全 文 ：第 vz卷 第 w期
u s s t年 z 月
林 业 科 学
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∏¯ qou s s t
杉木优树分子遗传变异的研究 3
李 梅 施季森 何祯祥 易能君
k南京林业大学林木遗传和基因工程实验室 南京 utssvzl
关键词 } 杉木 o优树 o遗传变异 o • „°⁄
收稿日期 }t|||2sz2sx ∀
3 基金项目 }本研究得到国家自然科学基金的资助k资助号 v|wzsx|tl ∀
tl施季森 q大陆林木遗传改良及分子遗传研究发展 ∀海峡两岸林业科技交流学术讨论会论文集 o台北 ot||z q
ΣΤΥ∆Ψ ΟΝ ΜΟΛΕΧΥΛΑΡ ΓΕΝΕΤΙΧ ς ΑΡΙΑΤΙΟΝ ΟΦ ΣΥΠΕΡΙΟΡ
ΤΡΕΕΣ ΙΝ ΧΗΙΝΕΣΕ ΦΙΡk ΧΥΝΝΙΝΓΗΑΜΙΑ ΛΑΝΧΕΟΛΑΤΑkΛΑΜΒ qlΗΟΟΚ q
¬ ¬¨ ≥«¬¬¶¨± ‹¨«¨ ±¬¬¤±ª ≠¬‘¨±ª­∏±
kΛαβορατορψοφ Φορεστ Τρεε Γενετιχσ ανδ Γενε Ενγινεερινγ oΝανϕινγ Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ Νανϕινγ utssvzl
Αβστραχτ } ׫¬µ·¼¶∏³¨µ¬²µ·µ¨ ¶¨²©≤«¬±¨ ¶¨ ©¬µ©µ²° ¬¨ª«·³µ²√¬±¦¨¶º¨ µ¨ ¤±¤¯¼½¨ §²± ª¨ ±¨·¬¦√¤µ¬¤·¬²± º¬·«• „°⁄ °¨ ·«²§q
„·²·¤¯ ²©u{w ¥¤±§¶o¬±¦¯∏§¬±ªt|s ³²¯¼°²µ³«¬¦²±¨ ¶oº¨ µ¨ ³µ²§∏¦¨§º¬·«uy ³µ¬°¨ µ¶o¤±§ °¨ ¤± ª¨ ±¨·¬¦§¬¶·¤±¦¨ ¥¨·º¨ ±¨
·«¨ ·«¬µ·¼¶∏³¨µ¬²µ·µ¨ ¶¨º¤¶s qw|s| o¬±§¬¦¤·¬±ª¤«¬ª«¯¨ √¨ ¯²©ª¨ ±¨·¬¦§¬√¨ µ¶¬·¼ ¤°²±ª·«¨ ·µ¨¶¶·¨¶·¨§q׺²¶∏³¨µ¬²µ·µ¨ ¶¨o
¦²§¨§¤¶ st ¤±§÷≥uy o¶«²º¨ §¤«¬ª«√¤¯∏¨ ¬± ª¨ ±¨·¬¦¶¬°¬¯¤µ¬·¼oº«¬¦« °¨ ¤±··«¤·²±¯¼²±¨ ²©·«¨ °¦²∏¯§¥¨ ¶¨¶¨±·¬¤¯2
¼¯ ³µ¨¶¨µ√¨ §¬± ª¨ ±¨ ¥¤±®q׫¨ ¦¯∏¶·¨µ¬±ª¤±¤¯¼¶¬¶¬±§¬¦¤·¨§·«¤·°²¶·²©·«¨ ¶∏³¨µ¬²µ·µ¨ ¶¨¦²∏¯§¥¨ ¦¯∏¶·¨µ¨§¤·¤µ¨ ¤¯·¬√¨ ¼¯
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°¤µ®¨µ2¤¶¶¬¶·¨§ª¨µ°³¯¤¶°¦²¯¯¨ ¦·¬²±o³¤µ¨±·ªµ²∏³¬±ª¬±«¼¥µ¬§¬½¤·¬²±¤±§ª¨ ±¨·¬¦§¬√¨ µ¶¬·¼ √¨¤¯∏¤·¬²±²±¥µ¨ §¨¬±ª°¤·¨µ¬¤¯¶
¬±¬°³µ²√¨ °¨ ±·²©≤«¬±¨ ¶¨ ©¬µq
Κεψ ωορδσ} ≤«¬±¨ ¶¨ ©¬µo≥∏³¨µ¬²µ·µ¨ ¶¨o Š¨ ±¨ ·¬¦√¤µ¬¤·¬²±o• „°⁄
