全 文 ：Vol. 29 , No. 4
pp. 615～620 　July , 2003
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 29 卷 第 4 期
2003 年 7 月 　615～620 页
根癌农杆菌介导 TA292Barnase 基因转化甘蓝型油菜的研究
何业华1 ,2 　熊兴华1 　官春云1 ,3 , 3 　李　　3 　林良斌1 　陈社员3 　刘忠松3
李文彬4 　钟　军1 　刘春林1 　周小云1
(1 作物基因工程湖南省重点实验室 ,湖南长沙 410128 ;2 华南农业大学园艺学院 ,广东广州 510640 ; 3 湖南农业大学油料作物研究所 ,湖南长沙
410128 ;4 中国科学院遗传研究所 ,北京 100101)
摘 　要 　经比较影响农杆菌介导 Barnase 嵌合基因转化甘蓝型油菜的各种因素后 ,建立了高效稳定的转基因实验体系。
按该体系 ,甘蓝型油菜“湘油 15”子叶柄预培养 20 h ,OD600为 015 农杆菌菌液感染后共培养 3 d ,在 MS + 2 mg·L - 1 AgNO3 +
415 mg·L - 1BA + 10 mg·L - 1 Km + 300 mg·L - 1 Carb 培养基上进行选择 ,转化率为 818 % ,PCR检测和 Southern 杂交检测证明
外源基因已整合了甘蓝型油菜基因组中。Ξ
关键词 　甘蓝型油菜 ; Barnase 基因 ;雄性不育 ;转基因植株
中图分类号 : S565 　　　文献标识码 : A
The pTA292Barnase Chimeric Gene Transformation of Brassica napus Mediated by
Agrobacterium
HE Ye2Hua1 ,2 　XIONG Xing2Hua1 　GUAN Chun2Yun1 ,3 , 3 　LI Xun3 　LIN Liang2Bin1 　CHEN She2Yuan3 　LIU
Zhong2Song3 　LI Wen2Bin4 　ZHONGJun1 　LIU Chun2Lin1 　ZHOU Xiao2Yun1
(1 Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province , Hunan Agricultural University , Changsha , Hunan 410128 ;2 College of Horticulture , South China Agri2
cultural University , Guangzhou , Guangdong 510642 ;3 Oilseed Crops Institute , Hunan Agricultural University , Changsha , Hunan 410128 ;4 Institute of Genetics , Chi2
nese A cademy of Sciences , Beijing 100101 , China)
Abstract 　　Barnase chimeric gene was transferred into Brassica by a highly efficient Agrobacterium mediated system de2
veloped in this study after studying the transformation factors influencing. In this protocol ,cotyledon petioles of Brassica na2
pus cv. Xiangyou 15 were pre2cultured for 20 h and infected by Agrobacterium tumefaciens with a 0. 5 value of the OD600 .
After 3 d for co2culture the tissues were transferred by different ways. The results showed that when the tissues were pre2se2
lected on MS medium with 2 mg·L - 1 AgNO3 ,4. 5 mg·L - 1 BA ,10 mg·L - 1 Km and 300 mg·L - 1 Carb ,the transformation
efficiency was 8. 8 %. PCR analysis and Southern blot of the transgenic plants indicated that the foreign genes had been in2
tegrated into Brassica napus cv. Xiangyou 15.
Key words 　　Brassica napus ; Barnase ;Male sterility ;Transgenic
　　油菜杂种优势利用一直受到各油菜生产国的高
度重视[1 ] 。油菜杂种优势利用的途径一般是利用胞
质不育、化学杀雄、核不育和自交不亲和等 ,但其育
种时间太长或育性不稳定或纯度低等因素影响了油
菜杂种优势的利用。因而 ,利用基因工程技术寻找
新的雄性不育材料和建立新的制种体系势在必行。
TA29 基因是烟草花药绒毡层高度特异表达基因[2 ] 。
用 TA29 基因的启动子与 Barnase 基因融合构建了Ξ基金项目 :湖南省科技厅课题资助项目之一 (97J KY1005) 。
作者简介 :何业华 (1960 - ) ,男 ,湖南人 ,教授 ,博士。研究方向 :植物基因工程。并列第一作者 :熊兴华 (1967 - ) ,男 ,湖南人 ,助理研究员 ,
博士生。研究方向 :植物分子遗传学及基因工程。　3 通讯作者 :官春云 (1938 - ) ,男 ,教授 ,博导 ,中国工程院院士 ,主要从事
油菜生物技术育种。Tel :86273124618778 ;Fax :86273124618778 ; E2mail :ndguan @public. cs. hn. cn
Received(收稿日期) :2001209226 ;Accepted(接受日期) :2002211229.

