全 文 ： 第 vy卷 第 t期u s s s年 t 月
林 业 科 学
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¤± qou s s s
× „u|2…¤µ±¤¶¨ 基因导致
抗虫转基因欧洲黑杨雄性不育的研究 3
李 玲 齐力旺 韩一凡
k中国林业科学研究院林业研究所 北京 tsss|tl
汪迎春 李文彬
k中国科学院遗传研究所 北京 tsststl
摘 要 }取在 tru  ≥ n ‘„„s1su °ªr培养基中发育 w ∗ y周的欧洲黑杨转 …·基因植株 tx2±2t|u试管苗幼
叶 o在  ≥ n …„s1u °ªrn ‘„„s1su °ªr培养基中培养 ty«o分别用基因枪法和叶盘法转化 × „u|2…¤µ±¤¶¨
嵌合基因 o其 …¤µ±¤¶¨ 基因的转化率依次为 ty1t h和 uv h o再生株数分别为 tzxrtu和 ztrts ∀试验表明 o选
择发育适宜的叶片 o利于目的基因转化后的植株再生 ∀进一步用 ≥⁄≥法提取转基因植株总 ⁄‘„ o经 °≤ • 检
测表明 }转化植株基因组中扩增出的 ⁄‘„片段与 …¤µ±¤¶¨ 基因的大小一致 ~≥²∏·«¨µ± …¯ ²·分析出转化后的欧
洲黑杨基因组中携有 …¤µ±¤¶¨ 基因片段 o进行 ⁄²·…¯²·检测 o转化植株有一明显的杂交斑 o并证实为阳性转化
植株 o并通过试管培养 o结合林木常规育种方法 o获得了转 …¤µ±¤¶¨ 基因的抗虫欧洲黑杨转基因植株 ∀
关键词 }抗虫转基因欧洲黑杨 o…¤µ±¤¶¨ 基因 o雄性不育 o苏云金杆菌的晶体毒蛋白k…·l基因 o花粉污染
收稿日期 }t||{2sw2tv ∀
基金项目 }国家自然科学基金资助项目 ∀
3 中国科学院遗传研究所孙勇如同志参加本文的工作 ∀
Α ΣΤΥ∆Ψ ΟΝ ΤΗΕ ΙΝΤΡ Ο∆ΥΧΤΙΟΝ ΟΦ ΜΑΛΕ ΣΤΕΡΙΛΙΤΨ ΟΦ
ΑΝΤΙΙΝΣΕΧΤ ΤΡ ΑΝΣΓΕΝΙΧ Ποπυλυσ νιγρα ΒΨ ΤΑu|2ΒΑΡ ΝΑΣΕ ΓΕΝΕ
¬¬±ª ±¬¬º¤±ª ‹¤± ≠¬©¤±
( Τηε Ρεσεαρχη Ινστιτυτε οφ Φορεστρψ, ΧΑΦ Βειϕινγtsss|t)
• ¤±ª ≠¬±ª¦«∏± ¬• ±¨¥¬±
( Τηε Ινστιτυτε οφ Γενετιχσ, ΧΑΣ Βειϕινγtsstst)
Αβστραχτ :≤«¬°¤¨µ¬¦×„u|2…¤µ±¤¶¨ ª¨ ±¨ º¤¶¬±·µ²§∏¦¨§¬±·²¤±·¬2¬±¶¨¦··µ¤±¶ª¨±¬¦Ποπυλυσ νιγρᲩª²²§ ∏´¤¯¬·¼¤±§«¬ª«
¼¬¨¯ §¥¼ „ªµ²¥¤¦·¨µ¬∏°·∏° ©¨¤¦¬¨±¶k„ q·l¤±§¥¬²¯¬¶·¬¦¶·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±©µ²°·¨±§¨µ¯ ¤¨√¨ ¶²©tx2±2t|u·∏¥¨2³¯¤±·¯¨·¶oº«¬¦«
ªµ²º¬±ª¤··«¨ °¨ §¬∏° tru ≥ n ‘„„s1u °ªr©²µw ∗ y º¨¨®¶o·«¨ ¯¨¤√¨ ¶º¤¶¦∏¯·∏µ¨§ º¬·« ≥ n …„s1u °ªrn
