全 文 ：华东地区豆科树种根瘤菌多样性的研究
陈景荣 韩素芬
k福建省森林病虫害防治检疫总站 福州 vxsssvlk南京林业大学 南京 utssvzl
摘 要 } 华东地区 xt个豆科树种k含羞草亚科 x属 o蝶形花亚科 t{属l根瘤中分离获得的 yy个菌株经形
态 !生理生化 !抗逆性等性状测定 o对 wu个性状进行了聚类分析 o除 |u2z{2u菌株外 oyx个菌株在 s1zx的相似
水平上可划分为 y个菌群 ∀根据菌株的生长速度 oy个菌群可以分为快生和慢生两个类群 o但两类群的某些
性状与目前根瘤菌分类系统中的分属辨别特征不完全符合 o如部分菌株能利用其淀粉 ∀聚类分析结果还表
明 o菌群划分的主要依据是表型特征 o与寄主的种类 !来源没有相关性 ∀yy个菌株在形态 !生理生化 !抗逆性
以及交叉结瘤试验结果存在明显差异 o表明了豆科树种根瘤菌的多样性 ∀
关键词 } 华东地区 o豆科树种根瘤菌 o多样性
收稿日期 }t||{ p sy p s{ ∀
基金项目 }国家自然科学基金kv|yzsystl ∀
∆Ις ΕΡΣΙΤΨ ΟΦ ΝΟ∆ΥΛΕ ΒΑΧΤΕΡΙΑ ΙΣΟΛΑΤΕ∆ ΦΡ ΟΜ ΤΗΕ
Ρ ΟΟΤ ΝΟ∆ΥΛΕΣ ΟΦ ΛΕΓΥΜΙΝΟΥΣ ΤΡΕΕΣ ΙΝ ΕΑΣΤ ΧΗΙΝΑ
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k Φορεστ Πεστ Θυαραντινε i Χοντρολ Στατιον οφ Φυϕιαν Προϖινχε Φυζηουvxsssvl
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( Νανϕινγ Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ Νανϕινγutssvz)
Αβστραχτ : ≥¬¬·¼2¶¬¬ µ«¬½²¥¬¤¯ ¶·µ¤¬±¶o¬¶²¯¤·¨§©µ²° µ²²·±²§∏¯ ¶¨²©©¬©·¼2²±¨ ¶³¨¦¬¨¶²© º²²§¼ ¯¨ ª∏° ¶¨
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Κεψ ωορδσ: ∞¤¶·≤«¬±¤o • «¬½²¥¬¤©µ²° º²²§¼ ¯¨ ª∏° ¶¨o⁄¬√ µ¨¶¬·¼
多年来 o人们对生物共生固氮的研究多偏重于豆科作物 !绿肥 !牧草与根瘤菌的共生固氮体系 o一直到
现在为止 o根瘤菌的分类也大多仅涉及农业上的豆科植物k王素英 ot||zl≈t  ∀对于大量野生的豆科植物 o
尤其在热带和亚热带分布的豆科树种根瘤菌很少见有报道 o对其在形态 !生理代谢 !共生体系等方面表现
出来的差异缺乏了解 o有关豆科树种根瘤菌分类方面的资料更为罕见 ∀t|{s年 o…¤¶¤®k…¤¶¤®  Žετ αλ qo
t|{sl≈u 曾提议将豆科树种根瘤菌归属于豇豆族 ∀t|{w年 o…¨ µª¨¼系统细菌学手册中 o将许多豆科树种根
瘤菌归入 Βραδψρηιζοβιυµ 属 ,而该属实际上代表 t个杂乱的根瘤菌群 ,其中的分类关系还不清楚 ∀因此 ,
