟伦t
kt q北京林业大学生物科学与技术学院 北京 tsss{v ~u q中国科学院遗传与发育生物学研究所 北京 tsststl
摘 要 } 以国槐叶片作为外植体 o筛选出诱导不定芽分化的最佳培养基 ~利用根癌农杆菌介导法将经过修饰的广
谱抗虫基因豇豆胰蛋白酶抑制剂基因 σχκk≥¬ª±¤¯2≤³×Œ2Ž⁄∞l导入国槐 ∀国槐叶片与农杆菌共培养结束后 o转移至
筛选培养基 ≥ n …„ v °ª#pt n Œ„„ s1sx °ª#pt n Šwt{ { °ª#pt n ≤ ©¨xss °ª#pt上 ∀不定芽在培养基 tΠu≥ n
Œ…„ t1s °ª#pt n Šwt{ ts °ª#pt n ≤ ©¨tss °ª#pt上进一步培养获得完整再生植株 ∀通过 °≤• 和 ≥²∏·«¨µ± ¥¯²·¬±ª
检测证明 o修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因 σχκ已成功导入国槐细胞 ∀
关键词 } 国槐 ~根癌土壤农杆菌 ~豇豆胰蛋白酶抑制剂基因 σχκ~基因转导
中图分类号 }≥zt{1wy ~±|wv1u 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kussyls| p ssvw p sx
收稿日期 }ussx p sv p ts ∀
基金项目 }国家高技术研究发展计划k{yv计划l kusst„„uwwswtl ∀
3 尹伟伦为通讯作者 ∀
Ιν ςιτρο Ρεγενερατιον ανδ Αγροβαχτεριυµ Τρανσφορµατιον οφ Σοπηοραϕαπονιχα ωιτη σχκ Γενε
«¤±ª÷¬¤²¼¬±ªt • ¤±ª ‹∏¤©¤±ªt «∏«¨ ±u • ¤±ª×¬¤±¬¬¤±ªt ≠¬± • ¬¨¯∏±t
kt1 Χολλεγε οφ ΒιολογιχαλΣχιενχεσ ανδ Βιοτεχηνολογψo Βειϕινγ Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ Βειϕινγ tsss{v ~
u1 Ινστιτυτε οφ Γενετιχσ ανδ ∆εϖελοπµενταλ Βιολογψo Χηινεσε Αχαδεµψοφ Σχιενχεσ Βειϕινγ tsststl
Αβστραχτ } Σοπηοραϕαπονιχᬶ¤√¤¯∏¤¥¯¨ª¤µ§¨±¬±ª·µ¨¨·«¤·«¤¶¥¨ ±¨ ³¯¤±·¨§¬±·«¨ ‘²µ·«²© ≤«¬±¤q ‹²º¨ √¨ µo¤³µ²¥¯ °¨
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¬¨³¯¤±·¶o·«¨ ²³·¬°∏° °¨ §¬∏° ©²µ·«¨ ¬±§∏¦·¬²± ²© ¤§√¨ ±·¬·¬²∏¶¥∏§ §¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²± º¤¶¶¨¯¨ ¦·¨§q ²§¬©¬¨§ ¦²º³¨¤·µ¼³¶¬±
¬±«¬±¬·²µk≤³×Œlª¨ ±¨ σχκk≥¬ª±¤¯2≤³×Œ2Ž⁄∞l o ¤± ¬±¶¨¦·¬¦¬§¤¯ ª¨ ±¨ o º¤¶¬±·µ²§∏¦¨§¬±·² Σ q ϕαπονιχα ¥¼ Αγροβαχτεριυµ2
°¨ §¬¤·¨§ª¨ ±¨·¬¦·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±q„©·¨µ¦²¦∏¯·¬√¤·¬²±²©¯¨ ¤√¨ ¶²© Σ qϕαπονιχα º¬·« Αγροβαχτεριυµ τυµεφαχιεν󫤵¥²µ¨§σχκ ª¨ ±¨ o