‘„„s1su °ªr¤¥²∏·ty «²∏µ¶q׫¨ ·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±©µ¨ ∏´¨±¦¼²©…¤µ±¤¶¨ ª¨ ±¨ ¥¼¥¬²¯¬¶·¬¦¶¤±§„ q·º¤¶ty1t ³¨µ¦¨±·¤±§
uv ³¨µ¦¨±·µ¨¶³¨¦·¬√¨ ¼¯o·«¨ ±∏°¥¨µ²© µ¨³µ²³¤ª¤·¬²± ³¯¤±·¯¨·¶ º µ¨¨ tzxrtu ¤±§ztrts µ¨¶³¨¦·¬√¨ ¼¯q ׫¨ ¬¨³¨µ¬° ±¨·
¶«²º §¨·«¤·o·«¨ ¶∏¬·¤¥¯¨§¨√¨ ²¯³¬±ª¯¨¤√¨ ¶º µ¨¨ ¶¨¯¨¦·¨§o º«¬¦« º¤¶ª²²§©²µ³¯¤±·¯¨·¶µ¨ª¨ ±¨ µ¤·¬²± ¤©·¨µ…¤µ±¤¶¨ ª¨ ±¨
·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±qƒ∏µ·«¨µ°²µ¨ o º¨ ¬¨·µ¤¦·¨§·«¨ ·²·¤¯ ⁄‘„ ©µ²° ·µ¤±¶ª¨±¬¦³¯¤±·¶¥¼ ≥⁄≥ °¨ ·«²§q ׫¨ °≤• ¤±¤¯¼¶¬¶
¶«²º §¨·«¤·o·«¨ ⁄‘„ ©µ¤ª°¨ ±·©µ²°·µ¤±ª¨±¬¦ª¨±²°¨ º¤¶¤°³¯¬©¬¨§ º µ¨¨ ¦²°³¯ ·¨¯¨¼¬§¨±·¬¦¤¯ º¬·«·«¨ …¤µ±¤¶¨ ª¨ ±¨ ~
≥²∏·«¨µ± …¯²·¤±¤¯¼¶¬¶¶«²º §¨·«¤··«¨ ·µ¤±¶ª¨±¬¦³¯¤±·¶ª¨±²°¨¦¤µµ¼¤¥²∏·º¬·«…¤µ±¤¶¨ ª¨ ±¨ ©µ¤ª° ±¨·~⁄²·…¯²·¤±¤¯¼¶¬¶
¶«²º §¨·«¤··«¨ ·µ¤±¶ª¨±¬¦³¯¤±·¶³¤¶¶¨¶¤¦µ²¶¶2¶³²·¦¯¨ ¤µ¯¼o¤±§¬·º¤¶³²¶¬·¬√¨ ·µ¤±¶©²µ° §¨³¯¤±·¶©∏µ·«¨µq׫¨ ·µ¤±¶2…¤µ2
±¤¶¨ª¨±¬¦³¯¤±·¶²©¤±·¬2¬±¶¨¦·Ποπυλυσ νιγρα º µ¨¨ ²¥·¤¬±¨ §¥¼ ·«¨ ·¬¶¶∏¨ ¦∏¯·∏µ¨ ¤±§·«¨ °¨ ·«²§¶²© ±²µ°¤¯ ©²µ¨¶··µ¨¨
¥µ¨ §¨¬±ªq
Κεψ ωορεδσ: ׫¨ ¤±·¬2¬±¶¨¦··µ¤±¶ª¨ ±¬¦Ποπυλυσ νιγρα , …¤µ±¤¶¨ ª¨ ±¨ o  ¤¯¨¶·¨µ¬¯¬·¼o…¤¦¬¯¯∏¶·«∏µ¬±ª¬¨±¶¬¶¬±¶¨¦2
·¬¦¬§¤¯ ¦µ¼¶·¤¯ ³µ²·¨¬±k…q·lª¨ ±¨ o°²¯¯¨ ± ³²¯ ∏¯·¬²±
经多年的努力 o我们把苏云金杆菌的晶体毒蛋白k…·l基因转化入杨树 o获得了抗虫的转基因欧洲
黑杨k田颖川等 ot||vl o并表现出明显的杀虫效果 ∀但随之而来的是考虑到带有 …·基因花粉的广泛传
播必然会导致外源基因的扩散 o虽然尚不知外源基因扩散对林木群体及周围个体会产生何种后果 o可
是转基因植株花粉显然会对周围环境造成一定程度的污染 ∀为此 o我们仍从基因工程角度出发 o设计
一个花期特异性表达 o且能导致花粉败育的基因 o再转入抗虫转基因欧洲黑杨 o从而从根本上消除转基
因花粉污染环境的可能 ∀
从有关植物生理学和细胞学研究中发现 o花粉绒毡层发育异常可使花粉不能正常发育下去 o绒毡
层是花药组织中花粉发育的周壁层 o在花粉发育中起营养作用 o发育所需的物质必须通过绒毡层运输