第 vx卷 第 t期t | | |年 t 月
林 业 科 学
≥≤Œ∞‘׌„ ≥Œ∂ „∞ ≥Œ‘Œ≤ „∞
∂ ²¯1vx o ‘²1t
¤± qot | | |
豆科树种根瘤菌的分类地位至今尚未确定 ∀韩素芬等(t|{z)[ v]曾建议将豆科树种根瘤菌分列于 Ρηιζοβι2
υµ 和 Βραδψρηιζοβιυµ 两属中 ∀张小平等kt||tl≈w 通过对分离获得的豆科树种根瘤菌进行数值分类研究 o
得到了 t|个类群 ∀可见自然界中豆科树种根瘤菌的多样性相当丰富 ∀前人对于豆科树种根瘤菌的分类
研究目前仍只局限在少数豆科树种 o对其在根瘤菌科中的分类地位仍然需要做更多 !更深入的工作 ∀本文
对我国华东地区豆科树种根瘤菌多样性做了探讨 ∀
t 材料与方法
1 q1 菌株来源
从华东地区的豆科树种根瘤中分离获得的 yy个根瘤菌菌株 ∀
1 q2 培养基和培养条件
根瘤菌用 ≠ ∞ 培养基作基础培养基 o所有试验每种处理均设 v个重复 ∀除温度试验外 o培养物均
在 u{ ε 下恒温培养 ∀
1 q3 根瘤菌株的形态特征观察
t qv qt 菌落培养性状 存放在冰箱中的根瘤菌株经活化后 o制备成稀释均匀的菌悬液 o平板划线培
养 ∀观察记录第 t个单菌落可见时间 !菌落直径以及其它性状 ∀
t qv qu 鞭毛类型 取活化 v ∗ w次的菌株 o采用 …¯ «¨§¨µŠ²¯§¥¨µª鞭毛染色法染色 o油镜下观察鞭毛的
数量及着生位置 ∀
1 q4 根瘤菌株的生理生化特性研究
t qw qt 碳源利用 以各种碳源代替 ≠ ∞ 培养基中的甘露醇 o并用 s qssux h溴百里酚兰作 ³‹ 指示
剂 ∀供试碳源包括 ⁄2半乳糖 !乳糖 !甜醇 !⁄2木糖 !海藻糖 !麦芽糖 !鼠李糖 !2k n l阿拉伯糖 !葡萄糖 !可
溶性淀粉 !山梨糖 !蔗糖 !肌醇 !纤维二糖 !棉子糖 !木糖 !琼脂糖 !2甲硫氨酸 !⁄2Α2丙氨酸 !2精氨酸 !
水杨酸钠 !乙酸钠 !苯甲酸钠 ∀
t qw qu 氮源利用 以各种氮源代替 ≠ ∞ 培养基中的酵母汁 o并用 s qssux h溴百里酚兰作 ³‹ 指示
剂 ∀测定的氨基酸包括 2甲硫氨酸 !2半胱氨酸 !2胱氨酸 !2谷氨酸 !⁄2Α2丙氨酸 !2精氨酸 !2赖氨
酸 !2天冬氨酸 !2苏氨酸 !2苯丙氨酸 !2瓜氨酸 !⁄2酪氨酸 !2脯氨酸 ∀
t qw qv 温度对生长的影响 选择测定温度为 ts ε !vu ε !vz ε !ws ε ∀在上述不同设定温度下恒温
培养 ∀
t qw qw ³‹ 值对生长的影响 选择测定的 ³‹ 值分别为 w !x !{ qx !ts ∀
t qw qx ‘¤≤¯浓度对生长的影响 配制浓度有 s qx h !s q{ h !t h !u h !v h !w h !x h ∀
t qw qy 抗生素耐受性的测定 参考 ²¶¨¼方法 ∀测定的抗生素包括林肯霉素ktssΛªr°l !卡那霉素
ktsΛªr°!xsΛªr°!tssΛªr°l !链霉素ktsΛªr°!xsΛªr°!tssΛªr°l !庆大霉素kxsΛªr°l !