®¤±¤°¼¦¬± µ¨¶¬¶·¤±¦¨ ¶«²²·¶º¨ µ¨ ·µ¤±¶©¨µµ¨§·²¶¨¯¨ ¦·¬√¨ ≥ °¨ §¬∏° ¦²±·¤¬±¬±ªv °ª#pt …„ os1sx °ª#pt Œ„„ o{ °ª#pt
Šwt{ ¤±§xss °ª#pt ¦¨©²·¤¬¬°¨ q×µ¤±¶ª¨±¬¦³¯¤±·¶º¨ µ¨ ²¥·¤¬±¨ §¤©·¨µµ²²·¬±ª²± «¤¯©2¶·µ¨±ª·« ≥ °¨ §¬∏°¶∏³³¯ °¨¨ ±·¨§º¬·«
t1s °ª#pt ¬±§²¯ 2¨v2¥∏·¼µ¬´∏¨ ¤¦¬§¨ kŒ…„l ots °ª#pt Šwt{ ¤±§tss °ª#pt ¦¨©²·¤¬¬°¨ q °≤• ¤±§ ≥²∏·«¨µ± ¥¯²·¬±ª
¦²±©¬µ°¨ §·«¤·²§¬©¬¨§≤³×Œ ª¨ ±¨ kσχκlº¤¶¶∏¦¦¨¶¶©∏¯¯ ¼·µ¤±¶©¨µµ¨§¬±·² Σ qϕαπονιχα °¨ §¬¤·¨§¥¼ Αqτυµεφαχιενσq
Κεψ ωορδσ} Σοπηοραϕαπονιχα~ Αγροβαχτεριυµ τυµεφαχιενσ~¦²º³¨¤·µ¼³¶¬±¬±«¬±¬·²µk≤³×Œl ª¨ ±¨ σχκ~ª¨ ±¨ ·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±
国槐kΣοπηοραϕαπονιχαl原产中国北方k陈嵘 ot|xzl o为华北 !西北地区城乡重要的绿化树种 ∀但是国槐的
害虫种类甚多 o初步统计有 tw种以上k弗林特等 ot|{xl o槐尺蠖kΣεµιοτηισα χινερεαριαl的危害较大 ∀大量施用
化学杀虫剂 o不仅对人 !畜 !树木的正常生长构成了威胁 o而且造成了/虫 p药0双重的环境污染 ∀随着植物生
物技术的日益发展 o通过基因工程手段导入外源抗虫基因培育国槐抗虫新品系成为可能 ∀豇豆胰蛋白酶抑
制剂k¦²º³¨¤·µ¼³¶¬±¬±«¬¥¬·²µo≤³×Œl属丝氨酸蛋白酶抑制剂类型 o是一种重要的抗虫蛋白 o对大部分鳞翅目害
虫有抑制作用 o目前已经导入杨树中k郝贵霞等 ousstl o并且证明具有一定的抗虫效果 ∀
us世纪 {s年代初期 o陈维伦等kt|{ul首次报道了通过国槐子叶及胚轴的培养来获得不定芽 ~之后王
之等kt||v¤~t||v¥~t||zl先后通过胚胎发生 !花药培养等手段获得再生植株 ∀但是 o关于国槐抗虫转基因的
研究 o国内外未见成功的报道 ∀本文筛选出了繁殖系数较高的叶片再生体系 o利用根癌农杆菌介导法成功地
将经过修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因 σχκ导入国槐 o获得了再生植株 o并对其进行分子鉴定 ∀
t 材料与方法
111 材料
所用植物材料取自北京林业大学植物生物技术学科实验室 ∀无菌苗由国槐种子k购自北京市种苗站l萌
发 o在附加y2…„ t1s °ª#pt和Œ„„ s1t °ª#pt的 ≥k∏µ¤¶«¬ª¨ ετ αλqot|yul培养基上进一步继代繁殖得来 o苗
高均为 t1s ¦°以上 ∀
根癌土壤农杆菌kΑγροβαχτεριυµ τυµεφαχιενσl…„wwsw携带的质粒 ³…¬±8≥≤Ž含修饰的豇豆胰蛋白酶抑制
剂k≤³×Œl基因 σχκo由中国科学院遗传与发育生物学研究所 yst组实验室构建k刘春明等 ot||vl o主要结构为