及合成 o且绒毡层中产生的胼胝质酶可以降解小孢子的胼胝质壁 o该酶表达的时机对花粉的正常发育
十分重要 o绒毡层发育异常会导致花粉败育 ∀ Š²¯§¥¨µª等发现 × „u|基因是烟草花粉绒毡层高度特异
表达的基因k≥ ∏¨µ¬¦® ετ αλ. , t||sl o用 × „u|基因启动子k³× „u|l与 …¤µ±¤¶¨ 基因构成 ³× „u|2…¤µ±¤¶¨
嵌合基因 o转化植株获得人工雄性不育系 o可用于植物杂交育种 ∀t||s年和 t||u年 ¤µ¬¤±¬等首先证
明该嵌合基因在烟草和油菜中表现高度花药特异表达 o并获得了雄性不育系k ¤µ¬¤±¬ετ αλ. , t||ul o
t||v年比利时学者 • ¼¨±¤¨µ·¶„ q等用同样方法在花椰菜k≤¤∏¯¬©¯²º µ¨l !• ¬·¯²²© ≤«¬¦²µ¼k比利时种植的
一种蔬菜l !莴苣k Λαχτυχα Σατιϖα)等作物上也都获得了雄性不育系k• ¼¨±¤¨µ·¶ ετ αλ. , t||vl ∀后来 o在
白菜和棉花上也取得了成功k¨¨°¤±¶ ετ αλ. , t||tl ∀而该基因在林木方面的应用 o尤其是以林木基因
工程植株为受体的研究尚未见成功的报道 ∀本课题组构建了人工雄性不育基因表达载体 o并对其进行
适当的改造 o使之更适合在林木中表达 o应用于林业生产 ∀
t 材料和方法
1 q1 材料及试剂来源
欧洲黑杨转基因植株 tx2±2t|uk田颖川等 ot||vl试管苗 o在生根培养基  ≥uktru  ≥ n ‘„„s1su
°ªrl中 o每 {周继代 t次 o取发育 w ∗ y周试管苗 !顶端下数第 v ∗ x片幼叶为试材 ~פ´ 酶购自华美生
物工程公司 o§‘×°¶为美国 °µ²° ª¨¤公司产品 ∀Α2vu°2§≤ ×°由亚辉生物工程公司提供 ∀ °µ¬° 2¨Α2Š ±¨¨
¤¥¨¯¯¬±ª≥¼¶·¨°随机引物标记探针试剂盒也为 °µ²° ª¨¤公司产品 ∀ …¤µ±¤¶¨ 基因的两端引物 }
xχ2³µ¬° µ¨}xχ2„≤ × Š≤ „ ŠŠ„ × ≤≤ „× Š Š≤ „ ≤ „Š Š× × „× ≤ „„≤ „≤ Š ×2vχ
…¤° ‹ Œ
vχ2³µ¬° µ¨}xχ2≤≤≤ ≤ × ≤ Š„Š ≤ × ≤ Š× × „× ≤ × Š„ × ≤ × × × Š ×2v„χ
≥¦¤Œ
1 q2 植物遗传转化及转化植株再生
t qu qt 基因枪法转化 幼叶在加 s1w  山梨醇的  ≥tk  ≥ n …„s1u °ªrn ‘„„s1su °ªrl培养基中
培养 ty«o用包裹质粒 ⁄‘„ 的金弹轰击 o每皿轰击 t ∗ u次 ∀金弹包裹方法 }取 xs ˏ金粉悬液kyss
°ªrl于 t1x ° ³¨³¨ ±§²µ©管中 o加入 xˏ⁄‘„ktΛªrtˏl混合 o再加入 xsˏs1u  ≤¤≤ u¯ 和 usˏ
s1t  亚精胺混合均匀 o离心去上清液 ~加 uxsˏ无水乙醇混合 o离心去上清液 ~加 ysˏ无水乙醇重
悬 ox ∗ tsˏ一枪 ∀
轰击后的叶片转到  ≥t培养基上恢复培养 x§o然后转入含有除草剂 x °ªr的  ≥t培养基中筛选
培养 ∀同时 o≤Žt试管苗叶片切出刀痕转入含有除草剂 x °ªr的  ≥t培养基中 ~≤Žu试管苗叶片切出
刀痕转入  ≥t培养基中 ∀