种质资源的收集和管理是一项复杂而艰巨的工作k∂¬µ® ετ αλqot||xl o其遗传变异研究对林木遗传
改良具有重要意义k¬∏ ετ αλqot||vl ∀遗传变异研究既可以用谱系或杂种的表型资料 o也可以用同工酶
数据 o还可用 ⁄‘„水平的分子标记数据k≥°¬·« ετ αλqot||ul ∀近年来 o分子标记已广泛而有效地用于估
测育种材料的遗传变异k¨¨ot||xl o其中 • „°⁄k•¤±§²° ¤°³¯¬©¬¨§ ³²¯¼°²µ³«¬¦⁄‘„ o随机扩增多态性
⁄‘„l是较好的一种分子标记技术k • ¨¯¶« ετ αλqot||s ~׬±®¨µετ αλqot||vl ∀
杉木k Χυννινγηαµιαλανχελοαταk¤°¥ql‹²²®l是我国重要的商品用材树种 o杉木良种选育已经取得了
显著成效并在林业生产中发挥了巨大作用tl ∀虽然 o杉木种质资源的遗传变异水平对其丰度评价 !保护
策略制定和长期遗传增益的保障有重要价值k施季森等 ot||vl o但目前却较少研究 ∀本研究利用 • „°⁄
分子标记技术对收集自 {个省份的 vs株杉木优树进行了遗传变异分析 o这可为标记辅助的优树鉴定 !
杂交亲本选配和育种群体多样性评价等研究奠定良好的基础 ∀
1 材料和方法
t1t 植物材料 vs株杉木优树收集自 {个省区的家系实验林k表 tl o选优标准为树高和胸径 o采用 x
株优势木法 o于 t|zu年嫁接保存于福建省国营洋口林场杉木基因库中 ∀
t1u 随机引物 用于 • „°⁄扩增的 ts ¥³随机引物购自 ’³¨µ²±公司 o初筛 ’°„ !’°… !’°≤ !’°⁄!’°∞和
’°ƒ字头共 tus个引物 o筛出正式扩增引物 uy个 o各引物名称及序列见表 u ∀
t1v 样品采集 !⁄‘„提取和 • „°⁄反应 每株优树取约 ts¦°长的嫩梢 o标号并捆扎成束 o带回实验室 ∀
嫩梢切口处浸水以保湿保鲜 ∀ ⁄‘„提取参考 ⁄²¼¯¨和 ⁄²¼¯¨的 ≤ׄ…法k⁄²¼¯¨ ετ αλqot||sl ∀
表 1 优树材料及其原产地
Ταβ .1 Συπεριορ τρεεσ οφ Χηινεσεφιρ εµπλοψεδ ιν τηισστυδψ ανδ τηειρ οριγινσ
原产地k株数l
’µ¬ª¬± k‘∏°¥¨µ²©·µ¨ ¶¨l
优树名称k编号l
≥∏³¨µ¬²µ·µ¨¨±¤°¨
k¦²§¨ l
原产地k株数l
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优树名称k编号l
≥∏³¨µ¬²µ·µ¨¨±¤°¨
k¦²§¨ l
广西融安kvl
•²±ª. ¤± Š∏¤±ª¬¬
广西 tt{skŠ÷tt{sl
广西 tty|kŠ÷tty|l
广西 ttxvkŠ÷ttxvl
湖南靖县kvl
¬±ª¬¬¤± ‹∏±¤±
湖南靖 utk‹‘utl
湖南靖 u|k‹‘u|l
湖南靖 wwk‹‘wwl
广东连平ktl
¬¤±³¬±ª Š∏¤±ª§²±ª 广东连 sxkŠ⁄sxl
安徽西田kul
÷¬·¬¤± „±«∏¬
安徽西 sxk„‹÷sxl
安徽西 stk„‹÷stl
广东信宜kul
÷¬±¼¬Š∏¤±ª§²±ª
广东信 szkŠ⁄÷szl
广东信 s{kŠ⁄÷s{l
安徽黄山ktl
