全 文 ： 第 vy卷 第 v期u s s s年 x 月
林 业 科 学
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核桃体细胞胚发生与转基因研究进展
汤浩茹 王永清
k四川农业大学林学园艺学院 雅安 yuxstwl
任正隆
k四川农业大学植物遗传育种省级重点实验室 雅安 yuxstwl
摘 要 } 总结了核桃体细胞胚发生的研究进展 o列表统计已报道的核桃 x个种和 v个杂种体细胞胚发生的外
植体与诱导条件 o重点论述了影响核桃体细胞胚发生与次生胚发生的因素 o介绍了核桃体细胞胚萌发与转化的
方法 ∀还总结核桃转基因研究的进展 o提出了用核桃体细胞胚发生系统进行外源基因转移的操作模式 ∀
关键词 } 核桃 o体细胞胚发生 o转基因 o离体培养
收稿日期 }t||{2ts2tx ∀
ΑΝ Ος ΕΡ ςΙΕ Ω ΟΦ ΠΡ ΟΓΡΕΣΣ ΟΝ ΣΟΜΑΤΙΧ Ε ΜΒΡΨΟΓΕΝΕΣΙΣ
ΑΝ∆ ΤΡ ΑΝΣΦΟΡ ΜΑΤΙΟΝ ΙΝ ΩΑΛΝΥΤ
פ±ª ‹¤²µ∏ • ¤±ª ≠²±ª´¬±ª
( Φορεστρψ ανδ Ηορτιχυλτυραλ Χολλεγε οφ Σιχηυαν Αγριχυλτυραλ Υνιϖερσιτψ Ψααν yuxstw)
• ±¨ «¨ ±ª¯²±ª
( Στατε Κεψ Λαβορατορψοφ Πλαντ Γενετιχσ ανδ Βρεεδινγ , Σιχηυαν Αγριχυλτυραλ Υνιϖερσιτψ Ψααν yuxstw)
Αβστραχτ : ≥¬ª±¬©¬¦¤±·³µ²ªµ¨¶¶²± ·«¨ ¶²°¤·¬¦ °¨¥µ¼²ª¨ ±¨ ¶¬¶¤±§·µ¤±¶©²µ°¤·¬²± ¬± º¤¯±∏·(ϑυγλανσ) «¤¶¥¨ ±¨
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Κεψ ωορδσ: • ¤¯±∏·o≥²°¤·¬¦ °¨¥µ¼²ª¨ ±¨ ¶¬¶o×µ¤±¶©²µ°¤·¬²±oŒ± √¬·µ²¦∏¯·∏µ¨
核桃(ϑυγλανσ)是果 !木兼用的优良经济树种 ∀长期以来 o核桃主要采用实生与嫁接繁殖 ∀自然授
粉和实生繁殖难以保持品种的优良特性 ∀由于切口氧化褐变 o嫁接繁殖的成功率极低 ∀为了满足生产
对良种苗木的需要 o核桃的离体繁殖技术得到了深入研究k ¦Šµ¤±¤«¤± ετ αλ. ot|{zl ∀核桃试管苗生
根极难 o限制了核桃离体繁殖技术的应用 ∀核桃的体细胞胚k简称体胚l具有完整的两极结构 o能一次
再生完整植株k×∏¯ ¦¨®¨ ετ αλ. ,t|{xl ∀同时 o能反复产生次生胚而形成体胚无性系 ∀核桃的体胚发生
系统为核桃的离体繁殖提供了新途径并已用于繁殖核桃苗木k×∏¯ ¦¨®¨ ετ αλ. ,t||xl ∀
核桃是天然异花授粉植物 o而且其继代繁殖周期长 ∀用传统的选育种方法对核桃进行品种改良不
仅耗资耗时 o而且收效缓慢 ∀现代无性基因转移方法不仅避免了因有性重组带来的不良后果 o而且能
加快品种改良的进程 !提高改良的效果k’ ¬¯√ ¬¨µ¤ ετ αλ. ,t||yl ∀能否获得转基因植株 o除基因转移的方
法外 o在很大程度上取决于有效离体培养再生系统 ∀原生质体培养与叶圆片培养是目前运用最为广泛
的转基因植株再生系统k’ ¬¯√ ¬¨µ¤ ετ αλ. ,t||yl ∀但是 o核桃的原生质体培养与叶圆片培养还未成功
k¦Šµ¤±¤«¤± ετ αλ. ,t|{zl ∀核桃的体胚发生为核桃的转基因研究提供了良好的离体培养再生系统
k ¦Šµ¤2±¤«¤± ετ αλ. ,t|{{l ∀利用体胚发生系统 o不仅将外源报告基因转入了核桃 o而且有价值基因已
转入核桃并得到了表达k⁄¤±§¨ ®¤µετ αλ. ,t|{| ~⁄¤±§¨ ®¤µετ αλ. ,t||{ ~∞¯ ∏¦« ετ αλ. ,t||y ~∞¯ ∏¦« ετ αλ. ,
t||{ ~¤¼2„¯¯¨°¤±§ ετ αλ. ,t||t ~¦Šµ¤±¤«¤± ετ αλ. ,t||sl ∀
t 核桃的体细胞胚发生
自 ×∏¯ ¦¨®¨ 等kt|{xl首次报道核桃的体胚发生以来 o相继在核桃的 x个种和 v个杂种中有了体胚
发生的报道k表 tl ∀与其它植物一样 o核桃体胚发生是个十分复杂的过程 o其机理还不清楚 ∀核桃的体
胚发生受多种因素的影响 o其中外植体与培养基k包含植物生长调节剂l对体胚发生起决定作用 ∀
111 外植体
植物的每个细胞均有成胚的潜力 o但成胚频率最高的是那些具有较高胚性感受能力k¨°¥µ¼²ª¨ ±¬¦
¦²°³¨ ·¨±¦¨l的细胞 ∀在核桃中 o幼胚及其组成成分具有较高的胚性感受态水平 ∀因而 o核桃的体胚发
生主要是采用幼胚及其组成成分k子叶l作外植体而获得的k表 tl ∀
表 1 核桃体细胞胚发生报道一览表
Ταβ .1 Αλιστ οφ πυβλισηεδ στυδιεστηατ αχηιεϖεδ σοµατιχ εµ βρψογενεσισιν ωαλνυτ (ϑυγλανσσππ .)