TA292Barnase 嵌合基因转化植物 ,可以获得人工雄
性不育系并应用于杂交育种工作。1990 年和 1992
年 ,Mariani 获得烟草和油菜雄性不育系与恢复
系[3 ] 。此后 ,一些学者相继报道了利用该基因转化
多种作物的研究 ,已分别获得了油菜[4 ,5 ] 、烟草[6 ] 、
花椰菜和莴苣[7 ] 、棉花[8 ] 、白菜[9～10 ] 、甘蓝[11 ]等的
转基因植株。虽然 TA292Barnase 嵌合基因转化油
菜获得了雄性不育植株 ,但研究者都是以油菜作为
一种受体材料来研究 TA292Barnase 嵌合基因的转
化 ,所获得的雄性不育材料在生产中的应用受到限
制。另一方面 ,有报道表明 ,由 TA292Barnase 嵌合
基因转化所得的雄性不育植株在较高温度下会发生
育性恢复现象[12 ] 。本研究利用能克服温度敏感性
的花药特异嵌合启动子 antherbox2CaMV35S2TA29 调 控 Barnase 基因 ,使我们育成的杂种优势强、双低优质的甘蓝型油菜品种“湘油 15”,通过农杆菌介导转化 ,获得了转基因雄性不育甘蓝型油菜。1 　材料与方法111 　实验材料　　供试的双低优质的甘蓝型油菜品种 ( Brassicanapus L. )“湘油 15”,由湖南农业大学油料作物研究所育成。含有 antherbox2CaMV35S2TA29 嵌合基因的质粒 (如下图) 以及根癌农杆菌 ( Agrobacterium tume2f aciens) LBA4404 由中国科学院遗传研究所李文彬、孙勇如先生提供。PCR 引物由上海生工生物工程公司合成。
图 1 不育基因表达载体 pBarnase 结构图
Fig. 1 Structure of the sterility gene expressive vector pBarnase
112 　实验方法
11211 　油菜的遗传转化
“湘油 15”种子按常规消毒后 ,接种于 MS 培养
基 ,24 ℃下暗培养 3 d ,光培养 2 d (光照时间 16 h·
d - 1 ,光照强度 2000 lx) ,在生长良好的无菌苗上切
取具有叶片的子叶柄 ,在MS + 2 mg·L - 1 AgNO3 + 415
mg·L - 1 BA 琼脂培养基上预培养。
将带有 TA292Barnase 嵌合基 因 的 农 杆 菌
LBA4404 于 YEB 培养基中培养 ,并稀释到 OD600为
015 左右。
将经过预培养的子叶柄放入盛有 10 mL 农杆菌
菌液的培养皿中浸染。用无菌滤纸迅速吸干外植体
上多余的菌液 ,将子叶柄朝下放在共培养基 (MS + 2
mg·L - 1 AgNO3 + 415 mg·L - 1 BA) 上 ,28 ℃黑暗中共
培养。无菌水冲洗去外植体表面的农杆菌 ,并以无
菌滤纸迅速吸干。再将子叶柄朝下插入选择分化培
养基 (MS + 2 mg·L - 1 AgNO3 + 415 mg·L - 1 BA + 10 mg
·L - 1 Km + 300 mg·L - 1 Carb) 上进行培养基 (温度
24 ℃、光照时间 16 h·d - 1 ,光照强度 2000 lx) ,以进行
不定芽分化培养和转化体筛选。3 周后 ,将抗卡那
霉素的绿色不定芽切下 ,转入选择生根培养基 (MS
+ 2 mg·L - 1AgNO3 + 011 mg·L - 1 BA + 15 mg·L - 1 Km
+ 200 mg·L - 1 Carb 琼脂培养基) 上进行不定根诱导
和继续选择培养 3～4 周后 ,即可进行驯化移栽。每
处理 20 个外植体 ,设 4 个重复。
11212 　油菜总 DNA 的提取及其纯化
油菜总 DNA 的提取及其纯化主要参照刘春
林[13 ]等的方法进行。
11213 　转基因油菜的 PCR 检测
以抗 Km 阳性植株总 DNA 为模板 ,进行 PCR 扩
增 ,引物为 :
5′端引物 　5′2ACT GCA GGA TCC ATG GCA