‹∏¤±ª¶«¤± „±«∏¬ 安徽黄 stk„‹‹stl
浙江临安kvl
¬±. ¤± «¨­¬¤±ª
浙江浙 xt|kxt|l
浙江浙 tvtktvtl
浙江浙 stkstl
江西上饶kul
≥«¤±ªµ¤²¬¤±ª¬¬
江西上 uyk÷≥uyl
江西上 uvk÷≥uvl
福建洋口kyl
≠¤±ª®²∏ƒ∏­¬¤±
福建洋 vvkƒ≠vvl
福建洋 vzkƒ≠vzl
福建洋 wvtkƒ≠wvtl
福建洋 ywutkƒ≠ywutl
福建洋 tykƒ≠tyl
福建洋 v|kƒ≠v|l
江西赣州kul
Š¤±½«²∏­¬¤±ª¬¬
江西全南kul
±∏¤±±¤± ¬¤±ª¬¬
江西干 tw k÷Štwl
江西干 wu k÷Šwul
江西全 {u k÷±{ul
江西全 tu k÷±tul
四川永川kvl
≠²±ª¦«∏¤± ≥¬¦«∏¤±
四川永 ttk≥≤≠ttl
四川永 tuk≥≤≠tul
四川永 tvk≥≤≠tvl
表 2 引物名称及序列
Ταβ .2 Τηελιστ οφ 10βπ πριµερσ ανδ τηειρ σεθυενχεσ
引物
名称
‘¤°¨²©
°µ¬°¨ µ¶
引物序列
kxχ ψvχl
≥¨´ ∏¨±¦¨ ²©
³µ¬°¨ µ¶
总谱带数
‘∏°¥¨µ²©
©µ¤ª° ±¨·¶
¤°³¯¬©¬¨§
多态性谱带数
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引物
名称
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引物序列
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总谱带数
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多态性谱带数
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³²¯¼°²µ³«¬¦
©µ¤ª°¨ ±·¶
’°„2st ≤„ŠŠ≤≤≤××≤ ts x ’°≤2sw ≤≤Š≤„×≤ׄ≤ | x
’°„2sw „„×≤ŠŠŠ≤׊ tt z ’°≤2sy Š„„≤ŠŠ„≤ׄ tt |
’°„2sz Š„„„≤ŠŠŠ×Š y y ’°≤2tu ׊×≤„×≤≤≤≤ | x
’°„2s| ŠŠŠ×„„≤Š≤≤ tw y ’°≤2tv „„Š≤≤×≤Š×≤ | |
’°„2ts Š×Š„×≤Š≤„Š ts | ’°≤2tx Š„≤ŠŠ„×≤„Š tt w
’°„2tt ≤„„×≤Š≤≤Š× tw tu ’°≤2t{ ׊„Š×ŠŠŠ×Š tx {
’°„2tw ×≤׊׊≤׊Š | { ’°≤2us „≤××≤Š≤≤„≤ ts x
’°„2ty „Š≤≤„Š≤Š„„ tu { ’°⁄2sz ×׊Š≤„≤ŠŠŠ ts y
’°„2t{ „ŠŠ×Š„≤≤×× ts | ’°⁄2us „≤≤≤ŠŠ×≤„≤ | w
’°…2sx ׊≤Š≤≤≤××≤ z x ’°∞2st ≤≤≤„„ŠŠ×≤≤ ts x
’°…2sz ŠŠ×Š„≤Š≤„Š tu z ’°∞2ty ŠŠ×Š„≤׊׊ tv tu
’°…2s{ Š×≤≤„≤„≤ŠŠ tv | ’°∞2t{ ŠŠ„≤׊≤„Š„ tw |