种名 ≥³¨¦¬¨¶ 外植体 ∞¬³¯¤±·
诱导培养基
Œ±§∏¦·¬√¨ °¨ §¬∏°≠
继代培养基
≥∏¥¦∏¯·∏µ¨ °¨ §¬∏°≠
参考文献
• ©¨¨µ¨±¦¨
灰核桃 ϑ. χινερεα
函兹核桃 ϑ. ηινδισσ
大核桃 ϑ. µαϕορ
黑核桃 ϑ. νιγρα
黑核桃 ϑ. νιγρα
黑核桃 ϑ. νιγρα
黑核桃 ϑ. νιγρα
核桃 ϑ. ρεγια
核桃 ϑ. ρεγια
核桃 ϑ. ρεγια
核桃 ϑ. ρεγια
核桃 ϑ. ρεγια
核桃 ϑ. ρεγια
核桃 ϑ. ρεγια
核桃 ϑ. ρεγια
核桃 ϑ. ρεγια
杂种核桃 ϑ. νιγρα ≅ ϑ. ρεγια
ϑ. ρεγια ≅ ϑ. νιγρα
Πτεροχαρψᶳq≅ ϑ. ρεγια
子叶 ≤²·¼¯ §¨²±¶
子叶 ≤²·¼¯ §¨²±¶
子叶 ≤²·¼¯ §¨²±¶
子叶 ≤²·¼¯ §¨²±¶
子叶 ≤²·¼¯ §¨²±¶
子叶 ≤²·¼¯ §¨²±¶
子叶 ≤²·¼¯ §¨²±¶
子叶 ≤²·¼¯ §¨²±¶
子叶 ≤²·¼¯ §¨²±¶
子叶 ≤²·¼¯ §¨²±¶
胚乳 ∞±§²¶³¨µ°
幼胚 ∞°¥µ¼²¶
叶柄 °¨ ·¬²¯¶
幼胚 ∞°¥µ¼²¶
幼胚 ∞°¥µ¼²¶
幼胚 ∞°¥µ¼²¶
子叶 ≤²·¼¯ §¨²±¶
子叶 ≤²·¼¯ §¨²±¶
幼胚 ∞°¥µ¼²¶
⁄Ž• nw1w…„ n|1vŽ× ns1sxŒ…„
⁄Ž• nw1w…„ n|1vŽ× ns1sxŒ…„
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• ° ns1sx ∗ x1s×⁄ nt1s ∗ ts1s uowp ⁄
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• ° nx1s×⁄ nt1s uowp ⁄
⁄Ž• nw1w…„ n|1vŽ× ns1sxŒ…„
⁄Ž• nw1w…„ n|1vŽ× ns1sxŒ…„
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≥
⁄Ž• nu1v uowp ⁄n|1vŽ× ns1stŒ…„
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⁄Ž• ns1wx×⁄ nw1y× ntz1sŒ„„
⁄Ž• nw1w…„ n|1vŽ× ns1sxŒ…„
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⁄Ž•
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k×∏¯ ¦¨®¨ ετ αλ. ,t|{xl
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k²±ª ετ αλ. ,t||ul
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k…²¯·¬√¨ ·¶ετ αλ. ,t||sl
k×∏¯ ¦¨®¨ ετ αλ. ,t|{{l
kŽ²µ±²√¤ ετ αλ. ,t||vl
k刘淑兰等 ot||ul
k袁巧平等 ot||sl
k袁巧平等 ot||sl
k„¯ ¼  „ ετ αλ. ,t||ul
k≤²µ±ot|{{l
k≤²µ±ot|{|l
k¦Šµ¤±¤«¤± ετ αλ. ,t|{yl
≠植物激素浓度单位 ː ∀≤²±¦¨±·µ¤·¬²±¶²©³¯¤±·ªµ²º·«µ¨ª∏¯¤·²µ¶º µ¨¨ ¤·Λ q
与大多数植物一样 o核桃的组织或细胞维持高水平的胚性感受态的时间极短 o而且胚性感受态水
平的高低还与基因型有关 ∀授粉后 v ∗ w周时的黑核桃幼胚开始具有体胚发生能力 o而以授粉后 y ∗ z
周时的幼胚体胚发生频率最高 o此时子叶开始具备体胚发生能力k≤²µ±ot|{{l ∀授粉 {周以后 o幼胚的