CAG GTT ATC AAC ACG T23′
3′端引物 　5′2CCC CTC GAG CTC GTT ATC TGA
TCT TTG TA23′
PCR 反应条件为 :94 ℃预变性 3 min ,92 ℃变性
30 s ,55 ℃退火 30 s ,72 ℃延伸 1 min 40 s ,共 40 个循
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环 ,最后在 72 ℃延伸 5 min。反应结束后 ,取 10μL
反应液进行 1 %琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物。
11214 　转基因油菜 Southern 检测
1121411 　转膜 　　采用 Bib2Rad Model 285 vacuum
blotter system于 5 inches Hg 压力下转膜 50 min。
1121412 　杂交 　　采用 South2North direct HRP label2
ing and detecting Kit 进行。
11215 　转基因油菜的不育性状分析
1121511 　KI2I2 染色法 　　从当天绽开花朵中取出
雄蕊于载玻片上 ,滴 1 滴蒸馏水 ,用尖镊子将花药撕
破 ,再滴 1 滴 1 %KI2I2 溶液 ,并使花粉均匀地分布其
中 ,覆上盖玻片 ,在显微镜下观察着色情况。有育性
的花粉呈蓝色 ,无育性的花粉不着色。
1121512 　甲烯蓝 (methyleneblue) 染色法 　　从当天
绽开花朵中取出雄蕊于载玻片上 ,滴 1 滴蒸馏水 ,用
尖镊子将花药撕破 ,再滴 1 滴甲烯蓝溶液 (0116 g·
L - 1) ,并使花粉均匀地分布其中 ,静止 3～5 min ,覆
上盖玻片 ,在显微镜下观察着色情况。有生活力的
花粉不着色 ,无生活力的花粉被染成蓝色或蓝绿
色。　　　
1121513 　花粉发芽试验 　　于油菜初花期至盛花 ,
选在最高气温 25 ℃左右的晴天摘取花序 ,在室内取
当天开放花朵中的花药 ,放入滴有发芽培养液 (30 %
蔗糖 + 120 mg·L - 1硼酸 + 50 mg·L - 1 IAA + 30 mg·
L - 1 GA3)的载玻片上 ,用镊子轻轻地捣破花药 ,使花
粉均匀地释放于培养液中。将载玻片置于底部铺有
湿滤纸的培养皿中 ,然后将培养皿放在 20 ℃光照培
养箱中培养 5 h。取出载玻片进行镜检 ,每载玻片观
测 5 个视野 ,每个视野中花粉粒不少于 50 粒 ,计算
其平均萌发率。
2 　结果与分析
211 　“湘油 15”子叶柄对卡那霉素的敏感性
　　处理后的分化情况见表 1 ,10 mg/ L 卡那霉素浓
度绿芽的分化频率为 0。卡那霉素浓度过高会抑制
不定芽的分化频率。故本实验使用 10 mg/ L 卡那霉
素即可起到淘汰非转化体的作用。
212 　外植体预培养时间对转化效果的影响
将从无菌苗上切取的子叶柄进行预培养后再
用农杆菌菌液浸染 ,其转化频率能显著提高 (见
表 2) 。　　　
表 1 “湘油 15”子叶柄对卡那霉素的敏感性
Table 1 The sensitivity of“Xiangyou 15”cotyledon
petiole to Km
卡那霉素浓度
Conc. Km
(mg/ ·L)
不定芽分
化频率
Freq. albinisttic
bud differention
( %)
白化芽分
化频率
Freq. blue
adventitious bud
( %)
绿芽分
化频率
Freq. adventitious
adventitious bud
( %)
0 100 0 100
215 100 23187 76113
510 100 88175 11125
715 100 9818 112
1010 100 100 0
1510 55175 100 0
2010 40163 100 0