’°≤2st ××≤Š„Š≤≤„Š tt y ’°ƒ2tu „≤ŠŠ×„≤≤„Š tx tu
总谱带数
ײ·¤¯ ©µ¤ª°¨ ±·¶¤°³¬©¬¨§ u{w
多态性谱带数
ײ·¤¯ ³²¯¼°²µ³«¬¦©µ¤ª° ±¨·¶¤°³¯¬©¬¨§ t|s
°≤• 反应在 °¨ µ®¬±2∞¯ °¨ µuwss上进行 o采用 tx ˏ反应体系 }其中 ts倍反应缓冲液 t1x ˏktss °°²¯2
³‹{ qv ×µ¬¶2‹≤¯ oxss °°²¯Ž≤¯ ous °°²¯ ª≤¯ u os qst h 明胶l oפ´ 聚合酶 s1{ 单位 o§„×° !§××° !§≤×°和
{vt 林 业 科 学 vz卷
§Š×°各 tss Λ°²¯ o引物 s1v Λ°²¯ o⁄‘„ 模板 ut±ª左右 ∀扩增程序为 }|w ε 预变性 t °¬±~再 wx个循环 }
|w ε 变性 vs¶ow{ ε 退火 vs¶和 zu ε 延伸 u °¬±~最后再于 zu ε 延伸 z °¬±∀扩增产物用含有溴化乙锭的
t1s h琼脂糖凝胶在 s1x ≅ ׅ∞缓冲液中电泳分离 o最后在紫外灯下用 °²¯¤µ²¬§ ³wn摄像系统照像记录
结果 ∀
t1w 数据统计分析 °„°⁄扩增谱带用 t代表出现 o用 s代表未出现 o进行统计 ∀利用统计的谱带数
据 o参考 ‘¨¬的方法k‘¨¬ετ αλqot|z|l计算优树间的遗传距离kŠ¨ ±¨ ·¬¦§¬¶·¤±¦¨ oŠ⁄l ∀对于 • „°⁄数据 o各
优树间遗传距离的计算公式为k∞¬¦²©©¬¨µετ αλqot||u ~‹∏©© ετ αλqot||vl }
Γ∆ιϕ € ¾Γ∆uιϕÀ € µ t p u µιϕu µ
其中 oµιϕ为优树 ι和ϕ共有的谱带数 oµ 为多态性谱带数 ∀相似性指数k׫¨ ¶¬°¬¯¤µ¬·¼¬±§¨¬o≥Œl则为kt p
Γ∆ιϕl ∀
再利用遗传距离数据 o用 ˜°Š„k˜±º¨ ¬ª«·¨§³¤¬µªµ²∏³ °¨ ·«²§²©¤µ¬·«°¨ ·¬¦¤√¨ µ¤ª¨ l算法k≥²®¤·ετ αλqo
t|x{l进行聚类分析 ∀
2 结果与讨论
u1t 优树间的多态性水平 tus个备选引物中 o共筛选出 uy个重复性好 !扩增多态性强 !扩增谱带清晰
的引物被用于正式扩增k表 ul ∀ • „°⁄扩增结果表明 ouy个引物共产生 u{w条可统计谱带 o谱带长度介
于 vss ) vsss ¥³之间 o表明反应体系和反应程序能对杉木进行有效的 • „°⁄扩增 ∀每引物扩增出的谱
带数最少为 y条k’°„2szl o最多为 tx条k’°ƒ2tul o平均 ts1|条Π引物 ∀u{w条谱带中 o优树间多态性谱带
t|s条 o多态性谱带比例达 yy1|s h o优树间的多态性水平较高 ∀
由于 • „°⁄方法中 o每个引物都是对整个基因组进行随机扩增k邹喻萍 ot||x ~卢 江 ot||vl o因此
所用的 uy个引物所探测的 ⁄‘„位点是覆盖整个基因组的 o能对 vs株杉木优树进行有效的鉴定 o各优
树有其特异的 • „°⁄总谱带特征 o即指纹图谱 ∀这表明分子标记对种质资源鉴定的有效性 o也从另一个
角度表明研究材料的较高水平的遗传变异 ∀图 t显示了引物 ’°ƒ2tu对 vs个优树的 • „°⁄扩增产物经
琼脂糖凝胶电泳后的结果 ∀