青霉素ktsΛªr°l !红霉素kvsΛªr°l ∀
t qw qz 石蕊牛奶试验 根据5微生物分类学6k张纪忠 ot||sl≈x 一书中的方法进行接种根瘤菌 o培养
x§!ts§!tx§分别观察记录相应特征 ∀
1 q5 聚类分析
根据聚类分析类平均连锁法原理 o应用 …„≥Œ≤ 语言自行编制系统聚类分析程序 ∀
u 结果与分析
所有菌落均为无色或乳白色 o表面光滑 o具光泽 o不吸收刚果红 o为典型的根瘤菌菌落 ∀根据试验
结果 o最后选取 wu个性状进行聚类分析 o得 ˜°Š  „ 树状图k图 tl ∀从图 t上可见 o除 |u2z{2u菌株
外 o供试的 yx个菌株和对照的豌豆根瘤菌在 yu q| h的相似水平上归为一群 o在 zx h相似水平上 oyx个
菌株可划分为 y个表观群 o而豌豆根瘤菌单独为一类 ∀y个表观群中 o第 t !u !v !w菌群的单菌落可见时
间为 y ∗ z§o第 x !y菌群的单菌落可见时间为 u ∗ x§∀
第 t菌群包括 vy个菌株 o采集地点没有地域性 o寄主广泛分布在含羞草亚科和蝶形花亚科各属的
豆科树种内 o最小相似值 Σ € s qzz| ∀第 u菌群包括 v个菌株 o可分为两个亚群 ∀第 t亚群包括 |u2ttx2
{w 林 业 科 学 vx卷
图 t yy个豆科树种根瘤菌聚类分析树状图k˜°Š  „树状图l
ƒ¬ªqt ⁄¨ ±§µ²ªµ¤° ²©¶¬¬·¼2¶¬¬µ«¬½²¥¬¤¯ ¶·µ¤¬±¶¥¼ ˜°Š  „
Ρπσευδοαχαχια φ . δεχαισνεανα :红花刺槐 ; Ρπσευδοαχαχια φ . ινερµισ:无刺槐 ∀
t和 |u2ttv两个菌株 o均来源于福建 o寄主为刺桐 !藤黄檀 o在 Σ € s q{xv处相连 ~第 u亚群只有 |u2yw2t
一个菌株 o来源于南京 o寄主为胡枝子 ∀两个亚群在 Σ € s qz{处相连 ∀第 v菌群包括 {个菌株 o采集自
江苏省和山东省 o寄主植物分布于含羞草亚科和蝶形花亚科内 o最小相似值 Σ € s q{yu ∀第 w菌群有两
个菌株 o来源于南京 o寄主为苦参 !紫藤 o最小相似值 Σ € s q{u| ∀第 x 菌群包括 tv个菌株 o采集地点无
地域性 o寄主植物分布于含羞草亚科和蝶形花亚科内 o最小相似值 Σ € s qz{u ∀第 y菌群有 v个菌株 o可
|w t期 陈景荣等 }华东地区豆科树种根瘤菌多样性的研究
分为两个亚群 ∀第 t亚群包括 |u2z{2t和 |u2zv两个菌株 o均来源于南京 o寄主为铁马鞭 !毛叶怀槐 o在
Σ € s q|uy处相连 ~第 u亚群只有 |u2t2{一个菌株 o来源于山东 o寄主为刺槐 ∀两个亚群在 Σ € s qz{z处
相连 ∀豌豆根瘤菌与第 y 菌群在 Σ € s qzt{处相连 ∀|u2z{2u菌株在树状图上表现很特别 o最小相似值
Σ € s qwyw ∀
各菌群的生理生化特征见表 t ∀根据计算结果 o可确认第 t菌群以 |u2yw2u菌株为模式菌株 o选取
的代表株有 |v2tx{ !|u2|v !|v2tww !|v2twu !|u2ts{ !|v2twv !|u2xy !|u2|z !|u2tx|等 ∀其他菌群由于菌株
量少 o群内各菌株的平均相似值未能超过 zx h o因而不能选出模式菌株 ∀
v 结论及讨论
通过聚类分析研究 oyx个豆科树种根瘤菌在 zx h的相似水平上初步分为了 y个菌群 o表明了豆科
树种根瘤菌在形态 !生理生化 !抗逆性等方面的多样性 ∀
以前认为与热带豆科植物结瘤的多为慢生型根瘤菌 o并根据/互接种族0的关系 o将豆科树种根瘤
菌归属于豇豆族 ∀通过对 yy个豆科树种根瘤菌聚类分析的研究和交叉结瘤试验k韩素芬 ot||yl≈y 结