表 2 不同预培养时间对转化效果的影响
Table 2 The effect of pre2cultivation time on the frequence
of the transformation
预培时间
Pre2cultivation time (h) 不定芽分化频率Freq. adventitious
bud differention( %)
转化频率
Freq. transformation( %)
0 100 113
5 100 216
10 100 515
15 100 612
20 100 615
25 100 519
30 100 511
40 100 412
50 100 112
60 100 018
72 100 012
96 100 0
120 100 0
　　子叶柄未进行预培养时 ,转化频率为 113 %。
经预培养后 ,子叶柄切口处细胞处于分裂状态 ,使之
更容易整合外源 DNA ,起初随着预培养时间的延
长 ,转化频率也不断上升 ,在 15 h 和 20 h 时转化频
率达到最高 ,分别为 612 %和 613 % ;随后 ,预培养时
间再增加 ,转化频率又开始缓慢下降 ,超过 40 h 转
化频率下降更加迅速 ,72 h 后转化频率又接近为 0 ,
镜检发现此时已出现不定芽突起 ,从而导致外源
DNA 难以整合。最佳预培养时间明显短于大白菜
的 2～3 d ,这可能由于甘蓝型油菜较大白菜容易分
化造成的。
716　4 期 何业华等 :根癌农杆菌介导 TA292Barnase 基因转化甘蓝型油菜的研究 　　　

213 　共培养时间对转化效果的影响
接种菌体后的外植体培养在不定芽分化培养基
上 ,在外植体细胞分裂、生长的同时 ,农杆菌在外植
体切口面也增殖生长。农杆菌与外植体共培养在整
个转化过程中是非常重要的环节 ,由于农杆菌附着、
DNA 的转移和整合都在这段时期内完成 ,因此共培
养技术条件的掌握是转化成功的关键之一。经 12 h
的共培养 ,外植体的转化频率为 0 ;共培养 24 h 后 ,
开始出现转化植株 ,但转化频率还很低 ;之后随着共
培养时间的延长 ,转化频率也升高 ,共培养 72 h 时
的转化频率已达 613 % ;但共培养超过 72 h 后 ,随着
共培养时间的增加 ,由于农杆菌过度增殖而给外植
体细胞毒害作用也增强 ,不定芽分化频率不断下降 ,
褐变死亡的外植体也急剧增加 ,到共培养 144 h 时 ,
全部外植体受毒害而死亡 (表 3) 。说明所用甘蓝型
油菜品种的最佳共培养时间为 72 h ,这明显短于黄
瓜 (4～6 d) 、西瓜 (4～6 d) 、亚麻 (5～7 d) 、白芥 (4～
5 d) ,长于生菜 (2 d)和花生 (2 d) 。
表 3 共培养时间对转化效果的影响
Table 3 The effect of co2cultivation time on
frequence of transformation
共培养时间
Co2cultivation
time (h)
不定芽分
化频率
Freq. adventi2
tious bud
differention( %)
转化频率
Freq. transform2
ation
( %)
子叶柄褐
变死亡率
Freq. cotyledon
petiole
death ( %)
12 100 0 0
24 100 017 0
48 100 412 0
72 100 610 0
96 9010 317 0
120 6313 115 2715
144 715 0 8816
168 0 0 100
214 　菌液浓度、浸染时间对转化的影响
使农杆菌充分附着在外植体的损伤切面是转化
成功的必要条件 ,因而适度的菌液浓度和浸染时间
尤其重要。菌液浓度越低 ,适宜的浸染时间越长 (见
表 4) 。菌液浓度 OD600为 012 时 ,子叶柄在菌液中浸
染 9 min 后转化频率仍然只有 315 % ;当菌液浓度