图 t 引物 ’°ƒ2tu对 vs个杉木优树的 • „°⁄扩增谱带
ƒ¬ªqt • „°⁄ ¥¤±§¶²©vs ¶∏³¨µ¬²µ·µ¨ ¶¨¤°³¯¬©¬¨§º¬·«³µ¬° µ¨’°ƒ2tu
左数第 ty泳道为标定 ⁄‘„片段长度的 ¤µ®¨µo从上到下的谱带长度依次为 usss otxss otsss ozss oxss owss和 vss ¥³q׫¨ ¶¬¬·¨ ±¨·« ¤¯±¨
©µ²°·«¨ ¯¨©·º¤¶·«¨ °¤µ®¨ µ¯ ¤¥¨ ¬¯±ª·«¨ ¯¨ ±ª·«¶²©·«¨ ©µ¤ª°¨ ±·¶o¬·µ¤±®¶©µ²° ∏³·²·«¨ ²¯º usss otxss otsss ozss oxss owss ¤±§vss ¥³q
利用 • „°⁄分析二倍体远交物种的遗传变异时 o有几个因素影响结果的可靠性 ∀t是 • „°⁄为显性
标记 o不能检测杂合位点 o可能高估遗传变异的水平k¬∏ ετ αλqot||vl ~u是琼脂糖凝胶分辨度低 o统计的
t条 • „°⁄谱带实际上可能是两条或几条长度相近的谱带共分离k≤²°¬ªµ¤·¬±ªlk…µ∏°°¨ µετ αλqot||xl所
致 ~v是所用的 • „°⁄谱带数量k°¨ ­¬¦ ετ αλqot||{l ∀本研究可能高估了收集的优树群体的遗传变异水
平 o这有待用共显性的分子标记技术进一步探讨 ∀对于有效的 • „°⁄谱带数量 o°¨ ­¬¦等kt||{l对几种分
子标记技术进行的模拟研究表明 o要使标准差小于 x h o• „°⁄谱带数量至少不少于 tss条 ∀本研究所
用的谱带数量远远大于这个数值 o所得到的结果在一定程度上是可靠的 ∀
|vt 第 w期 李 梅等 }杉木优树分子遗传变异的研究
图 u vs个优树间的 ˜°Š„系统聚类图
ƒ¬ªqu ˜°Š„ §¨ ±§µ²ªµ¤° ²©vs ¶∏³¨µ¬²µ≤«¬±¨ ¶¨ ©¬µ¬±§¬√¬§∏¤¯¶¥¤¶¨§²± • „°⁄ §¤·¤
u1u 优树间的遣传相似性 研究发现有两株优树k浙江浙 st与江西上 uyl虽然来自不同的省份 o但却
具有几乎完全相同的 • „°⁄谱带 o彼此间的遗传相似性极高 o高达 |t1z{ h ∀由此可推断这两株优树最
初可能具有相同的起源 ∀另外 o湖南靖 ut与湖南靖 u| !安徽西 st与安徽黄 st以及浙江浙 xt|与浙江
浙 tvt的遗传相似性也较高 ∀对遗传相似性极高的育种材料k如浙江浙 st和江西上 uyl o在大批种质资
源保存和经营中可以只保存其中 t份材料 o这样既可有效保障育种材料的较高的遗传多样性水平 o又可
减少费用k∂¬µ® ετ αλqot||xl ∀ ∂¬µ®等kt||xl认 为 o要在 || h的概率上鉴别两个或多个材料是否具有遗
传相似性 o至少需要 uw个引物 o或者 {y个标记 o或者 uy个多态性标记 ∀本研究中 o这 v个数值分别为
uy !u{w和 t|s o因此对优树遗传相似性的检验是有效的 ∀
swt 林 业 科 学 vz卷
u1v 优树间遗传距离和聚类分析 利用统计的 vs株优树的 • „°⁄位点计算了各对优树间的遗传距离
k因数据太多 o未列出l ∀优树间遗传距离最大为 s1yyutk福建洋 v|与江西上 uyl o最小为 s1s{uuk浙江浙
st与江西上 uyl o平均为 s1w|s| o大多遗传距离在 s1wx以上 ∀总的来说 o优树间的遗传变异比较大 ∀