果表明 o豆科树种根瘤菌的共生寄主范围已超出了豇豆族的植物范围 o其分类与寄主植物没有很大的
关系 ∀因此 o本研究认为应把豆科树种根瘤菌从杂乱的豇豆族中分出来 ∀这与韩素芬 !周湘泉的研究
结果一致 ∀另外 o韩素芬在同一寄主根瘤中分离获得了快 !慢生型根瘤菌也更说明了根瘤菌与寄主植
物之间复杂的共生关系 ∀
表 t 菌群的生理生化特征
Ταβ .t Τηε πηψσιολογιχαλ ανδ βιοχηεµιχαλ χηαραχτεριστιχσ οφ σιξ χλυστερσ
特 征
≤«¤µ¤¦·¨µ¬¶·¬¦¶
群 t
≤ ∏¯¶·¨µt
群 u
≤ ∏¯¶·¨µu
群 v
≤ ∏¯¶·¨µv
群 w
≤ ∏¯¶·¨µw
群 x
≤ ∏¯¶·¨µx
群 y
≤ ∏¯¶·¨µy
菌落
观察
≤²¯²2
±¼
°µ²³¨2
µ·¬¨¶
单菌落可见时间
∂¬¶∏¤¯ ·¬°¨²©
¶¬±ª¯¨¦²¯²±¼
y ∗ z§ ≥¬¬∗ ¶¨√ ±¨ §¤¼¶
u ∗ x§ × º²∗ ©¬√¨§¤¼¶
颜色
≤²¯²µ
无色 ×µ¤±¶³¤µ¨±·
乳白色 Œ√²µ¼
凸起程度
°µ²°¬±¨ ±¦¨ §¨ ªµ¨¨
平凸 ƒ¯ ¤·
高凸 ‹¬ª«
粘度
≥·¬¦®¬±¨ ¶¶
大 …¬ª
小 ∗ 中等 ¬··¯¨ ∗ ¬§§¯¨
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鞭毛类型
×¼³¨ ²©©¯¤ª¨ ¯¯∏°
单鞭毛 ≥¬±ª¯¨©¯¤ª¨ ¯¯∏°
多鞭毛 ¤±¼ ©¯¤ª¨ ¯¯∏°
tt
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t
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温度实验
Šµ²º·«·¨°³¨µ¤·∏µ¨
ts ε
vu ε
vz ε
p
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x
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³‹ 值实验
³‹¤ª¨ ¶¨±¶¬·¬√¬·¼
³‹ € { qx
³‹ € ts
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‘¤≤¯耐受性
‘¤≤¯·²¯ µ¨¤±¦¨
s qx h
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t qs h
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石蕊牛奶实验
¬·°∏¶°¬¯®¦∏¯·∏µ¨
产酸 „¦¬§2³µ²§∏¦¨§
产碱 „ ®¯¤¯¬ª¨ ±²∏¶
酸凝 „¦¬§¦∏µ§
凝乳酶沉淀 • ±¨±¨ ·¦∏µ§
无反应 ‘²µ¨¤¦·¬²±
p
vw
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sx 林 业 科 学 vx卷
续表 t
唯一碳源利用
˜·¬¯¬·¼ ²©¶²¯¨¦¤µ¥²±
µ¨¶²∏µ¦¨
乳糖 ¤¦·²¶¨
甜醇 ⁄∏¯¦¬·²¯
⁄2木糖 ⁄2¬¼¯ ²¶¨
海藻糖 ×µ¨«¤¯²¶¨
麦芽糖  ¤¯·²¶¨
可溶性淀粉 ≥²¯∏¥¯¨¶·¤µ¦«
山梨糖 ≥²µ¥¬·²¯
肌醇 Œ±²¶¬·²¯
2谷氨酸 2 Š¯ ∏·¤°¬¦¤¦¬§
2甲硫氨酸 2  ·¨«¬²±¬±¨
t|