˜¥¬2≥¬ª±¤¯2≤³×Œ2Ž⁄∞2×±²¶k图 tl ∀
图 t ³…¬±8≥≤Ž质粒结构
ƒ¬ªqt ⁄¬¤ªµ¤° ²©³¯¤¶°¬§³…¬±8≥≤Ž
112 国槐转化和植株再生
t1u1t 再生体系的建立 从无
菌苗上摘取较幼嫩健康的叶片
k带叶柄l o接种在含不同浓度不
同激素组合的固体培养基上 o基
本培养基为 ≥ o根据预备试验和相关资料 o分别附加 Œ„„ks1sx os1t °ª#ptl oyp…„kt ov ox °ª#ptl和 u owp⁄
ks1sx os1t °ª#ptl ∀通过随机区组试验 o设计了 y组试验 o即 t } ≥ n …„ t1s °ª#pt n Œ„„ s1t °ª#pt ~
u } ≥ n …„ v1s °ª#pt n Œ„„ s1sx °ª#pt ~ v } ≥ n …„ x1s °ª#pt nŒ„„ s1t °ª#pt ~ w } ≥ n …„ t1s
°ª#pt n u owp⁄s1sx °ª#pt ~x }≥ n …„ v1s °ª#pt n u owp⁄s1t °ª#pt ~ y }≥ n …„ x1s °ª#pt n u owp⁄
s1t °ª#pt ∀v种不同浓度的激素 o蔗糖为 v h o琼脂粉 s1y h o³‹值为 x1{ o培养温度为 uu ∗ uy ε o光照强度
为t xss ∗ u sss ¬¯o前期遮光培养直至外植体完全愈伤化 o再按每日 tv ∗ tw «的光照培养 o每月继代 t次 ∀培
养 xs §后统计结果 ∀详细结果见表 t ∀本试验中不定芽高度超过 s1u ¦°的为有效统计芽 ∀计算愈伤诱导率
及不定芽分化率公式如下 }愈伤诱导率 € k产生愈伤的外植体数Π接种外植体数l ≅ tss h ~不定芽分化率 €
k不定芽数Π愈伤组织总块数l ≅ tss h ∀
将获得的不定芽在 ≥ n …„ s1x °ª#pt n Œ„„ s1sx °ª#pt上进一步伸长培养 o将高为 u ¦°以上的不定
芽切下接种在生根培养基 tΠu≥ nŒ…„ t1s °ª#pt上进行生根培养 o培养条件为光照 ty «o温度 ux ε ∀当植
株长至 x ∗ ts ¦°时可进行移栽 ∀
t1u1u 抗生素临界浓度筛选 由于所构建的植物表达载体携带有新霉素磷酸转移酶k‘³× µl基因 o它编码
的产物对某些氨基酸糖苷类抗生素 o例如卡那霉素k®¤±¤°¼¦¬±oŽ°l和遗传霉素kª¨ ±¨ ·¬¦¬±oŠwt{l等具有抗性 ∀
因此 o本试验以 Ž°和 Šwt{为筛选试剂选择转化细胞 ∀为了确定国槐对这 u种抗生素的本底抗性 o将叶片
接种于分别附加卡那霉素 s !vs !xs !zs !tss !txs °ª#pt和遗传霉素 s !w !{ !ts !tu !ty °ª#pt的改良 ≥培养基
上培养 o每一种浓度重复 x次 o每皿 ty个外植体 o培养温度为kuv ? ul ε ∀vs §后统计出愈和分化情况 ∀
t1u1v 农杆菌培养 将根癌农杆菌菌种 ³…¬±8≥≤Ž划线培养于含 xs °ª#pt利福霉素k•¬©l和 xs °ª#pt卡那
霉素kŽ°l的 ≠∞…平板上 o置于 u{ ε 恒温培养箱培养 u §∀从平板上挑取单菌落 o加入含 •¬©xs °ª#pt !Ž°
xs °ª#pt的 ≠∞…液体培养基中 ou{ ε t{s ∗ uss µ#°¬±pt振荡培养过夜 ∀次日早晨取以 u h的接种量转接于
us °新鲜的 ≠∞…液体培养基中 o加入 xs °ª#ptus ˏ乙酰丁香酮kv ox2§¬°¨ ·«²¬¼2w2«¼§µ² ¬¼¤¦¨·² ³«¨ ±²±¨ o