OD600升高至 015 时 ,子叶柄浸染的最佳时间为 5
min ,转化频率也最高 ;菌液浓度 OD600为 018 时 ,子
叶柄浸染的最佳时间为 3 min ,而在此浓度下浸泡 7
min 时 ,有 1215 %的子叶柄在共培养结束时切口处
变黑 ,这类子叶柄在分化培养基上不能再分化出不
定芽。菌液浓度 OD600达 112 时 ,不仅转化频率低 ,
而且因子叶柄不能长时间耐受这样高浓度的浸染 ,
切口更容易发生褐变 ,浸染 7 min 时褐变率已达
65 % ,且未见转化植株形成。
表 4 菌液浓度和浸染时间对转化效果的影响
Table 4 The effect of Agrobacterium concentration
and infection time on the frequency of
the transformation
菌液浓度
Conc. Agrobac2
terium (OD)
浸染时间
Time infected
(min)
转化频率
Freq. Transfor2
mation ( %)
子叶柄
切口褐变率
Freq. cotyledon
petiole
browning ( %)
012 1 018 0
012 3 114 0
012 5 215 0
012 7 312 0
012 9 315 0
015 1 210 0
015 3 416 0
015 5 613 0
015 7 613 0
015 9 510 0
018 1 412 0
018 3 610 0
018 5 312 0
018 7 116 1215
018 9 018 2718
112 1 214 713
112 3 211 1617
112 5 015 3215
112 7 0 6510
112 9 0 8313
215 　稳定转化及抗性植株的获得
从发芽培养 5 d 的“湘油 15”幼苗上带节切取子
叶柄 ,预培养 20 h ,经农杆菌 LBA4404/ pBI2TBSbar 感
染 5 min 后 ,接种在选择分化培养基上 ,约 5 d 后可
见从子叶柄切口处分化出不定芽 ,未转化的不定芽
由淡紫色很快白化 ,3 周后将抗性芽 (绿芽) 切下转
入选择生长培养基中继续筛选和生长 ,约 4 周后将
长大的抗性芽转入选择生根培养基中生根。共处理
250 个子叶柄 ,获得 22 株抗性植株 ,转化频率为
818 %。
216 　转基因植株的分子检测
21611 　PCR 检测
对卡那霉素抗性筛选植株进行 PCR 分析 ,以含
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Barnase 基因质粒为阳性对照 ,未转化植株为阴性对
照。引物为 Barnase 基因引物。其结果见图 1 ,箭头
处表示用 Barnase 基因扩增引物的 PCR 片段 ,其长
度约为 013 kb。3 个抗性植株所扩增出 PCR 片段与
Barnase 基因质粒 PCR 片段完全相同。
图 2 “湘油 15”部分转基因植株 PCR 检测结果
Fig. 2 PCR detection of some transgenic plants of“Xiangyou 15”
1. 100 bp DNA ladder ;2. Positive control ;3. Negetive control
4～6. Transformed plants
图 3 “湘油 15”部分转基因植株 Southern 检测结果
Fig. 3 Southern blot of partial transgenic plants of“Xiangyou 15”
1. Positive control ;2. Negetive control
3～5. Transformed plants
21612 　Southern 杂交检测
分别以 Bam H Ⅰ与 Sac Ⅰ消化质粒 pBarnase
DNA(阳性对照) 、未转化植株 DNA(阴性对照) 、转基