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唯一氮源实验
˜·¬¯¬·¼ ²©¶²¯¨±¬·µ²ª¨ ±
µ¨¶²∏µ¦¨
2甲硫氨酸 2  ·¨«¬²±¬±¨
2半胱氨酸 2≤¼¶·¨¬±¨
2精氨酸 2„µª¬±¬±¨
⁄2Α2丙氨酸 ⁄2Α2„ ¤¯±¬±¨
2赖氨酸 2¼¶¬±¨
⁄2酪氨酸 ⁄2×¼µ²¶¬±¨
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抗生素抗性
„±·¬¥¬²·¬¦µ¨¶¬¶·¤±¦¨
xsΛªr°卡那霉素 Ž¤±¤°¼¦¬±
tssΛªr°卡那霉素 Ž¤±¤°¼¦¬±
tsΛªr°青霉素 ° ±¨¬¦¬¯¯¬±
tsΛªr°链霉素 ≥·µ¨³·²°¼¦¬±
xsΛªr°链霉素 ≥·µ¨³·²°¼¦¬±
tssΛªr°链霉素 ≥·µ¨³·²°¼¦¬±
xsΛªr°庆大霉素 Š ±¨·¤°¼¦¬±
uu
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p
p
≠ / n 0表示阳性反应 ~/ p 0表示阴性反应 ~/ t ou o, ovx0等数字表示阳性反应的菌株数 ∀/ n 0 ° ¤¨±¶³²¶¬·¬√¨µ¨¤¦·¬²±~
/ p 0 ° ¤¨±¶±¨ ª¤·¬√¨µ¨¤¦·¬²±~/ t ou o, ovx0 ° ¤¨±¶·«¨ ±∏°¥¨µ²©¶·µ¤¬±¶²©³²¶¬·¬√¨µ¨¤¦·¬²±q
在 …¨ µª¨ ¼鉴定细菌学手册中 o豆科树种根瘤菌被认为是属于慢生型根瘤菌 o并作为豇豆类群归入
Βραδψρηιζοβιυ µ 属中 ∀从本试验聚类分析的 ˜°Š  „ 树状图上可见 o单菌落可见时间为 u ∗ x§的菌
株归入菌群 x !y中 oy ∗ z§菌株归入菌群 t ∗ w中 o据此 o本研究认为豆科树种根瘤菌并不都是慢生型 o
它们也可以分为快生类群和慢生类群k见图 t中水平虚线l ∀
研究还发现 o快 !慢生类群中的豆科树种根瘤菌在形态 !生理生化特性上存在明显差异 o其中在石
蕊牛奶试验中表现得尤为明显 ∀慢生类群菌株在石蕊牛奶试验中 o凡产碱的菌株归为第 t !u菌群 o产
碱并有凝乳酶沉淀现象的菌株归为第 v菌群 o产酸并有酸凝现象的菌株归为第 w菌群 ∀因此 o本研究
认为还可将豆科树种根瘤菌分为不同的亚群 o它们在亚群分类水平上具有多样性 ∀
研究结果证明 o豆科树种根瘤菌分群的主要依据是菌株的表型特征 o与寄主植物的种类 !来源没有
相关性 ∀
对照根瘤菌科目前的分类系统 o发现豆科树种根瘤菌的快 !慢生类群菌株在某些性状上与 w属辨
别特征存在差异 }ktl在慢生类群根瘤菌中 o除 v个菌株菌落为乳白色 !不透明外 o其余菌株的菌落均为
无色 !透明 ~kul快 !慢生类群菌株在矿盐 p甘露醇或其它碳水化合物培养基上不产碱 o多数菌株产酸 o
因此本研究认为 ³‹ 值变化不能作为衡量快 !慢生类群根瘤菌的指标 ~kvl在碳源试验中发现某些菌株
能以可溶性淀粉作为唯一碳源 o这与张小平的研究结果相同 o而与 ⁄q≤ q²µ§¤±提出的根瘤菌不利用淀
粉的观点不一致 ∀该现象的产生说明某些豆科树种根瘤菌的代谢方式和以往研究的根瘤菌不同 o对其
机理还应进行深入的研究 ∀由此可见 o本研究中豆科树种根瘤菌的表型特征与目前的分类系统不完全
符合 ∀
此外 o研究结果表明豌豆根瘤菌与豆科树种根瘤菌在形态 !生理生化 !共生寄主等性状上不完全相
同 o其在 ˜°Š  „树状图上被单独列为一类 o这表明豆科树种根瘤菌与草本植物根瘤菌之间有较大的
差异 ∀
tx t期 陈景荣等 }华东地区豆科树种根瘤菌多样性的研究