体胚发生能力下降 o而子叶的体胚发生能力升高 ∀子叶体胚的发生能力可维持至授粉后 tw周 o而以授
vst v期 汤浩茹等 }核桃体细胞胚发生与转基因研究进展
粉后 { ∗ tu周时的子叶体胚发生能力最强k‘¨ ∏°¤± ετ αλ. ,t||vl ∀核桃k×∏¯ ¦¨®¨ ετ αλ. ,t|{xl和灰核
桃k•¬­∏·ot||vl具有类似的表现 ∀尽管采用较高浓度的植物生长调节剂处理可以将黑核桃子叶的胚性
感受态时间从授粉后 tw周延长至 tz周 o但其体胚发生的频率极低k‘¨ ∏°¤± ετ αλ. ,t||vl ∀授粉后 t{
周至果实成熟时的子叶具备器官发生能力 o但却失去了体胚发生能力k²±ª ετ αλ. ,t||x ~²±ª ετ αλ. ,
t||ul ∀
核桃也属无性繁殖的果树 o相对而言 o从营养繁殖器官诱导获得的体胚更具实用价值 ∀ „ ¼¯等
kt||ul用套袋隔离花粉而获得了/无融合生殖0的核桃果实 ∀他们诱导培养该果实的幼胚而获得了体
胚 ∀但是 o经同功酶与限制性长度多态片段分析发现 o该体胚仍然属合子胚起源 ∀刘淑兰等kt||ul用
幼龄实生苗叶柄作外植体进行诱导而获得了胚状体结构 o但未能将此胚状体结构转化成体胚 ∀ ×∏¯ ¦¨®¨
等kt||xl用胚囊 !花序梗 !根 !茎等作外植体进行诱导只获得了愈伤组织 o少数愈伤组织能进行器官发
生 o但都未发生体胚 ∀我们用单核期花药和试管苗叶柄 !叶脉 !茎等作试验获得与 ×∏¯ ¦¨®¨ 等相似的结
果 ∀迄今为止 o还未有从营养器官诱导核桃体胚发生的报道 ∀
112 培养基与植物生长调节剂
¦Šµ¤±¤«¤±等kt|{zl非常强调 ⁄Ž• 在核桃离体培养中的作用 ∀ ¦Šµ¤±¤«¤± 等kt|{zl指出 o
⁄µ¬√ µ¨和 Ž∏±¬¼∏®¬kt|{wl发表的 ⁄Ž• 培养基配方有印刷错误 ∀他们多次予以更正 ∀更正后的 ⁄Ž•
培养基取名为 ⁄Ž• p ≤ 的配方k表 ul ∀ ⁄Ž• 也是核桃体胚发生的首选培养基k表 tl ∀ ⁄Ž• 适用于
表 2 用于核桃体细胞胚发生的基本培养基 ≠
Ταβ .2 Μεδια υσεδ φορ ωαλνυτ σοµατιχ εµ βρψογενεσισ
成分
≤²°³²±¨ ±·¶
培养基  §¨¬¤k°ªrl
 ≥t • °  u ⁄Ž• p ≤v ⁄• w  • x  ⁄y
大
量
元
素
¤¦µ²2¨¯¨° ±¨·¶}
≤¤≤ u¯ qu‹u’ wws1s |y1s tw|1s tuu1x uy{1s u|w1x
Ž‹u°’w tzs1s tzs1s uyx1s utz1x tzs1s utz1x
Ž‘’v t|ss1s p p p |xs1s |xs1s
 ª≥’w qz‹u’ vzs1s vzs1s zws1s xxx1s vzs1s xxx1s
‘‹w‘’v tyxs1s wss1ss twty1s |s{1s tsux1s txvv1s
≤¤k‘’vlu qw‹u’ p xxy1s t|y{1s tuyu1s uz{1s |{w1s
Žu≥’w p ||s1s txx|1s tuzw1x w|x1s zz|1x
微
量
元
素
¬¦µ²2¨¯¨° ±¨·¶}
≤∏≥’w#x‹u’ s1sux s1ux s1ux s1ux s1tv{ s1tv{
ƒ¨‘¤∞⁄× „ vy1z vy1z ww1y ws1yx vy1z ws1yx
‹v…’v y1u y1u w1{ x1x y1u x1x
 ±≥’w#‹u’ ty1| uu1v vv1x uz1| t|1y ux1u
±≥’w#z‹u’ {1y {1y p w1v {1y w1v
‘¤u  ²w#u‹u’ s1ux s1ux s1v| s1vu s1ux s1vu
±k‘’vlu#y‹u’ p p tz1s {1x p {1x
≤²≤ u¯y‹u’ s1sux p p p s1stv s1stv
ŽŒ {1v p p p w1tx w1tx
‘¬≥’w qy‹u’ p p s1ssx s1ssv p s1ssv
有
机
物
’µª¤±¬¦°¤··¨µ}
甘氨酸 Š¯ ¼¦¬±¨ u1s u1s u1s u1s u1s u1s