根据优树间的遗传距离 o利用 ˜°Š„算法建立了聚类图k图 ul ∀从图 u可以看出 o单株优树间聚
类的遗传距离一般较大 o而各小类间的遗传距离较小 o表明优树群体内个体间包含了丰富的遗传变异 ∀
在较大的遗传距离上可以确定不同的值对 vs株优树进行聚类 o以 s1w{为临界值 o可以把 vs株优树分
为 y类 o来自相同省份的优树多聚一类 ∀但在聚类中也存在个别特殊情况 o如第 w类所含的 v株优树来
自不同的省份 o而第 x类只包括 t株优树洋 vv o这可能与有的个体特别大的遗传变异有关k≤¤¶·¬ª¯¬²±¨ ετ
αλqot||zl o从总的聚类结果来看 o这 vs株优树只有在较大的遗传距离上才能够相对聚在一起 o它们之间
的遗传变异程度是相当高的 ∀
u1w 杉木优树遗传变异与杂交亲本选配 本研究中的优树已用于遗传交配设计且子代实验正在进行 ∀
本研究对作为亲本的优树进行了分子遗传变异的探索 o将来结合杂交子代的大田表现 o可以进一步探讨
分子遗传变异与子代表现的相关 ∀这对分子标记辅助的杂交亲本选配具有重要的意义k…¤µ¬¯ ετ αλqo
t||y ~≤«²º§¤µ¬ετ αλqot||{l o有关这方面的工作我们已经开展 o并初步获得了一些有价值的结果 ∀
参 考 文 献
卢 江 q随机放大多态性 ⁄‘„k• „°⁄l一种新的遗传标记技术 q植物学报 ot||v ovxk增刊l }tt| ∗ tuz
施季森 o叶志宏 o≠ «¨ ƒ≤等 q杉木遗传多态性与多基因位点遗传结构 q南京林业大学学报 ot||v otz o| ∗ tx
邹喻萍 q• „°⁄分子标记简介 q生物多样性 ot||x ovkul }tsw ∗ ts{
…¤µ¬¯ ≤° o∂ µ¨«¤¨ ª¨ ± ⁄ ¤±§ ∂¬ª±¨ µ²± ° ετ αλq≥·µ∏¦·∏µ¨ ²©·«¨ ¶³¨¦¬©¬¦¦²°¥¬±¬±ª¤¥¬¯¬·¼ ¥¨·º¨¨ ±·º²¶³¨¦¬¨¶²© ΕυχαλψπτυσqŒ}• „°⁄ §¤·¤q׫¨ ²µ„³³¯
Š¨ ±¦·ot||y o|w oz|y ∗ {sv
…µ∏°°¨ µ∞≤ o…²∏·²± Š ¤±§Ž²¦«¨µ·Šq„±¤¯¼¶¬¶²©¤°±∏¤¯  §¨¬¦¤ª²¶³¨¦¬¨¶∏¶¬±ª • „°⁄ °¤µ®¨µ¶qŠ¨ ±²°¨ ot||x ov{ ovyu ∗ vyz
≤¤¶·¬ª¯¬²±¨ ≥ o• ¤±ª Š ¤±§⁄¤°¬¤±¬Š ετ αλq• „°⁄©¬±ª¨µ³µ¬±·¶©²µ¬§¨±·¬©¬¦¤·¬²± ¤±§·¤¬²±²°¬¦¶·∏§¬¨¶²©¨¯¬·¨ ³²³∏¯¤µk Ποπυλυ󶳳ql¦¯²±¨ q׫¨ ²µ„³³¯
Š¨ ±¨ ·ot||z o|z oxw ∗ x|
≤«²º§¤µ¬Ž∂ o∂ ±¨®¤·¤¦«¤¯¤° ≥• ¤±§⁄¤µ¬¨µº¤¯¤ „° ετ αλq‹¼¥µ¬§³¨µ©²µ°¤±¦¨ ¤±§ª¨ ±¨ ·¬¦§¬¶·¤±¦¨ ¤¶µ¨√¨ ¤¯ §¨¥¼·«¨ kŠ„ׄlw °¬¦µ²¶¤·¨¯ ¬¯·¨ ¤±§• „°⁄
°¤µ®¨µ¶¬± ³¨¤µ¯ °¬¯¯ ·¨q׫¨ ²µ„³³¯ Š¨ ±¨ ·ot||{ o|z otyv ∗ ty|