t qu qu 叶盘法转化 转化方法参照文献≈t  o转化后共培养 w{«加羧苄青霉素k¦¤µl ∀
t qu qv 植株再生 !扩繁及移栽 转化叶片分化出不定芽 o生长到 t ∗ u¦°时转入  ≥u 中生根培养 o同
时 o部分用于增殖 !扩繁 o生根后的转化植株试管苗合理移栽 !管理 ox月份移入苗圃 ∀
1 .3 转基因植株总 ∆ΝΑ的提取
取 ts ∗ us °ª幼嫩叶片 o置于 t1x ° ³¨³¨ ±§²µ©管中 o加入 wssˏ研磨缓冲液ktx h蔗糖 ouxs ° 
|u t期 李 玲等 }× „u|2…¤µ±¤¶¨ 基因导致抗虫转基因欧洲黑杨雄性不育的研究
表 1 基因枪和叶盘法转化系统
Ταβ .1 Τηε τρανσφορµεδ σψστεµσ οφ βιολιστιχσ ανδ Α .τ τρανσφορµ ατιον
处理
×µ¨¤·
° ±¨·
基本
培养基
…¤¶¬¦
° §¨¬∏°
生根
培养基
• ²²·¬±ª
° §¨¬∏°
基因枪转化系统
×µ¤±¶©²µ°¤·¬²± ¶¼¶·¨° ²©¥¬²¯¬¶·¬¦¶
叶盘法转化系统
×µ¤±¶©²µ°¤·¬²± ¶¼¶·¨° ²© „ q·
高渗培养基
‹¬ª«²¶°²·¬¦
³µ¨¶¶∏µ¨ ° §¨¬∏°
恢复培养基
• ¦¨²√ µ¨¨§
° §¨¬∏°
筛选培养基
≥¨¯ ¦¨·¨§ ° §¨¬∏°
再生培养基
 §¨¬∏° ²©
µ¨ª¨ ±¨ µ¤·¬²±
共培养后培养基
 §¨¬∏° ¤©·¨µ
¦²¦∏¯·∏µ¨§
t|u  ≥  ≥u  ≥t ns1w  °¤±±¬·²¯  ≥t
 ≥t n
‹ µ¨¥¬¦¬§¨ x °ªr  ≥t  ≥t n xss °ªr¦¤µ
≤Žt  ≥  ≥u  ≥t ns1w  °¤±±¬·²¯  ≥t  ≥t n ‹ µ¨¥¬¦¬§¨ x °ªr p p
≤Žu  ≥  ≥u  ≥t ns qw  °¤±±¬·²¯  ≥t  ≥t  ≥t  ≥t
‘¤≤¯oxs °  ∞⁄× „ oxs°  ×µ¬¶l研磨 o离心去上清液 ~加 wssˏ悬浮缓冲液kux°  ∞⁄× „ ouxs °  ‘¤2
≤¯os1x h ≥⁄≥ ouxs °  ×µ¬¶l o于 zs ε 下水浴 us °¬±o加入等体积酚仿抽提 o上清液加 urv体积异丙醇 o
离心 x °¬±o去上清液 ~用 zs h乙醇 wssˏ清洗两遍 o去乙醇 o空气干燥后 o样品溶于 xs ∗ tssˏ×∞kts
°  ×µ¬¶os1t °  ∞⁄× „l中 ∀
1 .4 ΠΧΡ 法检测转基因植株
按如下反应体系进行 °≤ • 反应 ∀
表 2 ΠΧΡ 法检测反应体系
Ταβ .2 Τηε ρεαχτιον σψστεµ οφ ΠΧΡ αναλψσισ kˏl
°¤··¨µ± ⁄‘„
„uss±ªrˏ
ts ≅ …∏©©¨µ °µ¬° µ¨ŒtΛªrˏ
°µ¬°¨ŒŒ
t˪rˏ
§‘×°¶
¤¨¦«u ° 
פ´ ∞±½¼°¨
v˜rˏ
§§ ‹u’
t u t t u s qw tu qy
用于扩增 °≤ • 反应程序为 }|w ε 预变性 w °¬±o然后 |w ε 变性 t °¬±oxx ε 退火 t °¬±ozu ε 下延伸 u
°¬±o共 vs个循环 ~最后在 zu ε 下延伸 { °¬±∀
1 .5 Σουτηερν Βλοτ检测转基因植株