肌醇  ¼²2¬±²¶¬·²¯ tss1s tss1s tss1s tss1s tss tss1s
烟酸 ‘¬¦²·¬±¬¦¤¦¬§ s1x s1x t qs s1zx s1x s1zx
∂ …y°¼µ¬§²¬¬±¨ ‹≤Œ s1x s1x p s1vx s1x s1ux
∂ …t׫¬¤°¬±¨ ‹≤Œ s1t t u t1x s1xx t1sx
≠  ≥t } ∏µ¤¶«¬ª¨ ¤±§≥®²²ªkt|yul ~• °  u }¯²¼§¤±§ ¦≤²º±kt|{sl ~⁄Ž• p ≤v }¦Šµ¤±¤«¤± oετ αλ.kt|{zl ~⁄• w }tru⁄Ž• n
tru • °  ~ • x }tru  ≥ n tru • °  ~ ⁄y }tru  ≥ n tru⁄Ž• q
核桃及其杂种的体胚诱导 o但却不适用于黑核桃k‘¨ ∏°¤± ετ αλ. ,t||vl ∀ ²±ª等kt||x ~t||ul的比较
试验指出 o培养在 ⁄Ž• 上的黑核桃子叶只有 t{ h 产生胚 o平均每个外植体产生 t 个胚 o而培养在
wst 林 业 科 学 vy卷
• °  上的黑核桃子叶有 z{ h产生胚 o平均产生 uu个胚 ∀我们的试验发现 o培养基对核桃体胚发生的
作用不仅与基因型有关 o而且还与外植体的种类有关 ∀在相同条件下 o培养在  ≥上的幼胚体胚发生
频率高 o数量多 o而培养在 ⁄Ž• 上的子叶成胚频率高 !数量多 ∀但无论是幼胚还是子叶均未在 • ° 
上产生胚 ∀ Ž²µ±²√¤等kt||vl能从培养在  ≥上的核桃幼胚获得体胚 o但不能从培养在 ⁄Ž• 上的幼
胚与子叶获得体胚 ∀这进一步说明培养基与外植体在体胚发生上的相互作用 ∀
生长素 !尤其是 u ow p ⁄是广泛用于诱导植物体胚发生的生长调节剂 o但却在核桃中少有应用k表
tl ∀被认为对体胚发生有阻碍作用的细胞分裂素类却是用于核桃体胚发生的主要生长调节剂 ∀这可
能与核桃的特殊生理机制有关 ∀w1w…„ n |1vŽ× n s1sxŒ…„k单位 ː l是核桃体胚诱导的主要生长调
节剂组成形式 o但不同的基因型与外植体间有差异k表 tl ∀ Ž²µ±²√¤等kt||vl和 ‘¨ ∏°¤±等kt||vl采用
上述生长调节剂组成未能诱导核桃和黑核桃子叶体胚发生 ∀ ‘¨ ∏°¤±等kt||vl认为 s1sx p x1s× ⁄ n
t1s p ts1s u ow p ⁄更适于黑核桃子子叶的体胚诱导 ∀这被后来 ²±ª等kt||x ~t||ul的比较试验所证
实 ∀¤¼2„¯¯¨°¤±§等kt||tl和 Ž²µ±²√¤等kt||vl认为 …„ 对幼胚的发育有阻碍 o在含 …„ 的培养基上 o
幼胚难以发生体胚 ∀但是 o袁巧平等kt||s¤~t||s¥l能够在仅含 …„ 的培养基上诱导幼胚的体胚发生 ∀
有研究指出 o植物生长调节剂不是幼胚体胚发生所必需的 o在无生长调节剂的培养基上也能获得幼胚
的体胚kŽ²µ±²√¤ ετ αλ. ,t||v ~¦Šµ¤±¤«¤± ετ αλ. ,t|{yl ∀
核桃的体胚发生已有了较多的报道 ∀但是 o体胚发生均是在不同条件k外植体或培养基l下获得
的 ∀在相同条件下比较不同基因型或外植体体胚发生能进一步揭示核桃的体胚发生规律 o为从成熟营
养器官获得体胚打下基础 ∀
u 体胚的出现与次生胚发生
外植体在诱导培养基上经 u ∗ w周诱导后转入无生长调节剂的基本培养基 o早的 u周左右 o晚的 y
个月左右便能见到体胚k×∏¯ ¦¨®¨ ετ αλ. ,t|{xl ∀核桃体胚的发育也遵循合子胚发育的历程 o由球形胚
经心形胚与子叶期胚发育成熟 ∀由于体胚发育的不同步 o经常在同一外植体上见到不同发育时期的胚
k图 tl ∀将子叶未展开前的胚从初生组织或胚上剥离下来单独培养 o在胚上便形成胚 o由此而形成体胚
无性系k×∏¯ ¦¨®¨ ετ αλ. ,t|{xl ∀
生长发育正常 !具典型的结构 !v ∗ x °°大小的胚是最易发生次生胚k×∏¯ ¦¨®¨ ετ αλ. ,t|{x ~×∏¯ ¦¨®¨