⁄²¼¯¨¤±§⁄²¼¯¨Œ¶²¯¤·¬²± ²©³¯¤±·⁄‘„ ©µ²°©µ¨¶«·¬¶¶∏¨ qƒ²¦∏¶ot||s otu otv ∗ tw
∞¬¦²©©¬¨µo≥°²∏¶¨ ° ∞ ¤±§ ±∏¤·µ²  q„±¤¯¼¶¬¶²© °²¯ ¦¨∏¯¤µ√¤µ¬¤±¦¨ ¬±©¨µµ¨§©µ²° °¨ ·µ¬¦§¬¶·¤±¦¨ ¤°²±ª⁄‘„ «¤³¯²·¼³¨¶}¤³³¯¬¦¤·¬²±·²«∏°¤± °¬·²2
¦«²±§µ¬¤¯ ⁄‘„ µ¨¶·µ¬¦·¬²± ¶¬·¨¶qŠ¨ ±¨ ·¬¦¶ot||u otvt owz| ∗ w|t
‹∏©© ⁄ • o°¨ ¤®¤¯¯ • ¤±§≥°²∏¶¨ ° ∞q• „°⁄ √¤µ¬¤·¬²± º¬·«¬± ¤±§¤°²±ª±¤·∏µ¤¯ ³²³∏¯¤·¬²±¶²©²∏·¦µ²¶¶¬±ª¥∏©©¤¯²ªµ¤¶¶k Βυχηλοσ δαχτψλοιδεσ k‘∏·ql∞±2
ª¨¯° ql q׫¨ ²µ„³³¯ Š¨ ±¨ ·ot||v o{y o|uz ∗ |vw
¨¨  q⁄‘„ °¤µ®¨µ¶¤±§³¯¤±·¥µ¨ §¨¬±ª³µ²ªµ¤°¶q„§√ „ªµ²±ot||x oxx ouyx ∗ vww
¬∏ ¤±§ƒ∏µ±¬¨µŠ• q≤²°³¤µ¬¶²±²©¤¯ ²¯½¼°¨ o• ƒ° ¤±§• „°⁄ °¤µ®¨µ¶©²µµ¨√¨ ¤¯¬±ªª¨ ±¨ ·¬¦√¤µ¬¤·¬²± º¬·«¬±¤±§¥¨·º¨¨ ±·µ¨°¥¯¬±ª¤¶³¨ ±¤±§¥¬ª·²²·«¤¶2
³¨ ± q׫¨ ²µ„³³¯ Š¨ ±¦·ot||v o{z o|z ∗ tsx
‘¨¬ ¤±§¬ • q¤·«¨ °¤·¬¦¤¯ °²§¨¯©²µ¶·∏§¼¬±ªª¨ ±¨ ·¬¦√¤µ¬¤·¬²±¬± ·¨µ°¶²©µ¨¶·µ¬¦·¬²± ±¨§²±∏¦¯ ¤¨¶¨¶q°µ²¦‘¤·¯ „¦¤§≥¦¬˜≥„ ot|z| ozy oxuy| ∗ xuzv
°¨ ­¬¦Œo„­°²±¨ 2¤µ¶¤± ° ¤±§ ²µª¤±·¨  ετ αλq≤²°³¤µ¤·¬√¨¤±¤¯¼¶¬¶²©ª¨ ±¨ ·¬¦¶¬°¯¤µ¬·¼ ¤°²±ª°¤¬½¨ ¬±¥µ¨§ ¬¯±¨ ¶§¨·¨¦·¨§¥¼ • ƒ°¶o• „°⁄¶≥≥•¶o¤±§
„ƒ°¶q׫¨ ²µ„³³¯ Š¨ ±¨ ·ot||{ o|z otuw{ ∗ tuxx
≥°∏·«≥≤ ¤±§≥°¬·« ’≥ qƒ¬±ª¨µ³µ¬±·¬±ª¦µ²³√¤µ¬¨·¬¨¶q„§√ „ªµ²±ot||u owz o{x ∗ tu|
≥²®¤¯ • • ¤±§ ¬¦«¨ ±¨ µ≤ ⁄q„ ¶·¤·¬¶·¬¦¤¯ °¨ ·«²§©²µ √¨¤¯∏¤·¬±ª¶¼¶·¨°¤·¬¦µ¨ ¤¯·¬²±¶«¬³¶q˜±¬√ ²©Ž¤±¶¤¶≥¦¬…∏¯¯ ·¨¬±ot|x{ ov{ otws| ∗ twv{
׬±®¨µ‘„ oƒ²µ·¬± Š ¤±§¤·«¨µ⁄∞q•¤±§²° ¤°³¯¬©¬¨§³²¯¼°²µ³«¬¦⁄‘„ ¤±§³¨ §¬ªµ¨¨µ¨ ¤¯·¬²±¶«¬³¬±¶³µ¬±ª¥¤µ¯¨ ¼ q׫¨ ²µ„³³¯ Š¨ ±¨ ·ot||v o{x o|zy ∗ |{w
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