探针的标记 }从携有 …¤µ±¤¶¨ 基因的质粒上切下 …¤µ±¤¶¨ 基因片段 o电泳回收 o以此为模板 o采用寡
聚核苷酸随机引物延伸法k°µ¬° µ¨2Α2Š ±¨¨ q¤¥¨¯¯¬±ª ≥¼¶·¨° o°µ²° ª¨¤l o用 Α2vu°2§≤ ×°制备放射性探
针 o按5分子克隆6上之方法进行 ≥²∏·«¨µ± …¯ ²·反应 !分析 ∀
1 .6 ∆οτ Βλοτ检测转基因植株
将植物总 ⁄‘„直接点到尼龙膜上 ovs ε 烘干 o用 Α2vu°2§≤ ×°标记的探针进行杂交 o并于 p zs ε 下
放射自显影 v§∀
u 实验结果
2 .1 Βαρνασε转基因杨树的获得
通过基因枪法遗传转化 o获得转 …¤µ±¤¶¨ 基因欧洲黑杨转基因植株 o见表 v ∀研究发现 }基因枪对转
化受体有一定要求 o过于幼嫩叶片 o轰击后 o损伤严重 o失去再生能力 ~而老叶片转化后再生不易 o故选
择合适发育状况叶片至关重要 ∀此外 o叶片被金弹轰击后 o叶片表面有均匀弹孔 o经短期培养后 o弹孔
处分化出大量芽点 o很快发育成不定芽 o而 ≤Žu未被轰击 o只是用刀划痕 o其不定芽明显少于轰击叶片 o
≤Žt不耐除草剂而被其杀死k表 vl ∀
表 3 转基因欧洲黑杨的遗传转化
Ταβ .3 Τηε γενετιχ τρανσφορµ ατιον οφ τρανσγενιχ Ποπυλυσ νιγρα
处理
×µ¨¤·° ±¨·
接种转化叶数
‘²q²©¬±²¦∏¯¤·¬²± ¯¨ ¤√ ¶¨
分化芽点叶片数
‘²q²©§¬©©¨ µ¨±·¬¤·¬²±
不定芽形成数r叶数
‘²q²©¤§√ ±¨·¬·¬²∏¶¥∏§¶r‘²q²©¯¨ ¤√ ¶¨
t|u tu tu tzxrtu
≤Žt y y s
≤Žu y y vsry
sv 林 业 科 学 vy卷
2 .2 ΠΧΡ 检测分析
转化植株的 °≤ • 分析见图 t ∀如图 t所示 ovw{ !vw| !vxs !vxx号转化植株的基因组都扩增出一条
大小在 vxs¥³的 ⁄‘„片段 o和 …¤µ±¤¶¨ 基因的大小一致 ∀结果见表 w ∀
由表 w可见 o基因枪法得到的 tvs株转化株 o经 °≤ • 分析有 ut株呈阳性 o转化频率为 ty1t h o叶
盘法得到的 vx株转化植株 o经 °≤ • 分析有 {株呈阳性 o转化频率为 uv h ∀
表 4 不同方法遗传转化结果分析
Ταβ .4 Τηε γενετιχ τρανσφορµ ατιον ρεσυλτσ βψ διφφερεντ µετηοδσ
方法
 ·¨«²§¶
转化叶片数
‘²q²©·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±
¯¨ ¤√ ¶¨
再生株数
‘²q²©µ¨ª¨ ±¨ µ¤·¬²±
³¯¤±·¶
°≤ • 检测数
‘²q²© °≤ •
¤±¤¯¼¶¬¶
呈阳性数
‘²q²©³²¶¬·¬√¨
µ¨¤¦·¬²±
转化率
×µ¤±¶©²µ° §¨
©µ¨ ∏´¨ ±¦¼k h l
基因枪法
…¬²¯¬¶·¬¦¶·µ¤±¶©²µ°¤·¬²± tu tzx tvs ut ty qt
叶盘法
„ q·
·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±
ts zt vx { uv
2 .3 Σουτηερν Βλοτ分析