ετ αλ. ,t||xl ∀初生胚的多种部位都能形成次生胚 o但其子叶正面与其下胚轴是最易形成次生胚的部
位k图 ul ∀
次生胚产生的速率与培养基的组成有关 ∀在不含生长调节剂的基本培养基中 o次生胚产生的速率
低 ∀如加入微量的生长调节剂 o在增加次生胚的同时 o增加了畸型胚的比例 ∀如改变基本培养基的组
成 o不仅能提高次生胚产生的速率 o而且能使胚正常发育 ∀ ²±ª等kt||xl发现 o黑核桃的次生胚在无
生长调节剂的 ⁄Ž• 培养基上产生速率低 o而且胚只能发育至球形胚期 ∀如改用 • °  培养 o胚的发育
只稍有改善 ∀如采用 ⁄• 培养基 o次生胚产生的速率高 o胚也能正常发育至成熟 ∀我们用核桃的体胚
作试验也得到同样的结果 ∀同时我们还发现 o在核桃次生胚产生与发育上 o采用  • 培养基效果更好 o
但采用  ⁄会阻碍次生胚发生 ∀用于核桃体胚发生的几种培养基组成列于表 u中 ∀图 v反映了这几
种基本培养基对核桃次生胚发生的影响 ∀
v 核桃体胚的萌发与转化
核桃体胚的萌发与转化率极低k≤²µ±ot|{{ ~×∏¯ ¦¨®¨ ετ αλ. ,t|{xl ∀ ×∏¯ ¦¨®¨ 等kt|{xl认为 o核桃体
胚与合子胚一样具有休眠特性 ∀v ε ∗ x ε 低温处理 { ∗ ts周才能打破休眠 ∀尽管一些体胚未经低温
处理或经 u ∗ w周短时低温处理也能萌发 o但往往形成不正常植株 ∀ ¨¨等kt|{{l和 ⁄¨ ±ª等kt||{l认
为低温处理的效果也较差 ∀ ⁄¨ ±ª等kt||{l报道采用饱和  ªk‘’vlu#y‹u’ 或 ±≥’w#z‹u ’ 对体胚脱
水处理 v ∗ x §o然后在湿棉纸上萌发可提高萌发率 w ∗ x倍 ∀如脱水处理后在琼脂固化培养基上萌发
xst v期 汤浩茹等 }核桃体细胞胚发生与转基因研究进展
图 t q核桃幼果胚珠k„l与胚轴k…l的体细胞胚发生
ƒ¬ªqt ≥²°¤·¬¦¨°¥µ¼²¶©²µ°¬±ª©µ²° ¤± ²√∏¯¨k„l ¤±§¤± ¨°¥µ¼²±¬¦¤¬¬¶k…l ²©
º¤¯±∏·¬°°¤·∏µ¨ ©µ∏¬·¶kϑυγλανσ ρεγια ql
其萌发率与低温处理的相似 ∀体胚的质量k成熟度l对体胚的萌发率影响较大 ∀发育较差的胚 o既使经
低温或脱水处理也难以萌发k⁄¨ ±ª ετ αλ. ,t||{ ~×∏¯ ¦¨®¨ ετ αλ. ,t|{xl ∀
将萌发的体胚置于无生长调节剂的培养基上 o给予光照 ou ∗ v周左右体胚便开始生长 ∀为了促进
转化植株的生长 o采用低盐浓度的培养基或降低蔗糖浓度 !附加活性炭是有效方法k ¦Šµ¤±¤«¤± ετ
αλ. ,t|{zl ∀植株生长至 x ∗ {¦°高时 o可移入培养土驯化炼苗或进行离体增殖培养 ∀
w 核桃体胚的转基因研究
⁄¤±§¨ ®¤µ等kt|{{l用核桃与函兹核桃及其杂种的无性离体繁殖新梢作外植体 o用带致瘤质粒的农
杆菌作感染转化 o诱导获得了能在无生长调节剂的培养基上生长的瘤组织 ∀尽管未能获得转基因植
株 o但证明农杆菌能够感染核桃 ∀ ¦Šµ¤±¤«¤±等kt|{{ ~t||sl用核桃体胚作受体进行基因转移研究发
现 o农杆菌不仅能侵染体细胞胚 o而且受农杆菌侵染的体胚也能再生完整植株 ∀同时 o用体细胞胚作受
体不须进行刻伤处理 ∀尽管对核桃初生胚的起源有多种观点 o而核桃的次生胚却是表皮单细胞起源的
yst 林 业 科 学 vy卷
图 u 核桃次生胚发生于初生胚子叶正面k„l与初生胚下胚轴区k…l
ƒ¬ªqu • ³¨¨·¬·¬√¨¶²°¤·¬¦¨°¥µ¼²¶©²µ°¬±ª©µ²° ·«¨ ¤§¤¬¬¤¯ ¶∏µ©¤¦¨ ²©¦²·¼¯ §¨²±¶
k„l ¤±§µ¤§¬¦¯¨µ¨ª¬²±¶k…l ²© º¤¯±∏·¶²°¤·¬¦¨°¥µ¼²¶
k°²¯¬·² ετ αλ. ,t|{|l ∀用核桃的次生胚发生系统进行外源基因转移能够获得纯合的转基因植株 ∀
¦Šµ¤±¤«¤±等kt|{{l首次用核桃的体胚发生系统进行外源基因转移 o虽然成功地获得了抗卡那
霉素的转基因植株 o但其转化效率低 o方法繁琐 ∀ ⁄¤±§¨ ®¤µ等 kt|{|l对转化方法进行了改进 ∀