„≥l o继续振荡培养 v ∗ x «o当菌液 ’⁄yss为 s1x左右时即可用于转化 ∀
t1u1w 抗虫基因转化 取生长健壮的无菌苗叶片 o放在预培养培养基上预培养 u ∗ v §o然后在菌液中浸染
ts ∗ tx °¬±o取出叶片 o用无菌滤纸吸干后 o转入覆有一层无菌滤纸的共培养培养基k≥ n …„ v1s ∗ x1s °ª#
pt nŒ„„ s1sx ∗ s1t °ª#pt n „≥ tss Λ°²¯#ptl中 o于 ux ε 遮光培养 u ∗ v §后 o将叶片转入筛选培养基k≥
n …„ v1s ∗ x1s °ª#pt nŒ„„ s1sx ∗ s1t °ª#pt n Šwt{ { °ª#pt n ≤ ©¨xss °ª#ptl中 oux ε 的条件下光培
养 ∀经过伸长培养和生根培养 o获得完整的转化植株 ∀
t1u1x °≤• 检测 以转化的国槐再生植株叶片为材料 o用改良 ≤ׄ…法提取基因组总 ⁄‘„k°²µ¨¥¶®¬ετ αλqo
t||zl ∀参照 σχκ基因全长设计引物 }
xχ端为 xχ „„„„׊„„Š„Š≤„≤≤„×≤××≤ vχ
vχ端为 xχ ×≤ׄŠ„Š××≤„×≤×××≤×≤„×≤„×≤ vχ
在 ux ˏ总反应体系中加入基因组总 ⁄‘„各 s1t Λª为模板 o引物浓度均为 s1w ³°²¯ o§‘×°各 uss Λ°²¯ o
פ´ 聚合酶 t˜ ∀反应程序为 }|x ε 预变性 x °¬±o后 |w ε 变性 t °¬±oxx ε 退火 t °¬±ozu ε 延伸 t °¬±ovy个
循环后在 zu ε 继续延伸 ts °¬±∀反应完后取样 ts ˏ在 t1s h的琼脂糖凝胶上进行电泳检查 ∀
xv 第 |期 张晓英等 }国槐离体再生及抗虫基因 σχκ的转导
u 结果与分析
211 外植体愈伤组织的诱导和分化
将叶片接种在 t ) y号分化培养基上 o黑暗条件下培养 z ∗ ts §后即皱折 !肥大 !发黄 ovs §后开始出
现不定芽 ∀芽多从叶柄和叶缘上长出 ∀y组试验结果见表 t ∀
表 1 不同激素配比对叶片分化的影响
Ταβ . 1 Εφφεχτσ οφ διφφερεντ ΙΑΑ ,ΒΑ ,2 ,4−∆ λεϖελ ον διφφερεντιατιον οφλεαφ
培养基 接种数 愈伤组织块数 愈伤诱导率 分化率
 §¨¬∏° ‘∏°¥¨µ²© ¬¨³¯¤±·‘∏°¥¨µ²©¦¤¯ ∏¯¶ ƒµ¨ ∏´¨ ±¦¼ ²©¦¤¯ ∏¯¶¬±§∏¦¬±ªΠh
ƒµ¨ ∏´¨ ±¦¼ ²©¶«²²·
§¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²±Πh
t ys w{ {s vs
u ys ys tss {u
v ys xt {x wz
w ys wu zs uy
x ys ys tss xt
y ys ys tss y|
yp…„浓度较大时 o有利于
国槐叶片愈伤的诱导和不定芽
分化 ∀在分别附加Œ„„和 u owp
⁄的培养基上生长情况不同 }
在含 Œ„„ 的培养基上 o叶片先
是完全愈伤化 ous §后 o愈伤组
织上出现绿色密集芽点 o更换
新鲜培养基后分化加快 ovs §
后 o形成大量无根苗 ~在含
u owp⁄的培养基上 ot周后叶片肿胀卷曲 o叶柄处产生少量绿色愈伤组织 o培养 ux §时叶柄处萌发出 v ∗ x个
不定芽 o转移到继代培养基中进行光培养以使不定芽伸长成苗 ∀
在 u培养基上 o不定芽分化频率最高达到 {u h ~而 yp…„ 与 u owp⁄的组合中最高的分化率仅为 y| h o而