因植株 DNA。以 BamH Ⅰ与 Sac Ⅰ消化质粒 pBar2
nase 回收 013 kb , Barnase 为探针进行杂交 ,结果表
明转基因植株可出现一条与阳性对照 (约 013 kb) 大
小相同的杂交带 ,而未转基因植株则没有杂交带出
现。
217 　田间不育表现
对 98 株转基因植株进行田间观察表明 ,转基因
植株与未转化植株 (对照)在生长、株型、营养器官形
态等方面无明显的差异 ,但转基因植株的育性上可
分为 3 种类型。
第一种类型为完全不育型 (图 4) ,其雄蕊发育
不良 ,花丝变短 ,花药小而干瘪 ,且不能正常裂开 ,解
剖花药时只能偶尔见到极少量畸形花粉 ,花粉能被
甲烯蓝染色而不能被 KI2I2 染色 ,亦不能萌发 ,在套
代自交时未见结角果。属于这一类型的共有 4 株 ,
其中 1 株花瓣较白、花被短小、柱头在花被开裂前
1～2 d即从花被中伸出长达 1 mm 左右。
图 4 完全不育型植株
Fig. 4 The wholly male sterile plants
　
第二种类型为半不育型 ,共有 38 株。其雄蕊也
明显短于雌蕊 ,花药中有少量花粉 ,其中部分花粉形
态异常 ,甲烯蓝染色率在 90 %以下 , KI2I2 染色率在
10 %以上 ,花粉萌发率在 5 %以上 ,套代自交结果率
4 %～38 %。
第三种类型为可育型 ,共 56 株。其雄蕊形态与
对照无明显差异 ,花粉量多 ,但甲烯蓝染色率在 0～
30 %不等 (对照为 0) ,KI2I2 染色率在 80 %以上 (对照
为 100 %) , 花粉萌发率在 25 %～ 66 % (对照为
73 %) , 套代自交结果率 80 % ～ 100 % (对照为
100 %) 。
3 　讨论
在转化过程 ,影响转化频率提高的因素有很多 ,
每个因素都关系到基因转化的成功。在建立起甘蓝
型油菜的高频率再生系统的基础上 ,本实验通过对
外植体预培养、菌液浓度和浸泡时间、共培养时间等
进行系统探讨 ,建立起了一个较稳定、高效的 TA292
916　4 期 何业华等 :根癌农杆菌介导 TA292Barnase 基因转化甘蓝型油菜的研究 　　　

Barnase 基因转化系统。
甘蓝型油菜细胞对卡那霉素很敏感 ,低浓度 (5
mg·L - 1)的卡那霉素即可严重抑制子叶柄外植体细
胞增殖和不定芽分化 ,在 30～50 mg·L - 1卡那霉素的
培养基上 ,1 周后子叶柄切口开始褐化 ,随后死亡。
植物体的不同生长发育阶段 ,对卡那霉素的忍受能
力不同 ,“湘油 15”的子叶柄不定芽分化阶段在含 15
mg·L - 1卡那霉素的培养基上便出现了约 3 %的死亡
率 ,在 20 mg·L - 1卡那霉素的培养基上死亡率达
18 % ;子叶柄分化形成的不定芽在 20 mg·L - 1卡那霉
素的培养基上开始出现死亡植株 ,但在 215 mg·L - 1
卡那霉素的培养基上死亡率已升至 56 %左右 ;子叶
柄分化的不定芽再经 1 代培养之后 ,对卡那霉素的
忍受性更加增强 ,但在 30 mg·L - 1卡那霉素的培养
基上死亡率仍高达 76 %以上。根据甘蓝型油菜对
卡那霉素的这种忍受特性 ,在不同的培养阶段施加
的选择压力应有所区别。另外 ,选择效果也与每个
被选择物所占有的卡那霉素绝对量有直接关系。因
此 ,本研究中 ,采用前期选择时培养基中卡那霉素浓
度为 1 0mg·L - 1 ,每 50 mL 培养基接种 10 个子叶柄 ;
延迟选择或经过前期选择的不定芽继代时 ,则采用
15 mg·L - 1卡那霉素 ,每 50mL 培养基接种 4～5 个不
定芽 ;后期选择或已选择两代时 ,应采用 20 mg·L - 1
卡那霉素 ,每 50 mL 培养基接种 2 个不定芽 ,这样逐
渐加大选择压力 ,淘汰尽可能多的非转化体。
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