¦Šµ¤±¤«¤±等kt||sl采用改进的方法同样获得了转基因植株 o同时还提高了转化效率与加快了选择
进度 ∀
考德林蛾k苹果小卷蛾lk Χψδια ποµονελλα ql是核桃的一种重要害虫k ˜±¬√ µ¨¶¬·¼ ²© ≤¤¯¬©²±¬¤o
t|{zl ∀用化学药剂防治该虫不仅效果低 o而且还会引发其它害虫 ∀考德林蛾对从苏云金芽孢杆菌
k Βαχιλλυστηυρινγιενσισl中分离纯化的晶体蛋白k…q·q毒素l非常敏感 o极其微量的 …q·q毒素就能致死考
德林蛾k∂¤¬¯ ετ αλ. ,t||tl ∀ ⁄¤±§¨ ®¤µ等kt||wl将编码 …q·q毒素的基因之一 ¦µ¼ Œ„k¦l转入了核桃的体
细胞胚 o再生的核桃植株仅表现了极低的抗虫性 ∀其主要原因是该基因来自于苏云金芽孢杆菌的野生
变种k Β . τηυρινγιενσισ √¤µqκυρστακιl o其遗传密码有较大偏移 ∀ ⁄¤±§¨ ®¤µ等kt||{l通过人工构建该基
因 o然后再转移 ∀再生植株表现了高度的抗虫性 ∀¦µ¼ Œ„k¦l基因是第一个引入核桃并得到表达的有价
值基因 ∀
zst v期 汤浩茹等 }核桃体细胞胚发生与转基因研究进展
图 v 培养基基本成分对核桃次生胚发生的影响
上排从左至右 } • o⁄• 和  ⁄培养基 ∀下排从左至右 }⁄Ž• o ≥和 • °  培养基
ƒ¬ªqv „ ¦²°³¤µ¬¶²± ²© ° §¨¬∏° ±∏·µ¬¨±·¶¬± ¶¨¦²±§¤µ¼ ¶²°¤·¬¦¨°¥µ¼² ³µ²§∏¦·¬²±¬± º¤¯±∏·
˜³³¨µ¯¬±¨ ©µ²° ¯¨©··²µ¬ª«·} • o⁄• ¤±§  ⁄ ° §¨¬¤q²º µ¨¯¬±¨ ©µ²° ¯¨©··²µ¬ª«·}⁄Ž• o ≥ ¤±§ • °  ° §¨¬¤
核桃试管苗的生根极难 o其主要原因之一是插条中含有较多的类黄酮类酚类化合物 ∀类黄酮类物
质的合成是受查耳酮合成酶控制的 ∀ ∞¯ ∏¦«等kt||y ~t||{l和 ¤¼2„¯¯¨°¤±§等kt||tl将查耳酮合成酶
反义基因转入了核桃的体胚 ∀再生植株表现类黄酮类物质的减少 o在微繁新梢中检测不到栎苷 !杨梅
苷 !花青苷等物质 ∀在生根试验中 o转基因新梢表现对外源生长素敏感 o生根能力增强 ∀
有关用核桃体细胞胚作受体的转基因研究报道列于表 v ∀根据已有的报道并结合我们的实践经
验 ∀我们将用核桃体胚发生系统进行外源基因转移的操作程序归纳于图 w ∀
在过去的十多年时间里 o核桃的体细胞胚发生与转基因研究取得了巨大进展 ∀用体胚发生途径代
替器官发生途径繁殖苗木已得到应用k×∏¯ ¦¨®¨ ετ αλ. ,t|{x ~×∏¯ ¦¨®¨ ετ αλ. ,t||xl ∀通过体胚发生途径
产生种内杂种k≤²µ±ot|{{ ~≤²µ±ot|{|l !种间杂种k  ≤ Šµ¤±¤«¤± ετ αλ. ,t|{yl !三倍体k×∏¯ ¦¨®¨ ετ αλ. ,
t|{{l等极大地丰富了核桃的种质资源 ∀核桃体胚的超低温保存已取得进展k…²∏¦¤§ ετ αλ. ,t||wl ∀外
源有价值基因转入核桃并得到表达k⁄¤±§¨ ®¤µετ αλ. ,t||w ~t||{ ~∞¯ ∏¦« ετ αλ. ,t||y ~t||{ ~¤¼2„¯¯¨°¤±§
ετ αλ. ,t||t ~¦Šµ¤±¤«¤±
表 3 用核桃体细胞胚发生系统进行转基因研究报道一览表
Ταβ .3 Αλιστ οφ πυβλισηεδ στυδιεσ ον γενετρανσφορµατιον βψ Αγροβαχτεριυµ2µαδιατεδ σοµατιχ εµ βρψοσ οφ ωαλνυτ
种名 ≥³¨ ¦¬¨¶
菌系r质粒
…¤¦·¨µ¬¤¯ ¶·µ¤¬±¶r³¯¤¶°¬§¶
引人基因
Š ±¨¨ ¶¬±¶¨µ·¨§≠
参考文献
• ©¨¨ µ¨±¦¨
核桃 ϑ . ρεγια
核桃 ϑ . ρεγια
核桃 ϑ . ρεγια
核桃 ϑ . ρεγια
杂种核桃 ϑ. νιγρα ≅ ϑ. ρεγια