且诱导周期较长 ∀因此 o选择 u培养基k≥ n yp…„ v °ª#pt n Œ„„ s1sx °ª#ptl诱导国槐叶片不定芽发
生 ∀这同王 之等kt||zl的研究结果不一致 o可能是树种不同的基因型所导致 ∀
212 抗虫基因转化
u1u1t 抗生素临界浓度 由于所构建的植物表达载体携带有新霉素磷酸转移酶k‘³× µl基因 νπτµ o该基因
产物对一系列含有氨基糖苷键的抗生素有解毒作用k…¨ √¤± ετ αλ qot|{vl o如新霉素k±¨ ²°¼¦¬±l !卡那霉素 !遗
传霉素 o筛选中常用卡那霉素和遗传霉素 ∀如果目的基因已导入国槐 o再生植株能在含相应抗生素的培养基
上生长 o因此在做以农杆菌介导为途径的遗传转化之前必须对它们的使用浓度进行探讨 o以筛选转化植株 ∀
结果见图 u ∀
图 u 不同浓度的卡那霉素和 Šwt{对叶片培养的影响
ƒ¬ªqu ∞©©¨¦·²©Ž° ¤±§Šwt{ ²±¬±§∏¦·¬²± ²©¯¨ ¤©
图 u表明 o卡那霉素浓度低于 txs
°ª#pt时并没有完全抑制叶片的愈伤
化 o考虑到较高浓度的卡那霉素可能
会引诱植株产生突变 o本试验没有采
用更高的浓度作进一步试验 ∀而遗传
霉素的添加明显抑制了愈伤组织的形
成 o在不含遗传霉素的培养基上 o茎段
u周后就开始形成愈伤组织 ov周时出
愈率已达 {y h ∀随着遗传霉素的添加
和浓度的提高 o外植体形成愈伤组织
的时间推迟 o出愈率降低 ∀当添加浓
度超过 { °ª#pt时 o外植体开始有死亡现象 o且随着培养时间的延长 o死亡率急剧上升 ∀由此说明国槐叶片
对卡那霉素不敏感 o而可以将侵染的叶片置于含有 { °ª#pt遗传霉素培养基中进行筛选培养 o可初步证明外
源基因是否已导入国槐中 ∀
u1u1u 转化植株的获得 未侵染的对照外植体k图版 ´ p tl接种在不含抗生素的培养基上 o暗培养 tx ∗ us
§后就有淡黄绿色愈伤组织产生 o并且继续培养一段时间后愈伤组织就分化出不定芽 ∀而经过农杆菌侵染
的外植体暗培养 tx ∗ us §后只有少部分产生愈伤组织 o继续培养大多数外植体逐渐死亡 o极少量愈伤组织
分化出小芽k图版 ´ p ul ∀未经农杆菌侵染的外植体在筛选培养基上培养一段时间后变黄死亡k图版 ´ p
vl ∀待获得的抗性芽k图版 ´ p wl长至 u ∗ v ¦°时k图版 ´ p xl o切下转移至含遗传霉素 ts °ª#pt的生根培
养基中 o约 us §后抗性小苗生出根k图版 ´ p yl o发育成完整的再生植株 ∀
yv 林 业 科 学 wu卷
u1u1v 转化植株抗性鉴定 对所获得的转化株系分别从叶片分化不定芽能力 !试管苗继代生长能力和试
管苗生根能力 v个方面检测转化植株的 Šwt{抗性 }tl 未转化植株叶片在含 { °ª#pt Šwt{的选择再生培养
基上变黄 o不形成愈伤组织k图版 ´ p vl ~而转化植株叶片在含 { °ª#pt Šwt{的选择培养基上可形成愈伤组
织 o并分化出不定芽k图版 ´ p ul ∀ul将转化芽和非转化芽同时接种在含 { °ª#pt Šwt{的继代培养基上 o未
转化芽生长一段时间变黄 o然后变白死亡 ~而转化芽均能连续增殖 ∀vl未转化植株幼苗在无 Šwt{的生根培
养基上正常生根 o生根率达 tss h k图版 ´ p yl o未转化植株幼苗在附加 { °ª#pt Šwt{生根培养基上完全不
能生根 ∀由于 Šwt{能有效地抑制植株离体生根能力 o所以通常以植株在含 Šwt{的培养基中能否正常生根
作为鉴定植物携带外源 νπτµ基因的一个重要标志 ∀
213 转化植株检测