转化株的 ≥²∏·«¨µ± …¯ ²·分析见图 u ∀如图 u所示 o第 vw|号转化植株有一条明显的杂交带 o表明第
vw|号杨树的基因组中携有 …¤µ±¤¶¨ 基因片段 o可以确定为阳性转化植株 ∀
图 t °≤ • 反应结果
ƒ¬ªqt × «¨ µ¨¤¦·¬²± µ¨¶∏¯·¶²© °≤ •
 t ! u }⁄‘„分子量 ⁄‘„ °¤µ®¨ µ~vss }负对照 ≤Ž~
° }载体质粒为模板的对照 ≤Ž²© ³¯¤¶°¬§q
图 u ≥²∏·«¨µ± …¯ ²·检测结果
ƒ¬ªqu × «¨ µ¨¶∏¯·²© ≥²∏·«¨µ± …¯ ²·¤±¤¯¼¶¬¶
¤¯±¨ t }携有 …¤µ±¤¶¨ 基因的质粒 ≥²∏·«¨µ± …¯²· ¤±¨ t }
׫¨ ≥²∏·«¨µ± …¯²·¤±¤¯¼¶¬¶²©¦¤µµ¼ …¤µ±¤¶¨ Š ±¨¨ ³¯¤¶°¬§~
¤¯±¨ u ovss o¯¤±¨ v }vw{ 植株基因组的 ≥²∏·«¨µ± …¯ ²·
¤±¨ u o¯¤±¨ v }׫¨ ≥²∏·«¨µ± …¯ ²·¤±¤¯¼¶¬¶²© vss ovw{
ª¨ ±²°¨~¯¤±¨ w }vw|植株基因组的 ≥²∏·«¨µ± …¯²· ¤±¨
w }× «¨ ≥²∏·«¨µ± …¯ ²·¤±¤¯¼¶¬¶²©vw| ª¨ ±²°¨q

图 v vw|植株基因组的 ⁄²·…¯²·结果
ƒ¬ªqv ׫¨ µ¨¶∏¯·²© ⁄²·…¯²·¤±¤¯¼¶¬¶¬± vw| ª¨±²°¨
2 .4 ∆οτ Βλοτ分析
转化植株的 ⁄²·…¯²·分析见图 v ∀如图 v所示 o第
vw|号转化植株有一明显的杂交斑 o从而可以进一步证
实第 vw|号为阳性转化植株 ∀
v 讨论
在现代基因工程育种技术中 o通过转 …¤µ±¤¶¨ 基因 o
在花药特异性表达 • ‘„ 酶基因导致花粉败育 o创造植
物雄性不育 o主要用于农作物杂种优势的利用 o而关于
tv t期 李 玲等 }× „u|2…¤µ±¤¶¨ 基因导致抗虫转基因欧洲黑杨雄性不育的研究
…¤µ±¤¶¨ 基因在林木上的遗传转化研究极少 o尤其是利用转化 …·基因欧洲黑杨工程植株为受体转化雄
性不育基因 o导致转基因植株花粉不育 o使转基因植株开花时 o不必顾虑带有 …·基因花粉的传播会导
致外源基因的扩散 o从而消除人们对林木转基因植株花粉污染环境的忧虑 ∀本课题的成功研究 o使林
木转基因植株能够安全地 !广泛地应用于生产 o不产生任何负作用 o并能带来巨大的效益 ∀
在林木遗传转化过程中 o除合理选择适当的发育试材外 o遗传操作技术和方法也是至关重要的 ∀
研究发现 o被基因枪轰击后的叶片 o叶面上弹孔伤口处 o容易分化不定芽 o再生完整植株 ~而将叶片用刀
划痕 o也能有不定芽点发生 o但明显少于轰击叶片 o未划伤叶片 o几乎未见不定芽点出现 o可能是划伤叶
片处易发生少量愈伤组织 o在合适培养条件下 o诱导分化出不定芽 o从而提高了转化频率 o利于目的基
因成功地转化 ∀研究表明 o如果用基因枪法将不带质粒的 ⁄‘„ 空弹轰击叶片 o然后 o用叶盘法转化该
叶片 o即将两种方法结合起来 o可大大提高转化频率 ∀此外 o也可用此法对植物各种器官进行轰击 o如
胚 !叶柄 !茎 !愈伤细胞团等组织 o以提高转化受体的再生能力 o该方法我们正应用于杨树茎尖 !冬芽的
遗传转化中 ∀