杂种核桃 ϑ. νιγρα ≅ ϑρεγια
杂种核桃 ϑ. νιγρα ≅ ϑρεγια
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≠ Ž¤±}抗卡拉霉素基因k®¤±¤°¼¦¬± ³«²¶³«²·µ¤±¶©¨µ¤¶¨l oª∏¶}Š˜≥ 基因kΒ2ª¯∏¦∏µ²±¬§¤¶¨l q¦µ¼ Œ„k¦l }…q·q毒素晶体蛋白基因k¦l
k¬±¶¨¦·¬¦¬§¤¯ ¦µ¼¶·¤¯ ³µ²·¨¬± ²© Βαχιλλυστηυρινγιενσισl o≤ ‹≥ }查耳酮合成反义基因k¤±·¬¶¨±¶¦«¤¯¦²±¨ ¶¼±·«¤¶¨l q
{st 林 业 科 学 vy卷
农杆菌工程菌 ∞±ª¬±¨ µ¨¨§¥¤¦·¨µ¬¤¯ ¶·µ¤¬±k¶l
液体培养k¯ ¬´∏¬§¦∏¯·∏µ¨l≈k细菌培养基k¥¤¦·¨µ¬¤¯ ° §¨¬∏°l n tss °ªr庆大霉素kª¨ ±·¤°¬¦¬±l n xs °ªr卡拉霉素kŽ¤±¤°¼¦¬±l otxs ∗ ussµr°¬±ou{ ε o过夜k²√ µ¨±¬ª«·l 
菌液k…¤¦·¨µ¬¤¯ ¶²¯∏·¬²±l
离心k≤ ±¨·µ¬©∏ª¨ lkysssµr°¬±ots °¬±l
菌团k…¤¦·¨µ¬¤¯ ³¨ ¯¯ ·¨l
悬浮k≥∏¶³¨ ±¶¬²±l≈ts °细菌培养基k¥¤¦·¨µ¬¤¯ ° §¨¬∏°l 
细菌母液k…¤¦·¨µ¬¤¯ ¶·²¦®¶²¯∏·¬²±l
稀释k⁄¬¯∏·¬²±l≈细菌培养基k¥¤¦·¨µ¬∏° °§¨¬∏°l 
细菌工作液k¥¤¦·¨µ¬¤¯ º²µ®¬±ª¶²¯∏·¬²±l
≈’⁄wus € s qx或k²µlu1x ≅ ts{细胞k¦¨¯¯¶lr° 
体细胞胚无性系k• ³¨¨·¬·¬√¨¨°¥µ¼²¶l
体细胞胚k∞°¥µ¼²¶l≈u ∗ x °°大小k¯ ²±ªl 

接种k¬±²¦∏¯¤·¬²±l o感染k¬±©¨ ¦·¬²±l≈k室温kµ²²° ·¨°³¨µ¤·∏µ¨l ots ∗ tx °¬± q 
感染的体细胞胚kŒ±²¦∏¯¤·¨§¨°¥µ¼²¶l
共培养k≤²¦∏¯·¬√¤·¬²±l≈⁄Ž• n s1t°  乙酰丁香酮k¤¦¨·²¶¼µ¬±ª²±¨ l o黑暗k§¤µ®l ouv ε ow{ « 
受侵染的体细胞胚kŒ±©¨ ¦·¨§¨°¥µ¼²¶lk∞²l
选择培养k≥¦µ¨ ±¨¬±ªl≈⁄Ž• n xss °ªr噻孢霉素k¦¨©²·¤¬¬°l n tss °ªr卡拉霉素k®¤±¤°¼¦¬±l ouv ε o黑暗k§¤µ®l o每 z ∗ ts §转移 t次k·µ¤±¶©¨µ·²©µ¨¶« ° §¨¬∏° √¨ µ¨¼ z ∗ ts §¤¼¶ 
第一代体细胞胚k׫¨ t¶·ª¨ ±¨ µ¤·¬²± ²©µ¨³¨·¬·¬√¨¨°¥µ¼²¶lk∞tl
选择培养k≥¦µ¨ ±¨¬±ªl≈条件同前k·«¨ ¶¤°¨¦²±§¬·¬²±¶l 
第二代体细胞胚k׫¨ u±§ª¨ ±¨ µ¤·¬²± ²©µ¨³¨·¬·¬√¨¨°¥µ¼²¶lk∞ul
Š˜≥测定kŠ˜≥ ·¨¶·l
Š˜≥测定正反应 ∞ukŠ˜≥ ³²¶¬·¬√¨µ¨¤¦·¬²± ∞ul
选择培养k≥¦µ¨ ±¨¬±ªl≈条件同前k·«¨ ¶¤°¨¦²±§¬·¬²±¶l 
第三代体细胞胚k׫¨ vµ§ª¨ ±¨ µ¤·¬²± ²©µ¨³¨·¬·¬√¨¨°¥µ¼²¶lk∞vl
Š˜≥测定kŠ˜≥ ·¨¶·l
Š˜≥测定正反应 ∞vkŠ˜≥ ³²¶¬·¬√¨µ¨¤¦·¬²± ∞vl
增殖k°µ²¯¬©¨µ¤·¬²±l
∞v无性系k∞v ≤ ²¯±¨ l
萌发kŠ µ¨°¬±¤·¬²±l
小植株k°¯ ¤±·¯¨·¶l
转基因鉴定≈×µ¤±¶©²µ° §¨ª¨ ±¨ k¶l ¤¶¶¤¼ 
转基因植株k×µ¤±¶©²µ° §¨³¯¤±·¶l
图 w 用核桃体细胞胚进行基因转移的操作程序
ƒ¬ªqw °µ²¦¨§∏µ¨¶©²µ²¥·¤¬±¬±ª·µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·¶©µ²° ¶²°¤·¬¦¨°¥µ¼²¶²© º¤¯±∏·¥¼ ∏¶¬±ª Αγροβαχτεριυ µ2° §¨¬¤·¨§ ° ·¨«²§