本研究所用的豆科树种根瘤菌虽大都采自华东地区 o但从试验结果来看 o仍具有代表性 ∀另外 o研
究所设的对照仅为豌豆快生型根瘤菌 o若能将试验结果与前人试验所得的豆科草本植物根瘤菌的各种
表型特征进行系统聚类分析 o将可以对豆科树种根瘤菌在根瘤菌分类系统中的地位作更细致的讨论 ∀
总之 o对豆科树种根瘤菌分类地位的确定 o还有待于采集更多的菌株 o并应用新的技术手段k如 ⁄‘„r
⁄‘„杂交 !ty≥µ• ‘„等l做进一步的工作 ∀
从 ˜°Š  „树状图上可见 o第 v !w菌群与第 x 菌群的最小相似值 Σ € s qzv o并能利用较广泛的碳
源和氮源 o这类菌株可能是慢生类群与快生类群豆科树种根瘤菌之间的过渡类型 ∀第 y 菌群的 v个菌
株与豌豆根瘤菌在 Σ € s qzt{处相连 o也表明这一菌群菌株的某些特性与草本植物根瘤菌较接近 ∀结
合生理生化特征 o似乎可以这么认为 }第 t !u菌群的菌株较原始 o生长慢 o对不良环境的抗逆性较差 o经
过第 v !w菌群逐渐进化为快生型根瘤菌 o抗逆性也逐步增强 ∀但豆科树种根瘤菌是否有这样的进化趋
势还需要深入的研究 ∀
|u2z{2u菌株在 ˜°Š  „树状图上与其余根瘤菌有很大差异 o最小相似值 Σ € s qwyw ∀菌株在南京
采集 o寄主为铁马鞭 o是唯一的单菌落可见时间为 |§的菌株 ∀而与该菌株同一寄主根瘤上分离的快生
型 |u2z{2t菌株在各个性状上却表现出对环境很强的适应性 o对于两个菌株为何都在铁马鞭上结瘤以
及 |u2z{2u菌株在树状图上表现出来的特异现象 o还有待于进一步从形态解剖和遗传学方法上的研究
来确定 ∀
在碳 !氮源试验中还观察到菌落发生了 w种变化 }产酸 !菌落中心产生黄色沉淀 !菌落变黄 !菌落变
绿 o并且前 v种变化有时交叉 ∀同一菌株在不同碳源上的变化不同 o各菌株在同一碳源培养基上的表
现也不相同 ∀菌株在以某些氨基酸为唯一碳源的培养基上生长时 o菌落会变绿 ∀菌落发生的这种变化
可能与各菌株的代谢途径之间有一定的关系 o其规律还需在对大量菌株研究后的基础上进行总结 ∀在
氮源试验中 o有一些菌株的菌落开始为绿色 o生长一段时间后又转变为黄色 ∀
在石蕊牛奶试验中还发现 |u2t2y !{z2t2t !{z2u !|v2tws !{w2ut等 x个菌株产生反应所需的时间长达
半个月以上 o且都产碱 o所产生的乳清层可分为 u ∗ v层 o各层颜色还不相同 ~|u2t2y菌株的乳清层底部
为豆黄色沉淀 o中间为浅紫色沉淀 o上部为紫罗兰清液 ~{z2t2t !|v2tws !{z2u v个菌株的各层均较 |u2t2y
菌株的各层为深 ~{w2ut菌株乳清层的上层为紫罗兰清液 o下层为淡紫色沉淀 ∀x个菌株的寄主和来源
不固定 o在菌落形态 !生理生化性状测定试验结果中没有发现其它异常现象 ∀以上现象还未见过报道 o
产生的原因还需深入研究 ∀
参 考 文 献
t 王素英 q根瘤菌分类的新进展 q微生物学通报 ot||z ouwktl }ww ∗ wz
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v 韩素芬 o周湘泉 q豆科树种根瘤菌共生体系的研究 µ }豆科树种根瘤菌的分类地位 q南京林业大学学报 ot|{zkul }u{ ∗ vy
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x 张纪忠主编 q微生物分类学 qt||s o上海 }复旦大学出版社
y 韩素芬 o陈景荣 o谢文娟 q豆科树种根瘤菌与四种豆科植物的接种试验 q林业科学研究 ot||y o|kyl }yts ∗ ytx
ux 林 业 科 学 vx卷