杨树转 …¤µ±¤¶¨ 基因转化植株分子鉴定的 °≤ • 法 !≥²∏·«¨µ± …¯ ²·法和 ⁄²·…¯²·法 v种方法检测结
果表明 }°≤ • 方法可以用来初步检测转化植株 o该法快速简单 o并可避免操作对人体有害的药品 o但有
较多的假阳性 ~用 ≥²∏·«¨µ± …¯ ²·法和 ⁄²·…¯²·法可以准确地检测阳性转化植株 ∀相对而言 o⁄²·…¯²·更
为简单快速 o但不能检测出目的基因片段的大小 o而 ≥²∏·«¨µ± …¯ ²·法不但可以测出目的基因的大小 o而
且可以准确地测出目的基因在宿主基因组中的插入位点数 ∀
花粉发育是一个极其复杂的过程 o许多基因与花粉发育有关 o× „u|是花药绒毡层特异表达的启动
子 o¤µ¬¤±¬等将分离到的 …¤µ±¤¶¨ 基因与 × „u|启动子融合转化烟草发现 o|u h转化 ³× „u|2…¤µ±¤¶¨ 基
因的植株ktsyrttxl不能产生花粉 o通过花粉切片比较 o不能产生花粉的转基因植株 o其花药皱缩 o颜色
灰暗 o见不到花粉粒 o这些植株不能长出果实和种子 o但如果用未转化的正常植株的花粉授粉 o又能正
常结实 ∀分析表明 o是因为 …¤µ±¤¶¨ 在花药特异表达 o破坏了花药绒毡层 o使花粉不能正常发育 o导致雄
性不育 ∀从理论上讲 o转 …¤µ±¤¶¨ 基因工程植株产生的花粉 o可不必顾虑其基因的扩散 o但在生产实际
中 o还需要结合林木常规育种方法 o进一步研究转基因植株的育性 !生长发育等诸多实际问题 o使基因
工程植株能安全 !稳定 !高效地推广于生产 o造福于人类 ∀
参 考 文 献
曹光诚 o孙勇如 o陈占宽等 q人工雄性不育基因和恢复基因的克隆及构建研究 q中国农业科学 ot||y ou|kvl }us ∗ uy
丁#萨姆布鲁克等 q分子克隆 qk第二版l q北京 }科学出版社 ot||u
傅荣昭 o孙勇如 o贾士荣主编 q植物遗传转化技术手册 q北京 }中国科学技术出版社 ot||w
彭仁旺 o周雪荣 o方荣祥等 q转基因雄性不育油菜选育的简介 q遗传学报 ot||y ouvktl }{w
田颖川 o韩一凡等 q抗虫转基因欧洲黑杨的培育 q生物工程学报 ot||v o|kwl
¨¨°¤±¶ ετ αλ. ƒµ²ªµ¨¶¶¬± ±¨ª¬±¨ µ¨¬±ª ª¨ ±¨ ©²µ©¨µ·¬¯¬·¼ ¦²±·µ²¯ q °µ²ªµ¤° ¤±§ „¥¶·µ¤¦·¶qŒ≥°  … ׫¬µ§Œ±·¨µ±¤·¬²±¤¯ ≤²±ªµ¨¶¶q ×∏¦¶²±o
˜≥„ ot||t }y ∗ tt
¤µ¬¤±¬≤ ετ αλ. Œ±§∏¦·¬²± ²© °¤¯ ¶¨·¨µ¬¯¬·¼¬± ³¯¤±·¶¥¼ ¤¦«¬°¤¨µ¬¨µ¬¦µ¬¥²±∏¬¨¤¶¨ ª¨ ±¨ q ‘¤·∏µ¨ ot||s ovwzkuxl }zvz ∗ zwt
¤µ¬¤±¬≤ ετ αλ. „ ¦«°¤¨µ¬¦µ¬¥²±∏¦¬¨¤¶¨2¬±«¬¥¬·²µª¨ ±¨ µ¨¶·²µ¨ ©¨ µ·¬¯¬·¼·² °¤¯¨¶·¨µ¬¯¨ ³¯¤±·¶q‘¤·∏µ¨ ot||u ovxzkwl }v{w ∗ v{z
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∗ tv|
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uv 林 业 科 学 vy卷