ετ αλ. ,t||sl ∀随着核桃体胚发生研究的深入 o有价值基因分离与克隆的增多 o遗传转化系统的日臻完
善 o用遗传工程方法全面改良核桃品种将指日可待 ∀
参 考 文 献
刘淑兰 o韩碧文 o陈正华 q核桃细胞胚胎发生及其细胞学观察 q北京农业大学学报 ot||u ot{kul }u| ∗ vu
袁巧平 o董茂山 o¤¼2„¯¯¨°¤±§≤ q离体条件下核桃器官发生和体细胞胚胎发生 q林业科学 ot||s¤ouykyl }w|x ∗ w|{
袁巧平 o董茂山 o黄钦才等 q核桃细胞胚诱导的初步研究 q林业科技通讯 ot||s¥ozktl }tv ∗ tw
„ ¼¯  „  oƒ­¨¯¯¶·µ²° • Š o¦Šµ¤±¤«¤± Š ‹ oετ αλ. ’µ¬ª¬± ²© º¤¯±∏·¶²°¤·¬¦¨°¥µ¼²¶§¨·¨µ°¬±¨ §¥¼ • ƒ° ¤±§¬¶²½¼°¨¤±¤¯¼¶¬¶q‹²µ·≥¦¬q
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…²∏¦¤§  × o…µ¬¶²±  ¤±§ ‘¨ ªµ¬¨µ° q≤µ¼²³µ¨¶¨µ√¤·¬²± ²© º¤¯±∏·¶²°¤·¬¦¨°¥µ¼²q≤µ¼²2¨··¨µ¶ot||w otxkvl }txt ∗ tys
≤²µ± ⁄q≥²°¤·¬¦¨°¥µ¼²ª¨ ±¨ ¶¬¶¬±·¬¶¶∏¨ ¦∏¯·∏µ¨ ²© º¤¯±∏·kϑυγλανσ νιγρα , ϑ . µ αϕορ ¤±§«¼¥µ¬§¶ϑ. νιγρα ≅ ϑ . ρεγιαl Œ± }„«∏­¤  • k §¨ql o
|st v期 汤浩茹等 }核桃体细胞胚发生与转基因研究进展
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·µ¤±¶ª¨ ±¬¦º¤¯±∏·¶²°¤·¬¦¨°¥µ¼²¶q°¯ ¤±·≥¦¬qt||{ otvtkul }t{t ∗ t|v
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¤±¤·²°¬¦¤¯ ¤±¤¯¼¶¨¶²©¶²°¨µ¨ª¨ ±¨ µ¤±·¶q„¦·¤ ‹²µ·qt||v ovtt }tux ∗ tvv
¨¨… ≤ o≥«¬° ≥ ≠ ¤±§ ¨¨≥ Žq¤¶¶³µ²³¤ª¤·¬²± ¤±§ª¨µ°¬±¤·¬²± ²©¶²°¤·¬¦¨°¥µ¼²¶¬± ϑυγλανσ ρεγια qk∞±ª¯¬¶« º¤¯±∏·l q• ¶¨q• ³¨qŒ±¶·q
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°²¯¬·² ∂ ≥ o¦Šµ¤±¤«¤± Š ‹ o°¬±±¨ ¼ Žετ αλ. ’µ¬ª¬± ²©¶²°¤·¬¦¨°¥µ¼²¶©µ²° µ¨³¨·¬·¬√¨¯¼ ¨°¥µ¼²ª¨ ±¬¦¦∏¯·∏µ¨¶²© º¤¯±∏·kϑυγλανσρεγια ql }
¬°³¯¬¦¤·¬²±¶©²µ Αγροβαχτεριυ µ2° §¨¬¤·¨§·µ¤±¶©²°¤·¬²±q°¯ ¤±·≤¨¯¯ • ³¨·qt|{| o{kvl }ut| ∗ uut
×∏¯ ¦¨®¨ • o ¦Šµ¤±¤«¤± Š ‹ q≥²°¤·¬¦¨°¥µ¼²ª¨ ±¨ ¶¬¶¤±§³¯¤±·µ¨ª¨ ±¨ µ¤·¬²± ©µ²° ¦²·¼¯ §¨²±¶²© º¤¯±∏·oϑυγλανσ ρεγια q°¯ ¤±·≥¦¬qt|{x ows
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q¦√ ¤±µ¨ª¬¤±q°¯ ¤±·≤¨¯¯ • ³¨·qt|{{ ozkwl }vst ∗ vsw
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stt 林 业 科 学 vy卷