从抗性植株提取基因组 ⁄‘„ o以质粒 ³…¬±8≥≤Ž作为阳性对照 o以未转基因植株作为阴性对照 o进行 °≤•
扩增 ∀电泳检测结果如图 v所示 ∀未转化植株基因组未出现 °≤• 扩增片段 o转基因的植株经 °≤• 扩增 o得
到 t条和预期长度一样大小的 wtx ¥³的片段 ∀
图 v 转基因植株 °≤• 分析
ƒ¬ªqv °≤• ¤±¤¯¼¶¬¶²©·µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·¶
t1 未转化植株 ‘²±2·µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·~u1 质粒 °¯ ¤¶°¬§⁄‘„ ~
v ∗ |1 转化植株 ×µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·¶q
为了进一步证明外源基因在植物细胞中
的整合情况 o分别从 °≤• 检测为阳性的转基
因植株中随机选择z株 o用 Ηιν§¶酶切植物总
⁄‘„ oσχκ 基因片段作探针 o进行 ≥²∏·«¨µ±
¥¯²·¬±ª杂交分析 o结果表明 ox株转基因植株
均获得了明显的杂交信号 o而非转化对照基
因组中未出现任何杂交信号k图 wl o进而证
实了 σχκ基因已整合进国槐的基因组中 ∀
v 小结
在前人的工作基础和前期大量试验的
图 w 国槐转 σχκ基因植株的 ≥²∏·«¨µ± ¥¯²·¬±ª分析
ƒ¬ªqw ≥²∏·«¨µ± ¤¶¶¤¼ ²© σχκ ª¨ ±¨ ¬±·µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·¶
° q质粒 ³…¬±8≥≤ŽΠΗιν§¶作为阳性对照 ³…¬±8≥≤Žº¤¶§¬ª¨¶·¨§¥¼ Ηιν§¶ ¤¶³²¶¬·¬√¨ ¦²±·µ²¯ ~t1 非
转基因植株基因组 ⁄‘„用 Ηιν§¶酶切 ‘²±2·µ¤±¶ª¨ ±¬¦¦²±·µ²¯ ³¯¤±·oª¨ ±²°¬¦⁄‘„ º¤¶§¬ª¨¶·¨§ º¬·«
Ηιν§¶ ~u ∗ {1 转基因植株基因组 ⁄‘„用 Ηιν§¶酶切 ×µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·¶oª¨ ±²°¬¦⁄‘„ º¤¶§¬ª¨¶·¨§
º¬·« Ηιν§¶ q
基础上 o建立了国槐高效稳定的
再生和基因转化体系 }tl再生体
系 }幼嫩叶片 ψ在 ≥ n …„ v1s
°ª#pt n Œ„„ s1sx °ª#pt遮光
培养 y周 ψ获得大量不定芽 ψ
切取不定芽在 tΠu≥ n Œ…„ t1s
°ª#pt生根培养 ψ完整植株 ~ul
转化体系 }幼嫩叶片 ψ农杆菌侵
染 ψ ≥ n …„ v1s °ª#pt n Œ„„
s1sx °ª#pt n „≥ tss Λ°²¯#pt
共培养 v §ψ ≥ n …„ v1s °ª#
pt n Œ„„ s1sx °ª#pt n Šwt{ {
°ª#pt n ≤ ©¨xss °ª#pt筛选培养 ψ获得不定芽 ψ在 tΠu≥ nŒ…„ t1s °ª#pt n Šwt{ ts °ª#pt n ≤ ©¨tss °ª#
pt生根培养 ψ分子生物学检测 ∀
‘³× µ是目前较广泛使用的选择标记 o它赋予植物卡那霉素抗性 ∀但是具此抗性的抗生素种类较多 o不
同种类抗生素对不同植物的选择效果也有差异 ∀本试验在含有 Šwt{和 Ž°的培养基上分别进行了抗生素
临界浓度试验 o结果发现 o国槐对 Šwt{较 Ž°敏感 o从试验成本考虑 o选择 Šwt{来筛选转化植株 ∀但是用较
大浓度的 Ž°来筛选的结果是否如前所述会引起植株突变 o或影响植株再生等问题 o有待于进一步研究 ∀
国槐的遗传转化体系中 o有诸多影响因素 o如国槐再生苗的玻璃化问题 o不同属性的农杆菌对转化效率
的影响 o以及对农杆菌采取的必要的诱导处理 o包括培养条件 o接菌的浓度 !时间和 „≥的利用kŠ¨ ²µª¨ ετ αλqo
t|{yl等 o这些因素在提高国槐转化频率及转化植株再生方面的研究 o将在另文报道 ∀
zv 第 |期 张晓英等 }国槐离体再生及抗虫基因 σχκ的转导
参 考 文 献
陈 嵘 qt|xz1 中国树木分类学 q北京 }科学出版社
陈维伦 o郭东红 qt|{u1 国槐子叶和下胚轴外植体上芽的形成 q植物杂志 oktl }t|
弗林特  o范德博希 • qt|{x q害虫综合治理导论 q曹 骥 o赵修复 o译 q北京 }科学出版社
郝贵霞 o朱 祯 o朱之悌 qusst1 转 ΧπΤΙ基因毛白杨的获得 q林业科学 ovzktl }ttz p tt|
刘春明 o朱 祯 o周兆斓 o等 qt||v1 豇豆胰蛋白酶抑制剂 ¦⁄‘„在大肠杆菌中的克隆和表达 q生物工程学报 ok|l }txu p txz
王 之 o李克勤 o刘全宏 o等 qt||v¤q槐树子叶组织培养中的形态发生研究 q实验生物学报 ouykvl }v| p w|
王 之 o李克勤 o刘全宏 o等 qt||v¥q槐树花药培养并获得单倍体植株 q科学通报 ov{ktl }uyy p uy|
王 之 o胡正海 qt||z1 国槐组织细胞培养的研究 q西北植物学报 otzkxl }t p y
…¨ √¤±  ∂ oƒ¯ ¤√¨ ¯¯ • … o≤«¬¯·²±  ⁄qt|{v1 „ ¦«¬°¤¨µ¬¦¤±·¬¥¬²·¬¦µ¨¶¬¶·¤±¦¨ ª¨ ±¨ ¤¶¤¶¨¯¨ ¦·¤¥¯¨ °¤µ®¨µ©²µ³¯¤±·¦¨¯¯ ·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±q‘¤·∏µ¨ ou|w }t{w p t{z
Š¨ ²µª¨ • …o∞∏ª¨ ±¨ • o‘¨¶·¨µ∞ • qt|{y1 °¯ ¤±·³«¨ ±²¯¬¦¦²°³²∏±§¶¬±§∏¦¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²©·«¨ Αγροβαχτεριυµ τυµεφαχιενσ ²¯¦¬±¨ §¨¨§©²µ√¬µ∏¯ ±¨¦¨ q≥¦¬¨±¦¨ ouvu }
|{v p |{x
∏µ¤¶«¬ª¨ × o≥®²²ªƒ qt|yu1 „ µ¨√¬¶¨§ ° §¨¬∏° ©²µµ¤³¬§ªµ²º·«¤±§¥¬²¤¶¶¤¼¶º¬·«·²¥¤¦¦²·¬¶¶∏¨ ¦∏¯·∏µ¨ q°«¼¶¬²¯ °¯ ¤±·otx }wzv p w|z
°²µ¨¥¶®¬≥ o…¤¬¯¨ ¼ Š o…¤∏° … • qt||z1 ²§¬©¬¦¤·¬²± ²© ≤ׄ… ⁄‘„ ¬¨·µ¤¦·¬²± ³µ²·²¦¯ ©²µ³¯¤±·¶¦²±·¤¬±¬±ª«¬ª«³²¯¼¶¤¦¦«¤µ¬§¨ ¤±§³²¯¼³«¨ ±²¯ ¦²°³²±¨ ±·¶q
°¯¤±·²¯ …¬²¯ • ³¨otx }{ p tx
k责任编辑 徐 红l
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5北京林业大学学报6是教育部主管 !国内外公开发行的全国性林学与森林生物学学术期刊 ∀本刊拥有
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